Altklausurfragen P-Teil

K23

(2P)

a) Füllen Sie die Lücken: Sie haben genomische DNA aus Mundschleimhautzellen isoliert. Um deren Konzentration zu bestimmen, verdünnen Sie 125ml Ihrer DNA-Präparation mit 375 ml Puffer und messen (nach entsprechendem Nullabgleich) in einer ______-Küvette im Photometer die Absorption (A) von UV-Licht der Wellenlänge ____nm. (1P)

b) Sie messen A=0,15. Welche Konzentration hat demnach Ihre Ausgangslösung an genomischer DNA? (1P)

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NK 23

a) Füllen Sie die Lücken: Sie haben genomische DNA aus Mundschleimhautzellen isoliert. Um deren Konzentration zu bestimmen, verdünnen Sie 125ml Ihrer DNA-Präparation mit 375 ml Puffer und messen (nach entsprechendem Nullabgleich) in einer ______-Küvette im ______ die ______ (A) von ____-Licht der Wellenlänge 260 nm. (1P)

b) Sie messen A=0,15. Welche Konzentration hat demnach Ihre Ausgangslösung an genomischer DNA? (1P)

c) Reine DNA weist ein A-Verhältnis 260/280 nm von 2 auf. Ein deutlich kleineres Verhältnis ist indikativ für die Verunreinigung der DNA mit __________. (0,5P)

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NK22

Um die Konzentration einer dsDNA-Präparation zu ermitteln, bestimmen Sie ________metrisch die Extinktion bei ____ nm unter Verwendung einer _________-Küvette.

Sie verdünnen 50 µl Ihrer dsDNA-Präparation mit 0,75 ml Wasser und messen dann eine Extinktion von 0,13. Welche Konzentration hat Ihre ursprüngliche DNA-Lösung? (2,25 P)

K23

Erklären Sie knapp wozu Sie im Kurs verwendet haben: (3P)

• McConkey-Agarplatten

• Catechol-Sprühtest

• ONPG

• S9-Extrakt

• X-Gal

• Fd-Phage

NK23; K23

Sie wollen die Größe des ß-Galaktosidasegens mittels Transposon-Mutagenese eines entsprechenden Plasmids bestimmen. Dieses Plasmid unfasst insgesamt 10 kb und enthält neben dem ß-Galaktosidasegen auch ein b-Lactamasegen von 1 kb und einen Replikationsursprung von 0,5 kb.

Sie transformieren das Ausgangsplasmid in einen Bakterienstamm, der ein Tetrazyklin-Resistenz vermittelndes Transposon im Genom trägt, induzieren die Transposition und isolieren dann Plasmid-DNA. Beschreiben Sie die weiteren notwendigen Arbeitsschritte sowie den Rechenweg! (4P)

NK23; K23

a) Von einer Bakterienkultur stellen Sie die unten gezeigten 3 Verdünnungen her und plattieren von diesen jeweils 50 ul auf eine LB-Platte aus. Wie hoch ist der gemittelte Titer (mit Angabe der Einheit; ohne Wichtung der Verdünnungsstufen)? (1,75P)

b) Sie haben von der Bakterienkultur auch eine Trübungsmessung durchgeführt. Nach Verdünnung von 0,33 ml Kultur mit 0,66 ml LB-Medium ergab sich OD(578nm) = 0,21. Welchem Titer würde demnach eine OD(578nm) = 1 entsprechen? (0,75P)

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NK23

a) Von einer Bakterienkultur stellen Sie die unten gezeigten 3 Verdünnungen her und plattieren von diesen jeweils 50 ul auf eine LB-Platte aus. Wie hoch ist der gemittelte Titer (mit Angabe der Einheit; ohne Wichtung der Verdünnungsstufen)? (2P)

b) Sie haben von der Bakterienkultur auch eine Trübungsmessung durchgeführt. Nach Verdünnung von 0,33 ml Kultur mit 0,66 ml LB-Medium ergab sich OD(578nm) = 0,12. Welchem Titer würde demnach eine OD(578nm) = 1 entsprechen? (1P)

K23

Bewerten Sie die folgenden Aussagen mit wahr (W) oder falsch (F). (2,5 P)

Achtung: Falsche Antworten führen zu Punktabzug!

