Vorlesung 1 "Maldi MS und ESI MS"

Die Wissenschaft von Materie die durch die Bildung von der Gas-phase die charakterisiert werden in ihrere Masse, Ladung, Struktur und/oder physisch-chemischen Verteilung.

Ein Instrument welches die m/z Werte und Fülle der Gas-phasen Ionen misst.

• Ionenquelle zu Ionenerzeugung

• Massenanalysator zur Ionentrennung

• Detektor zum Ionennachweis

• Ablenkung eines geladenen Teilchens im Magnetfeld (Sektorfeld)

• Trennung nach Beschleunigung im elektrischen Feld (Time-of-flight)

• Trennung aufgrund von stabilen Bahnen im elektro-magnetischen Wechselfeldern (Quadropole, ion trap)

• Lineares Flugrohr

• Reflektor-Flugrohr

• Quadropol-Analysator

• enthölt Reflektor der Ionen auftrennt, da sie je nach Größe, Ladung etc. tiefer eindringen und daher früher/später reflektiert werden

• Das sich veränderne Wechselfeld im Raum zwischen den vier Polen schafft besondere Bedingungen für Ionen mit bestimmtem m/z Werten

Besteht aus Ionenstrahl-Konversionsdyode-Elektronenkaskade-Dynoden-Elektronenauffänger-Aufzeichnung im Spektrum

• Definition der Auflösung durch Breite des Peaks auf halber Peakhöhe: Full Width Half Maximum (FWHM)

Atome des gleichen Elements, die gleiche Zahl an Protonen, aber unterschiedliche Zahl an Neuronen besitzen, wie zum Beispiel 12C und 13C oder 35Cl und 37Cl

Isotopologe sind chemische Verbindungen, deren Moleküle sich in der Isotopen-Zusammensetzung unterscheiden.

Das häufigste Isotop, welches dann auch in der Auflösung sichtbar wird.

• Monoisotopische Masse hier nicht gut aufgelöst

• leichte helle peaks sind die einzelnen Isotopenpeaks, die nur bei guter Auflösung zu erkennen

Summenformel eingeben > Masse wird angegeben von den C12 Isotopen > gewünschte Auflösung wird angezeigt

• bei höherer Isotopenverteilung sind die Isotopenpeaks besser trennbar/sichtbar

Matrix assisted Laser Desorption/Ionisation Mass Spectrometry

1. Aufbringen eines Tropfens (1µ) einer Lösung von Matrix (bestehend aus Wasser und z.B DHB) und Protein auf das Target (Metallplatte)

2. Bildung von Matrixkristallen, in denen der Analyt eingebettet ist

   • Insulin wird in Matrix eingebaut, getrocknet und in Schleuse für das Vakuum gebracht

3. Laserbeschuss der Matrixkristalle im Vakuum des MS

   • es können bestimmte Energie und Wellenlänge eingestellt werden

4. Desorption der Matrix mit Desorption und Ionisation der Analytmoleküle

   • Expaniert ins Vakkum, wird tlw. fragmentiert

1. 2,5-Dihydroxy-Benzoesöure (DHB)

2. 4-Hydroxy-a-cyano-Zimtsäure

3. Sinapinsäure

• Bildet große Kristalle, oft am Rand des Probenspots

• Gut für Peptide und für Nucleotide geeignet

• UV Absorption bei 266nm, 337 und 355 nm

• Bildet kleine Kristalle

• Gut für Peptide und für kleine Proteine geeignet

• UV Absorption bei 337 und 354 nm

• Standard “dried droplet”

• Dünnschichtpräparation (Probelösunh auf dünne Matrixschicht)

• Anchorchip Präparation (hydrophile Oberfläche im Zetrum für höhere Konzentration)

• Electrospray Ionisation Massenspektrometrie

• Dispersion einer Flüssigkeit in viele kleine geladene Tröpfchen

• Besteht aus Stahlkapillare an der Anode und dem Massenspektrometer auf der Kathodenseite

• Dazwischen der Taylor-Kous, dem Flüssigkeitsfilament und dem entstehenden Spray

