Albers

1. Permeabilitätsbarriere - Verhindert leakage und fungiert als Tor für den Transport von Nährstoffen in und aus der Zelle.

2. Protein Anchor - Proteinanker - Ort vieler Proteine, die am Transport, an der Bioenergetik und der Chemotaxis beteiligt sind.

3. Energiekonservierung - Ort der Erzeugung und Nutzung der Protonenmotorischen-kraft

- Kein Peptidoglycan aber meistens S-layer (Proteinschicht)

- Kein Murein, manchmal Pseudomurein (modifiziertes Peptidoglycan) NAT statt NAM

NAG -> N-Acetylglucosamin

NAT -> N-Acetyltalosaminuronsäure

NAM -> N-Acetylmuraminsäure

• Monotopische Proteine durchqueren die Zellmembran nur einmal.

• Polytopische Proteine durchqueren die Membran mehrmals

Äußere Membran - Hydrophob -> ß-Faltblatt Bsp: Porine

Innere Membran - a-Helix Bsp: LacY (2nd Transporter 12 TM-Domänen)

Methode zur Untersuchung der hydrophoben und hydrophilen Regionen eines Proteinsequenzabschnitts.

-> Vorhersage der sekundären Struktur eines Proteins basiert auf der Periodizität von hydrophoben und hydrophilen Aminosäureseitenketten in der Proteinsequenz.

- Hydrophile Schleifen weisen ähnliche AS-zusammensetzung auf wie zytoplasmatische, wasserlösliche Proteine.

- Intrazelluläre (zytoplasmatische) Schleifen sind angereichert mit positiv geladenen Aminosäuren ("positive-inside" Regel von van Heijne).

- Transmembran-Segmente (TMS) enthalten hauptsächlich hydrophobe Aminosäuren.

- Tyrosin und Tryptophan werden häufig an der hydrophoben/hydrophilen Grenzfläche der Membran gefunden.

Proteine in äußerer Membran:

Periodizität der hydrophoben und hydrophilen Seitenketten der Aminosäuren

Proteine, die ausgeschieden werden müssen, werden als Preprotein produziert:

- n-Region: N-terminale Region: positiv geladen

- h-Region: hydrophobe Region zur Einbettung in die Membran

- c-region: C-terminale Region: enthält spezifische Spaltsequenz; für bakterielle Sekretionsproteine ist die Konsenssequenz AXA

AXA-Motiv konserviert in Archaeen ähnlich wie bei Gram-positiven Bakterien (nur hydrophober)

• Insertion in die Membran

• Unlooping

• Spaltung durch Signal/Leader Peptidase in der Membran verankert

• Faltung

• Serine protease

  -> verwendet Serin-Lysin-Dyad-Mechanismus

• während Spaltung taucht aktive Stelle in die Membran ein

• Spaltung an der extrazellulären Seite der cytoplasmatischen Membran

• Bsp: LepB

• Lipoprotein signal peptid

• Proteine mit Lipobox werden durch Diacylglyceryltransferase Lgt lipidmodifiziert, bevor die SPII das Signalpeptid spaltet

• SPII = Asparaginsäure-Protease mit 2 katalytischen Asp, die sich innerhalb der Grenze der Membran befinden.

• Spaltung erfolgt an der extrazellulären Seite der cytoplasmatischen Membran.

• Asparaginsäure Peptidase

• Spaltung auf zytoplasmatischen Seite

• PilD - Bakterien

• Archaeen: FlaK spezifisch für Archaellin-Untereinheiten

  PibD mit breiter Substratspezifität

-> Prepilin Signal peptid: zwischem G & F

Phenylalanin konserviert +1 -> Methyliert bei Spaltung

Sec pathway -> Translokation von ungefalteten Proteinen

Tat pathway -> Translokation von gefalteten Proteinen

• Route des Preproteins je nach Hydrophobizität der Signalsequenz

• SRP pathway -> hydrophob - Co-translational, Membranproteine

• SecB pathway -> weniger hydrophobe Signalsequenz, Post-translational, Sekretierte Proteine

SecB - Chaperone, gram negative Bakterien, Dimere von Dimeren

SecA- ATPase, in allen Bakterien, Aktiv: Monomer

SecYEG- bestehend aus SecE, SecY & SecG

SRP- Ribonucleoprotein bindet Signalpeptid, RNA interagiert mit SRP54

• doughnutförmige Pore durch Membran, Heterotrimer: C-, N-terminale Hälfte & Plug