• Kleine dsDNA-Fragmente (10 - 500 bp) trennt man am besten in Polyacrylamidgelen (PAG) elektrophoretisch auf.

• Acridinorange-Bindung an dsDNA führt bei Plasmiden zur negativen Superspiralisierung.

• Die Gibson-Assemblierung ist eine Restriktionsendonuklease-unabhängige Kloniermethode.

• Die Gibson-Assemblierung ist eine 1-Schritt in vitro-Rekombination überlappender DNA-Fragmente.

• Das F-Plasmid kann über IS-Sequenzen in das bakterielle Genom integrieren.

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NK23

a) Elektrophorese (1,5P)

• Kleine dsDNA-Fragmente (10 - 500 bp) trennt man am besten in Agarosegelen auf.

• Kleine dsDNA-Fragmente, die repetitive Sequenzen enthalten, sollten unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt werden, um scharfe Banden im Gel zu erhalten.

• Ethidiumbromid-Bindung an dsDNA führt bei Plasmiden zur positiven Superspiralisierung.

b) Gibson-Klonierung (1,5P)

• Die Gibson-Assemblierung ist eine Ligase-unabhängige Kloniermethode.

• Die Gibson-Assemblierung ist eine 1-Schritt in vitro-Rekombination überlappender DNA-Fragmente.

• Ein Gibson Reaktionsansatz enthält neben einer DNA-Exonuklease und einer DNA-Polymerase auch eine DNA-Ligase.

c) PCR (1,5P)

• Als Matrize in einer PCR kann entweder DNA oder RNA dienen.

• Eine PCR mit Primern, die bei 50°C hybridisieren ist möglich, weil sie durch Polymerasetätigkeit bei dieser Annealing-Temperatur so weit verlängert werden, dass sie bei 72°C nicht mehr abfallen.

• PCR Primer mit zunächst nicht hybridisierenden 5'-Überhängen hybridisieren im 3. Zyklus erstmalig auch über ihre gesamte Länge.

NK23; K23

(3P)

Sie führen einen AMES-Test mit zwei ________ ________-Stämmen (füllen Sie die Lücke) durch. Stamm A hat eine Indel-Mutation, Stamm B eine missense-Mutation. Eine Testsubstanz erzeugt bei Stamm A klare Höfe um die mit der Substanz getränkten Filterplättchen, bei Stamm B klare Höfe und ringförmig angeordnete Bakterienkolonien.

Welche der folgenden Schlüsse aus diesem Ergebnis sind wahr (W), welche falsch (F)?

Achtung: Falsche Antworten führen zu Punktabzug!

• Die Testsubstanz erzeugt Rasterschubmutationen.

• Die Testsubstanz wirkt toxisch auf Bakterien.

• Die Testsubstanz hat mutagene Wirkung.

• Die Testsubstanz hat nur in Stamm B mutagene Wirkung.

• Die Testsubstanz könnte beim Menschen krebsauslösend wirken.

NK23; K23

Sie PCR-amplifizieren ein 2 kb großes Gen und verwenden dazu eine hitzestabile DNA-Polymerase mit einer Synthesegeschwindigkeit von 1 kb/20 sec sowie die Primer A) GAGACTCGTCAGACGTAACGA und B) CTTCCTCGACCAAGCTTTGCA. Zeichnen Sie für einen PCR-Zyklus den Temperaturverlauf (Y-Achse) gegen die Zeit (X-Achse) auf und benennen Sie die verschiedenen Phasen. Geben Sie die Temperaturen und Zeiten dort, wo dies möglich ist, möglichst genau an! Zwei Parameter variieren je nach PCR. Machen Sie diese kenntlich und erklären Sie, womit sich diese Parameter ändern. (8P)

NK23; K23; NK22

Untenstehend angegeben finden Sie die Lage der jeweiligen Deletion im rll-Lokus von vier verschiedenen T4-Phagenmutanten. Nehmen Sie an, Sie führen mit diesen alle möglichen Doppelinfektionen von E. coli K12 durch. Welche Zweierkombination(en) würde(n) a) Lyse, b) Plaques und c) nichts ergeben? (1,5P)

Durch welche Prozesse (Fachausdrücke!) kommen Lysa bzw. Plaque-Bildung zustande? (1P)

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NK22

K23

Welche drei Enzyme sind für die Durchführung einer Gibson-Assemblierung vonnöten? (1,5P)

