Vorlesung 2 "Analytik von Glykanen und Glykoproteinen"

1. Strukturelle und modulatorische Eigenschaften

2. Spezifische Erkennung von Glykanen durch andere Moleküle - vor allem Glykanbindende Proteine (GBPs)

   • extrinische Erkennung

   • intrinsisch Erkennung

• Verknüpfung eines Aldehyds mit einem Alkohol

• Abspalten einer OH Gruppe eines

• Fischer Projektion oder Sesselform

• alpha und beta Form, abhängig von der Richrung der rechten OH Gruppe

• Struktur von Glykanen bestimmt von möglicher Rotation um

  glykosidische Bindung

• Rotation ist eingeschränkt aufgrund von energetischen Dipol-Dipol Wechselwirkungen von freien Elektronenpaaren und von sterischen Effekten aufgrund von räumlichen Ansprüchen der Nachbargruppen

• Energetische Minimierung bedingt eine Vorzugsrichtung –

  exoanomerer Effekt

• Struktur von Glykanen bedingt durch Anomerie und exoanomere Effekte

• Die Verknüpfungsrichtung

• Änderung der Verknüpfungs richtung

  (hier B1,3 bzw. B1,4) führt zu Disacchariden mit deutlich

  veränderten Eigenschaften.

• Position der N-Acetylgruppe ist stark

  verändert.

• Blutgruppendeterminanten des AB (0) Systems

• Diese werden von Antikörpern, Enzymen und Lektinen eindeutig unterschieden

• Glykane an Proteinen lassen sich als N-Glykane (Asparagin) und O-Glykane (Threonin und Serin) unterscheiden

• N-Glykane sind über N-Acetyl-B-D-glucosamin (BGlcNAc) mit dem Amid-Stickstoff von L-Asparagin (Asn) verknüpft.

• Asn muß Teil der Signalstruktur Asn-Xxx-Ser/Thr sein. (Xxx beliebig außer Pro und Asp)

• O-Glykane sind über N-Acetyl-A-D-galactosamin (aGalNac) mit der Hydroxylgruppe von Ser oder Thr verknüpft. Es besteht ein weiterer Typ der O-

  Glykosylierung durch ein einzelnes Molekül O-GlcNac.

• Für O-Glykosylierung ist keine Signalsequenz bekannt.

• Glykoproteine tragen oft sowohl N-Glykane als auch O-Glykane z.B Erythropoetin

• Jede einzelne Glykosylierungsstelle weist Heterogenität in der Struktur des gebundenen Glykans auf – „Mikroheterogenität“

• Unterschiede liegen in der Anzahl, Position und Zahl der Untereinheiten.

• Glykosylierung ist spezies-spezifisch, gewebs-spezifisch, zelltyp-spezifisch und protein-spezifisch.

• N-Glykanen gemeinsam ist eine Pentasaccharid- Grundstruktur Man3- ßGlcNac2.

• Diese besteht aus drei Molekülen D- Mannose und 2 Molekülen N-Acetyl- ßD-glucosamin, die an Asn am Protein gebunden sind

• Mannose-reiche Form, die auf Grundstruktur aufbaut

• Komplexe Glykan-Form, die auf Grundstruktur aufbaut. An die beiden Mannosen der Grundstruktur bindet zunächst

  GlcNac, dann weitere Monomere.

• Beispiel ist dargestellt mit proximaler Fucose, die am ersten

  GlcNac a-1,6 glycosidisch gebunden ist.

• High-Mannose Typ

• Komplexer Typ

• Hybrid-Typ

• Mischung aus High-Mannose- und Komplexer Typ.

• die Modifikationen verändern drastisch das GG der Konformotmation

• die nummer der veränderungen reduziert sich von 5 auf 2 und von 5 auf 4

• Bi-, tri, tetra-antennär

• Mit verschiedenen tri-antennären Grundstrukturen (Einteilung in Grundtypen)

• Mit oder ohne Neu5Ac

• Mit vollständiger oder unvollständiger Sialylierung

• Ohne oder mit 1-3 LacNAc repeat(s)

• Mit Rumpfstrukturen auf der einen oder anderen Antenne

• Mit bestimmten Veränderungen in einer Antenne (z.B. zusätzliche Monosaccharid)

  • Proximale Fucose

  • Bisecting GlcNac

• Binding an Ser, Thr über GalNAc (bzw. Bindung von GlcNAc) im Golgi

• Größere Variabilität der Strukturen im Vergleich zu N-Glykanen

• Core-Strukturen

• Proteoglykane bestehen aus eine Polypeptidkette und einem hohen Anteil (bis zu 95%) an Glykosaminoglykanen.

