RNA-Processing

Prokaryoten:

-> Transkription und Translation gekoppelt

-> wenige Schritte

Eukaryoten:

-> Transkription und Translation sind räumlich

getrennt

-> viele Schritte

(Bei beiden wird die mRNA abgebaut aber aufgrund unterschiedlicher Signale)

Cis-agierend:

Regulierende Elemente, die auf der selben DNA-Strangrichtung oder Gen liegen.

z.B. Erkennungssignale für die Transkriptionsfaktoren

-> Diese Erkennungssignale sind in ihrer Funktion auf das Gen beschrängt

Trans-agierend:

Regulierende Elemente, die auf einem anderen DNA-Strang oder Chromosom liegen.

z.B. Transkriptionsfaktoren

-> Diese Transkriptionsfaktoren müssen erst zu ihrem Ziel transportiert werden

Der Cor-Promotor befindet sich meist unmittelbar vor dem Start

Sie sind variabel in Art, Anzahl und Länge der Konsenssequenzelemente

Diese befindet sich 25-35 bp downstream der TATA-Box.

1. Das TFIID (Transcription Factor IID) und TBP (TATA-binding protein) binden 30bp upstream (links von der Start Site) an die TATA-Box

2. Mit weiteren Transkriptionsfaktoren (TFIIF, TFIIH und TFIII) und der RNA-Pol II wird ein Präinitiationskomplex gebildet

3. Transkriptionsfaktoren und RNA-Pol II trennen ca. 14 Basenpaare auf, es entsteht eine “Transkriptions-Blase”

4. Die RNA-Pol II beginnt die Elongation

-> Bei einer fehlerhaften Initiation wird diese abgebrochen (recht häufig), die bis dahin entstandene mRNA (2-9 Nukl.) wird abgebaut

CDT ist wichtig für das Capping

• CTD (C-terminal domain) teil der RNA-Polymerase II

• Phosphorylierung während der Initiierung der Transkription

• Erleichtert Bindung von Capping-Enzymen während abortiver Initiation

• Erleichtert Bildung der 5'-Cap-Struktur der mRNA

  
  

  -> Wichtiger Schritt für mRNA-Stabilität und -Schutz

  -> Ohne Cap kommt es zur abortion

Nein nur die RNA Pol II syntetisiert RNAs mit Cap

Die RNA-Pol II kann nur in 5’->3’ synthetisieren

Der Wechsel erfolgt nach nach ca. 10 Nucleotide.

Synthese wird verhindert durch:

1. Negative Elongationsfaktoren

2. Phosphorylierung der 5. Serins der CTD-Domäne

Synthese wird ermöglicht:

1. Wegfallen der negativen Elongationsfaktoren

2. Wechsel der Phosphorylierung von 5. Serin auf 2. Serin

Nur TFIIF (mit Helikaseaktivität)

1. Physikalische Blockade (Transcriptional Pausing)

2. Benötigte Transkriptionselongationsfaktoren (Transcriptional Arrest)

20-50 Nukleotide/s

Sromaufwärts des letzten Exons befindet sich meist ein Poly-A-Signale

• Die Polymerase synthetisiert über das Signal hinaus

• Nach dem Stopp werden mRNA und Pol II aus der DNA gelöst

• Anschließend rekonstruiert sich die DNA

  
  

Prozess, bei dem die prä-mRNA nach der Transkription im Zellkern von Eukaryoten modifiziert wird, um funktionale mRNA-Moleküle zu erzeugen, die für die Proteintranslation bereit sind.