• Plug verhindert Transport - entstehende Polypeptid chain (mit hydrophober Signalsequenz) an TMS2/7 ->Plug verschiebt sich & Hinge region öffnet eingang für Peptid

  = Putative exit pathway

• SRP & Sec61p binden Ribosom am Protein exit Tunnel

Post-translationaler Transportweg

• Proteine im gefaltetem Zustand transportiert, Substrate oft Proteine mit Cofaktoren

• zu exportierende Proteine besitzen Tat-Signalpeptid mit Doppelarginin-Sequenzmotiv („twin arginine translocation“)

• Translokation über Protonenmotive Kraftwerk (pmf) angetrieben

Bestandteile:

TatA,TatB ,TatC membrangebunden

1) Erkennung Substrat mit Tat-Signalpeptid durch TatB & C

2) Komplex lagert sich erst nach Erkennung Signalsequenz über pmf zu Pore zusammen

3 ) Transport Substrat durch TatA Pore

4) Signalpeptid durch Signalpeptidase abgespalten

-> Tat = Twin arginine translocation

Tat sekretierte Proteine in:

- E.coli

- Streptomyces coelicolor

- Lactococcus lactis

- Halobacterium salinarum

- Sulfolobus solfataricus

• Braun’s Lipoproteine (E.coli): häufigstes E.coli Protein, Stabilisiert Zellmembranen, Mutanten hypersensibel gegenüber Toxinen, bilden Bläschen und setzen periplasmatische Proteine ins Medium frei.

  • N-Terminus mit Fettsäure und Diacylglycerol verbunden

  • C-Terminus mit DAP des Peptidoglykans verbunden

Lol = Localization of Lipoproteins

-> Sortierung Lipoproteine von innerer zur äußeren Membran.

-> LolC, LolD & LolE = ABC-Transporter

-> Lipoproteine, die für die äußere Membran bestimmt sind, werden ATP-unabhängig von LolCDE gebunden

-> ATP-Hydrolyse durch LolD wird Lipoprotein an periplasmatisches Chaperon LolA übertragen

-> LolA-Lipoprotein-Komplex überquert Periplasma & interagiert mit OM-Rezeptor LolB -> Lipoprotein an LolB übertragen & in äußere Membran eingefügt.

-> Asp an +2 Position verhindert Lol Transport = Lol avoidance

Bam = barrel assembly machine

-> Insertion von ß-Faltblättern in die äußere membran

-> BAM bis zu 5 polypeptide transport-associated (POTRA) Domänen die OMPs binden -> Insertion via BamB

-> Substrate im Cytoplasma synthetisiert & über Sec-Translokon ins Periplasma transportiert

-> Protein über SurA Chaperone im ungefalteten Zustand gehalten

-> DegP = Protease für misgefaltete OMPs (outer membrane proteins)

Aufgrund ihrer Hydrophobizität -> kommen nicht aus der inneren membran

Porine: OM von gram- Bakterien, anti-parallele ß-Faltblätter -> Fass Struktur, Unselektive & Selektive Kanäle, Bilden Trimere

• ß-Signal: hoch konserviertes C-terminales motiv beinhaltet Essentieller terminaler aromatischer Rest

• BamA kann sich seitlich öffnen (Zipper-like) & neue ß-Stränge einfügen

• Entstehendes Substrat-OMP wird durch BamA Barrel vom C-Terminus eingefügt

assymmetrische äußere Membran

-> O-spezifisches repetitives Polysaccharid varriiert je nach Spezies

-> Core polysaccharid konserviert

-> Lipid A verantwortlich für Immunreaktion - Endotoxin

1. Lipid A Biosynthese (Lpx proteine)

2. Core OS hinzugefügt (Waa Proteine)

3. Flip an die inner Membran

4. O-PS Biosynthese & Ligation ans Lipid A

5. LPS Export (Lpt Proteine: LptBFGC complex -> LptA -> LptDE complex, Kanal Bildung)

6. Lipid A Modifikation

7. Transport an äußere membran

• Proteine falten sich im Periplasma

• Disulfidbrücken werden im Periplasma gebildet

• keine Energiequellen (ATP, Protonenmotive Kraft) an äußerer Membran

• Peptidoglykanschicht bildet Netz mit Poren -> Durchgang Proteine ca. 50-100 kDa

Problem: Organelle an Zelloberfläche aus sich wiederholenden Untereinheiten, die (1) selbstständig an der Zelloberfläche zusammengebaut werden müssen und (2) sich nicht vorzeitig zusammensetzen dürfen.