NK23; K23

(4P)

Zeichnen Sie in das unten stehende Koordinatensystem den theoretisch zu erwartenden zeitlichen Verlauf der B-Galaktosidaseaktivität für die folgenden vier Fälle:

a) Stamm mit einer inaktivierenden Mutation in der CAP-DNA-Bindestelle des Lac-Operons. Anzucht in Glukose-freiem Mangelmedium und Zugabe von IPTG nach 120 min.

b) Stamm mit einer Mutation, welche CAP unabhängig von cAMP zu konstitutiver DNA-Bindung befähigt. Anzucht in IPTG-haltigem Mangelmedium und Zugabe von Glukose nach 120 min.

c) Untransformierter XL1blue-Stamm, den Sie im Klonierungsprojekt für die Blau-Weiß-Selektion verwendet haben. Anzucht in Glukose-freiem Mangelmedium und Zugabe von IPTG nach 120 min.

d) Mit dem Plasmid pBS-SK+ transformierter XL1blue-Stamm, den Sie im Klonierungsprojekt für die Blau-Weiß-Selektion verwendet haben. Anzucht in Glukose-freiem Mangelmedium und Zugabe von IPTG nach 120 min.

NK23; NK22

a) Wie heißt das Enzym, das Bakterien Resistenz gegenüber Ampizillin verleiht? (0,5P)

b) Wie ist der molekulare Wirkmechanismus von Ampizillin? (0,5P)

c) Warum entstehen um eine Ampizillin resistente Kolonie nach wenigen Tagen meist kleine, sog. Satellitenkolonien? (0,5P)

d) Was inhibiert das ebenfalls im Praktikum verwendete Chloramphenicol ? (0,5P)

e) Würden Sie auf Chloramphenicol-Platten Satellitenkolonien erwarten? Begründen Sie Ihre Antwort knapp! (0,5P)

NK22

Sie führen eine Transformation mit 25 fmol eines Plasmids durch, welches mit 3 kb ein Molekulargewicht von 2 x 10^6 u aufweist. Sie erhalten 430 Kolonien. Berechnen Sie die Anzahl der Transformanden pro ug Plasmid DNA. (1,5 P)

NK22

Um die Konzentration einer dsDNA-Präparation zu ermitteln, bestimmen Sie ________metrisch die Extinktion bei ____ nm unter Verwendung einer _________-Küvette.

Sie verdünnen 50 µl Ihrer dsDNA-Präparation mit 0,75 ml Wasser und messen dann eine Extinktion von 0,13. Welche Konzentration hat Ihre ursprüngliche DNA-Lösung? (2,25 P)

NK22

a) Sie wollen zwei lineare dsDNA-Fragmente von 1,2 und 1,8 kb durch Elektrophorese optimal voneinander trennen. Welches Gelsystem verwenden Sie? (0,75 P)

b) Sie wollen zwei lineare dsDNA-Fragmente von 1,2 und 1,8 Mb optimal voneinander trennen. Welche Gelelektrophorese-Methode wählen Sie? (0,5 P)

c) Sie wollen zwei lineare dsDNA-Fragmente von 0,12 und 0,18 kb durch Elektrophorese optimal voneinander trennen. Welches Gelsystem verwenden Sie? (0,75 P)

NK22

Sie führen eine PCR mit folgenden Primern durch: GGCGCATTCGCCC & TGGCGCGACCCGT. Der zugehörige 1. Zyklus ist unten gezeigt.

a) Beschriften Sie die Achsen. (1 P)

b) Tragen Sie die jeweiligen Temperaturen ein. (1,5 Р)

c) Beschriften Sie die Phasen in Bezug darauf was molekular jeweils passiert. (1,5 Р)

NK22

Wahr (W) oder falsch (F)? Achtung: Falsche Antworten geben Punktabzug! (3,5 P)

a) Als Matrize in einer PCR kann entweder DNA oder RNA dienen.

b) RNA-Oligonukleotide könnten theoretisch auch als Primer in einer PCR fungieren; aufgrund ihrer Anfälligkeit für Nukleasen werden sie aber i.d.R. nicht verwendet.

c) Eine PCR mit Primern, die bei 50°C hybridisieren ist möglich, weil sie durch Polymerasetätigkeit bei dieser Annealing-Temperatur so weit verlängert werden, dass sie bei 72°C nicht mehr abfallen.

d) PCR Primer mit zunächst nicht hybridisierenden 5'-Überhängen hybridisieren im 3.