• Die wichtigstens Modifikationen sind:

  -> Basenmodifikation am 5’-Ende (Capping)

  -> Ausschneiden bestimmter Bereiche (Spleißen)

  -> Anhängen terminaler Basen (Polyadenylierung)

  
  

Das anbringen eines methylierten Nukleosid

-> Synthese: kleine Anzahl Enzyme

-> Nukleosid: 7-Methylguanosin (ᵐ⁷G)

-> Bindung: 5’-5’ Phosphodieesterbindung mit dem ersten 5-Nukleotid der RNA-Transkription

-> Blockiert: 5’-Kohlenstoffatom des ersten Nucleotids (darum Capping)

• Schutz vor Abbau

• Förderung des Spleißens

• Transport Kern-> Cytoplasma

Das anhängen eines Schwanzes aus ca. 200 Adenosiden (Poly-A-Schwanz)

• Die 3’- Enden fast aller euka. mRNAs sind polyadenyliert

  -> Außer viele Histone der Metazoa (Tiere)

Während der Polyadenylierung erfolgt die Spaltung der prä-mRNA nach dem CA-Paar, das sich hinter dem polyA-Signal und vor einer U- oder GU-reichen Region befindet.

• Cleavage und Polyadenylation Specificity Factor (CPSF)

• Cleavage Stimmulation Factor (CStF)

• Weitere multimere Enzymkomplexe beteiligt

  -> Polyadenylat-Polymerase (PAP) synthetisiert die ersten ca. 20A langsam

  -> Poly(A)-Bindungsprotein (PAB), führt zu einer festeren Bindung von PAP

  ———> Synthese der restlichen 150-200 As geht schnell

• Erleichtert den Transport der mRNA-Moleküle in das Zytoplasma

• Stabilisiert die mRNA im Cytoplasma

• Verstärkt die Transkription

  -> durch Bildung zyklisierter mRNA/Translationsfaktoren

( Keine Faltung zu einer Terminationsstruktur wie in Prokaryoten)

( Polyadenylierung in Prokaryoten ist Abbausignal)

• tRNA

• rRNA

• mRNA

-> tRNA und rRNA haben andere Spleißing-Mechanismen

Niedrige Eukaryoten:

• Gruppe I

• Gruppe II

Höhere Eukaryoten:

• Splicosombasierende Introns

In höheren Eukaryoten gibt es viel mehr Introns als in niedrigen Eukaryoten.

-> In Bakterien sind Introns eher selten

• Je höher der Eukaryot desto mehr Introns

• Introns können sehr groß sein ~ bis zu 90% der prä-mRNA

Es erfolgt rasch nach der Transkription.

1) Plasmid + DNA (inkl. Introns und Exons)

2) Transkription der DNA

3) Behandlung mit Kernextrakten

4) Gelauftrennung

Introns = Regionen, die nicht für Proteine kodieren

-> können regulierende Sequenzen oder funktionelle nicht codierende RNAs ernthalten

Exons = Regionen die für Proteine kodieren

-> enthalten 5’- u. 3’-UTR (Untranslated Region), CDS (Coding Sequence)

Spleißen ist der Vorgang bei dem die Introns aus der prä-mRNA ausgeschnitten werden und die benachtbarten Exons verknüpft werden.

Durch ein Multienzymkkomplex (Splicosom)

-> Enthalten RNAs

—> Bilden mit Proteinen sogenannte snRNPs (“snurps” smal nuclear ribonukleoprotein)

Zentrale Komponenten:

• kleine RNAs (snRNAs), die 100-300n lang sind

  -> U1, U2, U4, U5 und U6

  -> Bilden mit etwa 50 Proteinen die snRNP “snurps”

-> Splicosom ist keine feste Struktur sondern ändert sich während der Reaktion

• Donor: GU (an Exon 1)

• Akzeptor: AG (an Exon 2)

• Branch point: A

• Polypyrimidisierung

-> Erkennung Splicesequenzen über Basenpaarung

1) U1 snRNP bindet an Donor Site (5’Slicesite)

2) Branch Point Binding Protein (BBP) bindet an Branch Point (nicht abgebildet)

Weitere Proteine binden an Acceptor Site (3’ Acceptorsite) und Pyrimidin-Tract (nicht abgebildet)

3) U2 snRNP verdränkt BBP vom Branch Point

4) Komplex aus U4-U5-U6 snRNPs ersetzen U2AF Komplex

5) Rearrangement der snRNPs setzt U1 und U4 snRNPs frei

6) Die Veresterung der Schnittstelle ergibt Lasso-Struktur dabei ensteht eine unübliche