Lösungen:

1. Untereinheiten intrinsische Fähigkeit zur Selbstmontage, periplasmischer Chaperon verhindert, zusammensetzen im Periplasma (Typ I Pili)

2. Zusammenbau von Pili beginnt an der äußeren Seite der inneren Membran und erstreckt sich durch eine Pore in der äußeren Membran (Typ 4 Pili) und umfasst Proteine, die Peptidoglykan abbauen.

• Uropathogenic E.coli

• Triggert Signalwege der Wirtszelle aus -> Internalisierung Bakterien

• adhesive Oberflächenorganellen mit proteobakteriellen Pathogen (E-coli, Salmonella, Pseudomonas usw.) Virulenzfaktoren

• Fibrillae-poly-adhäsiv

• Fimbriae-mono-adhäsiv

• Fimbriae

• UE transportiert via Sec Pathway - über FimC Chaperone im ungefalteten Zustand gehalten -> Kein assembly im Periplasma

• Donor Strand Exchange am FimD (Usher) ß-Fass, FimC mit Tail lagert sich an -> Übertragung Donorstrang auf enstehenden Pilus -> Verlängerung & Chaperon dissoziiert

• Keine Energie benötigt, Faltenergie ausreichend

Donor Strand exchange:

• HlyB: ABC Transporter gelangt in Kontakt mit TolC: Kanal an OM (ß-Barrel OM & a-Helices Periplasma -hydrophil)

• ATP Hydrolyse an IM -> Sekretion durch OM Kanal

• OM Kanal kann mit anderen ABC-Transportern geteilt werden

2-Schritte Translokation:

1. Sec-vermittelte translokation (über Sec-Peptide) über IM ins Periplasma

2. Faltung im Periplasma über Chaperone

3. Translokation über OM via Pseudopilus & Secretin - angetrieben über ATP Hydrolyse im Cytoplasma

Komponenten: IM Plattform - angetrieben über ATPase

Pseudopilus - mit OM Gate (Sekretin, großer Gated Kanal, auch in Type III secretion)

-> Bsp: Pseudomonas aeruginosa (Lipasen, Proteasen)

-> Vibrio Cholera (Cholera Toxin)

-> E.coli (Chitinase)

• Secretin sekretiert via Sec-System - im Periplasma gefaltet & in OM über Lol pathway

• IM Proteine via Sec apparatoren in innere Membran sekretiert -> Interaktion mit cytoplasmatischer ATPase

• Pseudopilins with + geladenem N-Terminus assembliert -> drückt Substrat richtung OM & durch das Sekretin

• Sekretion Effektor Proteine (kein spezif. Signalpeptid, Erkennung via Aminogruppen) aus bakteriellem Cytoplasma direkt über IM & OM, Via Needle Komplex durch Translokon (Sekretion durch das Typ III System) in Eukaryotische Wirtszelle

  -> Transport Über 3 Membranen

• Nur in gramnegativen Bakterien , Kodiert auf Pathogenitätsinseln (PAIs) im Chromosom oder Virulenzplasmiden

• Komplexe Zeitliche & Räumliche Sekretion

• Needle Komplexe ähneln bakteriellen Flagellelen- evolutionäre Homologien

- Schrittweiser Aufbau

- hohl

- angetrieben über cytosolische ATPase

- Länge Nadel reguliert über Hilfsprotein (YscP - bindet & verlängert sich & streched somit die Nadel -> Fertige Nadel, Protein geht an -> Erst dann gelangen Effektrorproteine durch)

- Tip Komplex der Nadel enthält LcrV - bildet Translocation Pore, Immunreaktionen gegen Tip Proteine

• Vollständige Aktivierung erfordert Kontakt mit Wirtszelle

• Bei Kontakt -> innerhalb Sekunden Translokatoren & Effektoren ausgeschieden - vorab synthetisiert & in sekretionsfähigem Zustand gespeichert

