Was ist ein Proteom ?
Gesamtheit an Proteinen, die von einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organismus exprimiert werden kann oder exprimiert wird.
Was ist eine Proteoform ?
Einzigartige primäre AS-Sequenz eines Proteins einschließlich Modifikationen -> versch. Isoformen entstanden durch PTM (Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung…), alternatives Spleißen
Was ist Massenspektrometrie ?
Massenspektrometrie ist eine analytische Technik, die verwendet wird, um die Masse von Atomen und Molekülen in einer Probe zu bestimmen.
-> Proben werden ionisiert
-> Ionen in elektrischem/ magnetischem Feld beschleunigt und in Massenanalysator geleitet
-> Ionen aufgrund ihrer Masse-zu-Ladungs-Verhältnisse (m/z) getrennt und detektiert
Typischer Proteomics Ablauf
Zelllyse
Protein-basierte Fragmentation (optional)
Reduktion & Alkylierung
Proteolytische Verdauung
Peptide-basierte Fraktionierung (optional)
LC/MS Analyse
Wie bekommt man Proteine in ein Massenspektrometer via MALDI?
MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization):
-> Proteine - mit UV-absorbierenden Matrixsubstanz ko-kristallisiert
-> Bestrahlung mit gepulstem Laser: Matrix verdampft und kleine Ionen- und Molekülfragmente bilden sich
-> Desolvation in Hochvakuum - Befreiung von Lösungsmittelmolekülen -> einzelne geladene Ionen
Vorteile
Nachteile
Hoher Massenbereich
Nicht leicht kompatibel mit Chromatographiesystemen
Hohe Empfindlichkeit
Schlechte Quantifizierung aufgrund variabler Matrixanwendung
Einfache Spektruminterpretation
Viele störende Signale von Matrixverbindungen im niedrigen Massenbereich (typischerweise unter 700 Da)
Off-Line-Probenpräparation
Proben wiederholt zugänglich
✤
Wie bekommt man Proteine in ein Massenspektrometer via ESI?
ElectroSpray Ionisation
✤ Probe als Flüssiglösung eingeführt
✤ "Pre formed ions" (Lösungsmittel & geeigneter pH-Wert) benötigt
✤ Hochspannung an Nadelspitze erzeugt geladene Tröpfchen
✤ Tröpfchen sukzessive getrocknet -> Molekülion verbleibt
✤ Stickstoffgasfluss erforderlich um das Lösungsmittel zu verdampfen, aber Hochvakuum erforderlich für einen effizienten Ionenübertrag im Massenspektrometer
Sanfteste Ionisierungsmethode, fähig zur Erzeugung von nicht-kovalenten Komplexen in der Gasphase
Hohe Anforderungen an die Probereinheitlichkeit: Salze und Ion-Paar-Bildner wie TFA verringern die Empfindlichkeit
Komplexe Gemische verringern die Empfindlichkeit
Keine Störungen durch Matrixsubstanzen
Mehrfachladung erschwert die Spektruminterpretation
Kompatibel mit Chromatographie
Gut für die Quantifizierung geeignet
Protein Identification
Gel-aufgereinigtes Protein - Bande ausschneiden -> Waschen & Reduktion mit DTT -> Alkylierung mit IAA -> Verdauung mit Trypsin -> Peptide eluieren -> LC-MS/MS
Aufbau eines Tandem Massenspektrometer
Peptidfragmentierung durch MS
• CID (collision induced dissociation): Kollision mit inerten Gasen führt zu y-Ionen und b-Ionen.
• ETD (electron transfer dissociation): Radikalanionen werden in den Ionenstrahl injiziert und führen zu c-Ionen und z-Ionen. (Funktioniert gut für z > 2, hilfreich für lange Peptide und intakte Proteine.)
Wie können PTM in MS identifiziert werden ?
-> Modifikationen verursachen Verschiebung in Peptidmasse
-> Die PTM-Stelle durch Fragment-ionen offengelegt
Proteasen in Proteomics
Verwendung verschiedener Enzyme erhöht Abdeckung der Proteinsequenz
Was ist der Occam’s razor ?
Bevorzugung der einfachsten Hypothese, die mit den vorhandenen Beweisen übereinstimmt
-> Die minimale Anzahl von Proteinen, die alle identifizierten Peptide erklärt.
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