2’-5’-Phosphodiesterbindung

7) Weitere Rearrangements bringen die beiden Splicesites zusammen “Inton-Lasso” wird frei

Bindet freies Erstgeschnittenes 5’-Ende des Intron

-> so entsteht Lassostruktur

-> 2’-5’-Phosphodiesterbindung zwischen Lasso-Ende und Branchpoint

-> Zentrales “A” nicht mit snU2-RNA gepaart

Reguliert durch kurze Sequenzen (ca. 6 nt lange)

-> In Exons und Introns

Exons:

Exonische Splicing Enhancer (ESEs)

Exonische Splicing Silencer (ESSs)

Introns:

Intronische Splicing Enhancer (ISEs)

Intronische Splicing Silencer (ISSs)

Interagieren mit zwei Arten an Sleißfaktoren (trans)

-> Serin-Arginin (SR)-Proteine, typischerweise verstärkend

-> Heterogene Ribonukleoprotein-Partikel (hnRNPs) i.d.r. hemmend

Prozess, bei dem verschiedene Kombinationen von Exons innerhalb der prä-mRNA gespleißt werden

-> Ermöglicht aus 25.000 Gene mehr als 80.000 verschiedene mRNAs zu synthetisieren

Etwa 30-60% der Gene führen alternatives Spleißen durch

Ja ~ 15% menschlicher Krankheiten stehen in verbindung mit Problemen beim Splicen

Alle Prozesse (außer Spleißen) die zu einer Änderung der Sequenz einer RNA-Transkripts führen, so dass sich diese von der Sequenz der DNA Vorlage unterscheidet.

-> Enzymatische Änderzng der pre-mRNA-Sequenz

—> Deaminierung: Cytosin ->Uridin oder Adenosin -> Inosin

Häufig in:

• Mitochondrien von Protozoen und Pflanzen

• Chloroplasten von Pflanzen

-> wo mehr als 50% der Basen verändert werden können

-> selten bei höheren Eukaryoten

Editing des Apolipoprotein B

-> Das Gen “apoB” codiert für das Protein ApoB100

Darm:

-> Cytosindesaminase (APOBEC1) wandelt Cytosin in Uridin um

—> Erzeugt vorzeitiges Stoppcodon

-—-> Protein: apoB48 wird gebildet

Leber:

-> ApoB100 wird benötigt um Cholesterin in die Zellen zu transportieren

• RNA-Polymerase II (RNAPII)

• Cap-binding Protein

• hnRNP C Tetramer

• TREX-Komplex

• EJC/SR-Protein (Exon Junction Complex / Serin-Arginin-reiche Proteine)

• Tap-p15 (Mex67-Mtr2) Heterodimer

-> Transport der mRNA durch Kernporenkomplex

RNA-Turnover bezeichnet den Prozess des Abbaus und der Degradation von RNA-Molekülen innerhalb einer Zelle.

Die mRNA ist durch Cap und Poly-A-Schwanz geschützt

-> nur die ungeschützten Enden werden erkannt und abgebaut

-> Je kürzer der Poly-A-Schwanz ist dersto älter ist die mRNA und desto eher wird diese

abgebaut

Defekte mRNAs werden abgebaut:

-> Nonsense-vermittelter mRNA Zerfall = mRNAs ohne vollständiges offenes Leseraster

-> Vorzeitige Stop Codons = Translation endet und die defekte mRNA wird abgebaut

90% der prä-mRNA besteht aus Intons welche im Kern nach dem Sleißen abgebaut werden

Nucleasen bauen die mRNA ab

-> Deadenylation: Poly-A-Schwanz wird abgebaut

-> Decapping: Cap wird abgespalten

Eukaryoten:

• Halbwertszeit von 30min-20h (irgendwo 45 Jahre??? wo auch immer)

  -> viel kurzlebiger als tRNA und rRNA

Prokaryoten:

• Bakterielle häufig eine Halbwertszeit von 2-3 Minuten