AB - 23 (2) auch 15/16
Genexpression / Proteinbiosynthese
a) Wozu wird DNA footprinting verwendet
b) Erkläre die Funktionsweise von DNA footrprinting mit Zeichnung
c) Beschreibe die einzelnen Schritte der Translationsinitiation in Prokaryoten und Eukaroyten
a) Methode zur Untersuchung von DNA-Bindeproteinen bei bekanntem Protein & bekannter DNA
b) dient der exakten Bestimmung der Bindesequenz auf der DNA, vom Protein gebundene DNA vor Nuklease Verdau geschützt -> hinterlässt einen Abdruck bei dem kein Verdau stattgefunden hat = footprint
c) Prokaryoten:
- Bindung Ribosom an mRNA via Shine-Dalgarno sequenz befindet sich oberhalb des Start Codons und ist komplementär zu 16s rRNA
- Ribosom kann dadurch auch an interne Startcodons binden und Translation initiieren - Polycistronische mRNA
- 1. Aminosäure is N-formylmethionin
Eukaryoten:
- 1. AS: Methionin beladen auf Initiator tRNA (Met-tRNAi)
- Met-tRNAi bindet zsm mit Initiationsfaktor eIF2 an kleine RibosomenUE
- Komplex erkennt mRNA via 5’ Cap sowie gebundenen Initiationsfaktoren eIF4E und eIF4G (interaktion mit polyA)
- Über weitere Initiationsfaktoren (unter ATP-Verbrauch) wird mRNA gescannt, bis erstes AUG-Codon erreicht ist
- Hydrolyse von GTP -> Dissoziation der Initiationsfaktoren & große RibosomenUE bindet
AB - 24 auch 22/23
5. Frage - Radziwill, Genexpression und Proteinbiosynthese
a) Nennen Sie 3 Mechanismen mittels derer die Aktivität von Regulatorproteinen in Eukaryoten gesteuert werden kann.
b) Wie unterscheidet sich die Translationsinitiation bei Prokaryoten und Eukaryoten?
a)
Regulation der Proteinbiosynthese - transkriptionelle & translationaler Ebene -> Transkription mRNA &/oder Translation der mRNA in Protein gesteuert
Ligandbindung: Regulatorproteine durch Bindung spezifischer Liganden aktiviert oder deaktiviert
Covalente Modifikationen: Regulatorproteine über PTMs (Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung, Glykosylierung) modifiziert ->Aktivität, Lokalisierung, Stabilität des Proteins beeinflusst Funktion
Untereinheitbindung: Interaktion mit zweiter Untereinheit führt zur Aktivierung des Regulatorproteins
Unmasking: Aktivität Regulatorproteine gehemmt->
Entfernung inhibitorischer Molekülen aktiviert sie und setzt sie frei
Stimulierung der Kerntranslokation: Einige Regulatorproteine müssen in den Zellkern gelangen, um ihre Funktion auszuüben -> Bsp Inhibitor hemmt Kerntranslokation
Membranfreisetzung: Regulatorproteine in inaktiver Form an Membranen ->Freisetzung aus Membran -> Aktivierung
b)
Prokaryoten: Bindung mRNA an Ribosom via Shine-Dalgarno Sequenz (oberhalb Start-Codon, komplementär zu 16S rRNA Motiv) -> Ribosom kann an interne Startcodons binden & Translation initiieren -> Polycistronics mRNA
1. AS = N-formylmethionin
Eukaryoten: Keine Shine-Dalgarnosequenz dafür Hilfe durch Vielzahl an Initiationsfaktoren (bsp. eIF2), Spezifität des Start-Codons, bei Eukaryoten neben AUG auch alternative Startcodons die für Methionin codieren
-> monocistronische mRNA Durchlaufen bis Startcodon gefunden wird
Bei Eukaryoten erst Prozessierung und Transport mRNA bis Translationsinitiation im Cytoplasma stattfinden kann
1. AS = Methionin
AB - 21/22 auch 2015
4. Proteinbiosynthese (Weber):
a. Nennen sie die funktionellen Schritte vom Gen zum Protein in Prokaryonten und Eukaryonten?
b. Beschreiben Sie die Translationsinitiation in Prokaryonten und Eukaryonten?
c. Nennen Sie ein Beispiel für eine metabolit-abhängige Expressionskontrolle und beschreiben Sie diese?
a. Prokaryoten: Transkription der DNA in mRNA im Cytoplasma via RNA Polymerase, direkt im Anschluss mRNA mithilfe der Ribosomen und tRNAs in Protein translatiert - anschließend PTM um Funktionalität zu verändern
Eukaryoten: Transkription DNA in mRNA im Zellkern via RNA-Polymerase , RNA-Prozessierung: Capping, Splicing & Polyadenylierung für Spabilität Transport und Translation der mRNA, Anschließend Export reifer mRNA ins Cytoplasma -> Translation mRNA in Protein via Initiationsfaktoren und Ribosom & tRNAs -> PTM
b.