• Chaperone halten Effektoren in teilweise entfaltetem Zustand

TTSS (type 3 secretion system) verwendet für:

• Induktion macropinocytotische Aufnahme (Salmonella & Shigella - fakultativ intrazelluläre pathogene)

• intravakuoläre Modifizierung der Umgebung (Salmonella & Chlamydia - intrazelluläre pathogene)

• Hemmung der eigenen Phagozytose (Yersinia -extrazelluläres Pathogen)

• Induktion zellulärer ‘pedestals’ (EPEC, EHEC - extrazelluläre Pathogene)

• Einführung Zytokine (Pseudomonas - extrazelluläres Pathogen)

• Einführung Virulenzproteine in Pflanzenzellen (Pseudomonas syringae extrazelluläre Pflanzenpathogene)

Verwendet für Konjugation, Effektor Translokation & DNA Uptake/Release

• sekretiertes Substrat immer Protein

• Bei DNA Transport - Relaxase kovalent an DNA

• A. tumefaciens (Pflanzenpathogen) -> Transportiert Protein gekoppelte DNA & Effektormoleküle

• Legionella pneumophilia Dot-System: Sekretion Proteinen ins Makrophagencytoplasma -> modulieren endosomalen Transport des Bakteriums

• Helicobacter pylori CagA: Sekretion CagA ins Cytoplasma von Magenepithelzellen -> Entzündungsreaktion

• Bordetella pertussis pertussis-Toxin: im Periplasma zusammengebaut -> in extrazellulären Raum exportiert -> Bindung eukaryotische Zelloberflächenrezeptoren -> Internalisierung

• Autotransporter Proteine - Sekretionssystem in eigener Sequenz

• in gram negativen Bakterien

• Meist involviert in Pathogenese: Proteasen, Toxine, Adhäsine, Invasine

• In OM, N-terminus (Signalpeptid) muss abgeschnitten werden

• 2-Step Translokation: Transport durch innere membran -> periplasmatisches intermediat -> Transport durch äußere Membran

• Virulenz(Proinflammatory antiphagocytic), Antivirulenz (ani-inflammatoric), Kompetition (antibakterill)

• Aufbau: Extended state, Kontraktion ‘firing’, Disassemblierung

• Struktur homolog zu Phagen die DNA injezieren

• Twitching Motilität

• DNA-Transformation

• Anhaftung an das Wirtsepithel

• Bildung von Biofilmen

• Essentiell für die Pathogenität

Pilus Bewegung: Pilus UE an Tip -> Oberflächenhaftung wird erkannt -> Retraktion -> Erneute Pili-Assemblierung

- Messung Dynamiken: Beads an Pilus koppeln - Retraktionskraft gemessen

• Membranplattform mit Hilfsproteinen (Verankerung), Assembly & Deassambly ATPase, Secretin, Peptidase

• Pilus Struktur: Signalpeptid mit + N-terminus, H-Region (Hydrophobes Alpha-Helix-Segment -> biden innere Struktur), C-terminus, nur positiv geladener N-terminus abgeschnitten

  -> Lollipop Struktur

-> Homolog

- Membranplattform mit Hilfsproteinen

- ATPase(n)

- Sekretin/Pore

Typ II Pseudopilus, Typ IV Pilus

Unterschiede:

Pseudopilus reassembliert ? Typ IV - Deassembly ATPase

- nicht homolog

- Typ IV prepilin Signal peptide - Typ IV Sekretion - kein Signalpeptid

- Gram (+) keine äußere Membran

- ähnlicher Aufbau aber kein Sekretin benötigt -> guidance struktur

Archaea:

- Keine Retraktionsmechanismus gefunden

Filament: UE des Flagellinproteins

Hook: Region an Basis des Flagellums, Verbindet Filament mit Motor

Basalkörper (C-,MS-,P-,L-Ring): Stab & Ringen, verankern Flagellum an Zellwand & cytoplasmatischer Membran, Molekularer Motor -> drehen & bewegen

Mot-Proteine: Treiben Motor an (Drehmoment lässt Filament rotieren, Protonenmotivkraft als Energiequelle)

Fli-Proteine: Motor switch (kann die Rotation der Flagellen umkehren)

-> Schrittweiser Aufbau zeitlich und räumlich reguliert (TFs), ähnelt Typ III Sekretion