1. Bildung von kleinen geladenen Tröpfchen aus Elektrolyten

2. kontinuierlicher Lösungsmittelverlust dieser Tröpfchen durch Verdampfen, wobei die Ladungsdichte an der Tröpchenoberfläche zunimmt

3. wiederholter spontaner Zerfall der Tröpfchen in Miktotröpfchen (Coulomb-Explosionen)

4. Desolvatisierung der Analytmoleküle beim Transfer in das Massenspektrometer

• Quadropolanalysator

• Sehr empfindliche Messung, da weniger als 1 µL Probe eingeführt werden kann

• Man kann eine HPLC vorschalten

• Vom Inndendurchmesser

• Art des Elektrosprays (Nano oder Mikro)

• ESI ist eine konzentrationsabhängige Methode, d.h. die

  Empfindlichkeit ist konzentrationsabhängig.

• Durch Verringerung der Flussrate wird eine Probe in einem kleineren Volumen konzentriert.

• Empfindlichkeit ist proportional zum Quadrat des Radius.

• Von 1 mm Durchmesser auf 0,5 mm ergibt sich eine

  Empfindlichkeitserhöhung um den Faktor 4

• Als UV Chromatogramm: Im UV Chromatogram ergibt sich jeder Datenpunkt aus der zu dem Zeitpunkt gemessenen Absorption, die von allen Verbindungen, die dann eluieren, bedingt wird.

• Als Total Ion Chromatogramm: Im Total Ion Chromatogram ergibt sich jeder Datenpunkt aus der Summe aller Ionen-

  intensitäten im aufgenommenen Massenspektrum, die zu dem Zeitpunkt ionisiert wurden

1. Probeneinlass

2. Ionenquelle

3. Massentrennung

4. Kollisionsquelle

5. Massentrennung

6. Detektor

• Besteht aus drei Quadropolen hintereinander und einer Kollisionszelle in der Mitte

• Normaler Scan Modus

• MS/MS Scanmodus

Das Precursor Ion wird durch eine Transition zum Fragment Ion mithilfer kinetischer Energie

• TIC zeigt die Daten am Anfang und gibt an wann welches Peptid eluiert

• MS/MS zeigt ein peptid in der Q3 Pgase

Durch ableiten aus den Nomenklatur und den enthaltenen AS können diese durch ihre M/Z werte bestimmt werden.

• Q1 und Q3 konstant

• Detektion des Molekül Ions welches bestimmtes Fragment Ion in Q3 ergibt

SRM: Single-reaction-Monitoring

MRM: Mutliple-Reaction Monitoring

1. proteinidentifizierung durch Vergleich von massenspektrometrischen Daten mit Protein-Datenbanken

2. De-novo Sequenzierung

Sequenzbestimmung durch Interpretation von

Massenspektren unter Verwendung der Massen von

Fragmentionen (ohne Datenbanksuche)

• Peptide mass fingerprinting (gemessene Peptidmassen mit

  berechneten Peptidmassen vergleichen!)

• Fragment-ion search (gemessene Massen der Peptide und

  derer Fragmente mit berechneten Peptid- und

  Fragmentmassen vergleichen!)

• Die Peptid Massen werden aus Datenbanken verglicgen und durch das Program FRAGFIT experimentell bestimmt

• Vergleich der gemessenen Peptidmassen mit berechneten

  Massen der proteolytischen Peptide aus Proteinsequenz in

  Datenbank ermöglicht Identifizierung des Proteins

• Erfordert reine Proteine

• Mischung von Proteinen nicht zugänglich für PMF

• Kenntnis der Spezies oft notwendig

• Geeignet zur Identifizierung aus 2D Gelen und von

  gereinigten Proteinen

• Ionsensuche kann auch durch datenbankrecherche ersetz werden

  1. Ausschneiden der Proteinbande, enzymatischer Abbau im Gel

  2. Elution der Peptide

  3. Aufnahme eines Massenspektrums,

  4. Datenbanksuche (hier: peptide mass fingerprinting)

• Wenn kein Protein identifziert werden kann wird die cDNA in Datenbanken verglchen