Prokaryoten:
c. Lac-Operon:
Durch Schleifenbildung (DNA looping) können entfernt liegende Operatorsequenzen die Transkription beeinflussen.
Beispiel: Lac Repressor LacI. Bindet als Tetramer an DNA und inhibiert die Transkription. In Gegenwart von Allolactose dissoziiert LacI von der DNA und Transkription findet statt.
Tryptophan-Operon: (+) Tryptophan -> Repressor TrpR bindet Operatorsequenz & inhibiert Tryptophan Transkription
AB - 20/21 auch 16/17
Aufgabe 4, Weber, Genexpression
a. Sie suchen nach der DNA-Sequenz, an die ein Protein spezifisch bindet. Welche Methode verwenden sie? Erläutern sie die einzelnen experimentellen Schritte
b. Vergleichen sie die Translationsinitiation bei Prokaryoten und Eukaryoten
a. bekanntes Protein-unbekannte DNA:
ChIP - Chromatin Immunopräzipitation
Cross-linking der Proteine mit der DNA über Formaldehyd
Zellen werden lysiert
Fragementieren der DNA - um spezifischen Regionen der Interaktion zwischen den Proteinen und der DNA zugänglich zu machen
Präzipitation der DNA mit Antikörpern gegen das bekanntes Protein - AK binden spezifisch an Zielprotein und bilden Komplexe -> Gebundene DNA wird mitisoliert, ungebundene entfernt
Reverse Cross-Links - Aufheben der Verbindungen zw. Proteinen und DNA
Amplifikation DNA via PCR - unbekannte DNA Fragmente amplifiziert zur weiteren Analyse
AB - 19/20
4. Genexpression/Proteinbiosynthese (5 Punkte)
A) Geben Sie ein Beispiel für einen synthetischen Genschalter und erklären Sie seine Funktionsweise (2,5 Punkte).
B) Was ist ein Chaperon? Geben Sie ein Beispiel und erläutern Sie schematisch die Funktionsweise (2,5 Punkte)
a. Regulation Genexpression in Antwort auf Lichtsignale:
Licht induzierte Interaktion von Phytochrom B mit dem Phytochrom interagierenden Faktor PIF6
PhyB gekoppelt an VP16 = Aktivierungsdomäne
PIF6 gekoppelt an TetRepressor, der TetOperon bindet - gebunden an Gene of interest
Bei bestimmter Rotlichtwellenlänge bindet PHyB-VP16 Komplex an PIF6 und inaktiviert TetRepressor was zur Expression des Zielgenes führt ( z.B VEGF - Rotlicht-induzierte Neubildung von Blutgefäßen)
Chaperone sind Bsp. Heat-shock Proteine (HSP70 = DnaK) die bei erhöhten Temperaturen exprimiert werden um Denaturierungsprozess von Proteinen entgegenzuwirken - erkennen kurze hydrophobe Abschnite und binden diese unter ATP Verbrauch und ermöglichen so die korrekte Faltung der Proteine
HSP60 = GroEL/ES - binden falsch gefaltete Proteine via hydrophobe Interaktionen in einer Art Tasche, Unter ATP-Verbrauch & Bindung von GroES-cap verändert sich die Konformation von HSP60 -> Eingeschlossene Proteine werden partiell entfaltet & können sich danach neu falten
AB - 2015/16
Aufgabe 4:
a) Nennen Sie alle Enzyme und deren Rolle bei dem Weg der Ubiquitinierung
b) Woran binden DNA-bindende-Proteine?
a.
Ubiquitin-activating Enzyme (E1) - aktiviert Ubiquitin via Thioesterbindung
Ubiquitin-conjugating enzyme (E2) überträgt Ubiquitin auf Zielprotein im Komplex mit E3 (Ubiquitin-Ligase Komplex)
E3 erkennt zu ubiquitinylierende Proteine
Große Furche exponiert sequenzspezifische Strukturen, DNA-Binde-Protein erkennt hochspezifische Sequenzabfolgen (Bspw. palindromische Sequenzen, Triplet Erkennung usw.)
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