Zyklus erstmalig auch über ihre gesamte Länge

a) PCR-Produkte, die repetitive Sequenzen enthalten, sollten unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt werden, um scharfe Banden im Gel zu erhalten.

b) Bei der Gibson Assemblierung handelt es sich um eine 1-Schritt in vitro Rekombination überlappender DNA Fragmente.

c) Ein Gibson Reaktionsansatz enthält neben einer DNA-Polymerase und einer DNA-Ligase auch eine Restriktionsendonuklease.

NK22

Wahr (W) oder falsch (F)? Achtung: Falsche Antworten geben Punktabzug! (2,5 P)

a) Der Ames-Test erlaubt prinzipiell keine Aussagen über die Art von Mutationen, die ein Gift auslöst.

b) Die Interkalation von Acridinorange (AO) in DNA führt zu InDel-Mutationen bei der Replikation.

c) InDel-Mutationen können durch Methylmethansulfonsäure (MMS) nicht revertiert werden, weil dieses Alkylierungsmittel Basenaustausche verursacht.

d) MMS führt beim TA98-Stamm, der ja eine InDel-Mutation trägt, auch bei hohen Konzentrationen nicht zum Auftreten von Hemmhöfen.

e)Bei angenommener, gleicher Mutationsrate, ist die Wahrscheinlichkeit, erfolgreich eine bestimmte auxotrophe Mutante zu erzeugen, niedriger, wenn man MMS anstelle von AO verwendet.

NK22

ArgR ist ein allosterisch regulierter Transkriptionsrepressor, der die Gene der Arginin Biosynthese reguliert. Erwarten Sie, dass er die entsprechenden Promotoren schwächer oder stärker bindet, wenn Arg mit seinem allosterischen Zentrum assoziiert ist? (1 P)

NK22

Berechnen Sie mit den untenstehenden Angaben den gemittelten Titer, dem eine OD von 1 entsprechen würde. (2,5 P)

NK22

E. coli wird in Glukose- und Laktose-haltigem Medium gezogen. Die gezeigten drei Kurven zeigen den Verlauf folgender Parameter über die Zeit:

i) Glukosekonzentration

ii) beta-Galaktosidase-Aktivität

iii) Bakterientiter

Ordnen Sie die Parameter den Kurven sinnvoll zu! (1,5 Р)

NK22

(2 P)

Hintergrund-Info: 1) Trypanosomen gehören zu den Kinetoplastiden, deren mitochondriales Genom, genannt Kinetoplast-DNA, aus einem einzigartigen Netzwerk von sehr vielen ringförmigen DNA Molekülen, den Mini- und Maxi-'circles', besteht. 2) Trypanosomen sind die Auslöser der Nagana-Rinderseuche. Die Krankheit kann erfolgreich bekämpft werden, indem den Tieren große Mengen Ethidiumbromid verabreicht wird.

a) Warum ist Ethidiumbromid für die Trypanosomen toxischer als für ihre Wirtszellen?

b) Und an welchen Praktikumsversuch erinnert Sie diese Aufgabe?

NK22

Duchenne Muskeldystrophie wird durch Mutationen im DMD-Gen ausgelöst.

Untenstehend sind entlang des DMD-Gens (Linie) neun Positionen markiert, die durch die Primerpäarchen a bis i PCR-amplifiziert werden. (Die PCR Produkte sind so klein, dass bei der gegebenen Längenskala lediglich Ihre Position durch Pfeile markiert wird.) Darunter ist das Ergebnis der entsprechenden Multiplex-PCRs gezeigt, bei der ein gesunder (normal) und 5

DMD-Patienten A-E analysiert wurden.

a) Zeichnen Sie unten möglichst genau die Positionen und Längen der bei den Patienten B bis E vorliegenden Deletionen ein. (3,75 P)

b) Kreuzen Sie die beiden Patienten an, bei denen die Deletion nach 5' über a bzw. nach 3' über i hinausgehen könnte. (0,5 P)

c) Bei Patient A fällt kein PCR-Produkt aus. Geben Sie mögliche Erklärungen... (1 P)