• Mot-Proteine (MotA/B Proton/ Na Kanal) benutzen die protonenmotorische Kraft um Struktur zu rotieren (Konzentration Protonen höher außerhalb der Zelle

Bakterien: Flagellum - Type III Sekretion, Protonenmotorische Kraft

Archaea: Archaellum - Typ IV Pilus, ATP

-> evolutionär nicht verwandt

-> Teilung durch Verlängerung & anschließende Einschnürung in der Mitte der Zelle, Alle Schichten schnüren sich zur gleichen Zeit ein

-> Divisome: großer Protein-Komplex

FtsZ - Tubulin-Homolog (polymere Struktur, Z-Ring)bildet Fundament des bakteriellen Zellteilungsapparats

= filamentation temperature-sensitive

• Teilung und Elongation zu Filamenten

• Tubulin-Homolog - Polimerisation benötigt GTP-> polymerische fadenförmige Strukturen, GTP Hydrolyse begünstigt Zerlegung der Filamente, Interaktion Filamente miteinander -> FtsZ-Ring

• GTP zw. Nukleotid-Bindestelle des einen Monomers & C-Terminus Domäne des anderen

• FtsZ setzt kontinuierlich dynamische Filamente im Zellinneren zusammen -> nur in der Mitte der Zelle stabil -> Bildung FtsZ-Ring

• Zuschnüren FtsZ-Rings bewegt IM & Zellteilungsapparat nach innen -> Einschnürung gesamter Zellhülle

Wichtig: Teilung an Zellpolen -> anukleate zellen, Teilung in Chromosomen -> strenge Kontrolle Position Teilungsstelle

- Min CDE Proteine -> Min System regulieren Positionierung FtsZ

- Oszillieren -> dynamische Lokalisation

MinD: ATPase

MinC: Inhibitor FtsZ Ring Formation

MinE: Topologischer Spezifitätsfaktor

MinD & MinC -> membrangebundener Komplex,umgibt Polregionen der Zelle

Hemmenden Aktivität MinC -> FtsZ-Rings nur im Zellzentrum

MinE -> ringförmige Struktur, interagiert mit MinCD-Komplex -> entfernt Komplex -> neue Anordung

MinE aktiviert ATPase Aktivität von MinD -> Nach Hydrolyse MinD dissoziiert von Membran - ADP-> ATP -> Neue Interaktion mit Membran

- binden an Nukleoid

- hemmen FtsZ-Polymerisation

Nukleoid-Okklusion stellt sicher, dass FtsZ nicht über unreplizierte chromosomale DNA zusammengebaut wird

-> verhindert Zerteilung Nukleoiden aufgrund vorzeitiger Zellteilung

• Min System: verhindert Zellteilung in den polaren Regionen der Zelle -> Positionierung

• Nucleoid occlusion: Verhindert FtsZ bildung im Zentrum sofern DNA-Replikation nocht nicht beendet ist -> Timing

• Beide Schützen Nucleoid vor Zerlegung

Negative Regulation:

Inhibitor FtsZ-Polymerisation blockiert Bildung Z-Rings in bestimmten Bereichen der Zelle & begrenzt Zellteilung auf die Bereiche, die nicht vom Inhibitor besetzt sind (z. B. Min, SlmA, MipZ).

Positive Regulation:

Aktivator FtsZ-Polymerisation stimuliert Bildung Z-Rings am zukünftigen Teilungsort

z.B Ssg System in Streptomyces coelicolor (SsgA & SsgB - lokalisieren an Stellen der Zellteilung vor FtsZ -> Bestimmt Stelle des Z-Rings

Crenarchaeota - Bsp: Sulfolobus acidocaldarius

-> CdvA,B,C homolog zu eukaryotischen ESCRT system

Euryarcheota - Bsp: Haloferax volcanii

-> FtsZ

Thaumarchaeota habe Cdv Proteine & FtsZ

• FtsZ1 & FtsZ2 Co-lokalisieren als Ring in der Mitte der Zelle

  -> Zellteilung gestoppt bei Abbau von einem der beiden - Interdependent

  -> FtsZ1 lokalisiert ohne Ftsz2 aber nicht andersrum

• Ftsz an Membran verankert durch ZAPA, ZIPA & SepF (essentiell in H.volcanii - direkte Interaktion mit FtsZ2)