• Glykosaminoglykane bestehen aus sich wiederholenden Disaccharid-Einheiten mit einem Aminozucker und mindestens einer Carboxylat oder Sulfatgruppe.

• Proteoglykane sind Bestandteile der extrazellulären Matrix

• Aggrekan und Kollagen sind im Knorpel enthalten.

Begünstigt den Faktor Xa bei der Bindung an Throbin

• Bestehen aus Proteinkomponente mit hohem Anteil an O-Glykosylierung durch N-Acetyl- galactosamin in Bereichen reich an S, T und P (VNTR region)

• Häufig Bestandteile schleimiger Sekrete

• Lipide finden sich oft in Verbindung mit Glykanstrukturen. Lipide sind in der Zellmembran gebunden und Glykane liegen an der Oberfläche.

• Glykane dienen als Erkennungsstrukturen an Zellen (Blutgruppen, Serotypen).

• Glykosylierung findet post-translational im ER und im Golgi statt

• N-Glykosylierung erfolgt vor allem im ER. Hier wird eine Gykanstruktur von Dolicholphosphat auf die wachsende Proteinkette übertragen.

• Weitere Prozessierung der Glykanstruktur durch spezifische Glykosyltransferasen im ER und Golgi.

• O-Glykosylierung findet im Golgi statt.

• durch die Glykosyl-transferase

• O-Glykosylierung durch GlcNAc als dynamische Modifizierung im Cytoplasma und im Nukleus

• O-GlcNac-ylierung konkurriert mit Phosphorylierung am Ser

• Regulierende Wirkung, z.B. im Glucose-Metabolismus

Baut Glykanstrukturen und überträgt sie im ER Lumen auf den Stickstiff des Asparagins.

Unterscheidung in 2 Gruppen:

• Lectine und Glycosamin-Glycan-bindende Proteine

• Zusätzlich: Antikörper, die spezifisch Glykanstrukturen erkennen

• ELISA

• Zell Selektion

• Blut Typisierung

• Histichemische Färbung

• Intakte Analyse

• Enzymatischer Abbau des Glykoproteins

• Abspaltung der N-Glykane mit PNGase F

• Direkte Analyse und/oder Permethylierung gefolgt von

  MS Analyse der Glykane

• raw: zeigt die Ladung an

• deconvoulted: Gewicht

• Erythropetin

• Die Heterogenität

• Man ist sich nicht sicher wie sicher das ist und welche Nebenwirkungen auftreten

1. Direkte Analyse aus Glykoproteinen

2. Analyse des Peptid Pools

3. Abspaltung der N-Glykane

4. Analyse der Einzel Peptide

• SDS Page

• MALDI MS

• IEF

• Analyse von druch Hydrolyse freigesetzten Sacchariden

• Saure Hydrolyse der Glykane in H2SO4 oder TFA

• High-Performance-Anion-Exchange (HPAE) Chromatographie trennt Glucose, Galactose, Arabinose, Xylose, Mannose, Fructose, Cellobiose und andere Kohlenhydrate bei pH > 12 !

• Detektion von Monosacchariden durch UV Absorption ist wenig empfindlich und daher ungeeignet.

• Pulsed amperometrische Detektion (PAD) hat einen weiten

  linearen Bereich für Mono-, Di-, und Tri-saccharide und andere Kohlenhydrate.

• Diskriminierung von UV-absorbierenden Verunreinigungen

  durch amperometrische Detektion.

1. Teennung der Ladungsgruppen und anschließend der Struktur

2. Trennung der Ladung und Struktur (HPAEC) oder 3. mit HPLC

• Permethylierung von Glykanen erhöht die Stabilität der Ionen und die Empfindlichkeit der Detektion in der MS Analyse.

• Reduktive Aminierung zur Einführung von UV Absorbierenden Gruppen und/oder zur Erhöhung der Nachweisempfindlichkeitin der MS

• Hydrazinolyse zur Abspaltung von O-Glykanen

• β-Eliminierung zur Abspaltung von O-Glykanen

• Die beiden Glykosilierungsstellen werden getrennt durch den Proteaseabbau in der Hinge Region und chromatographische Auftrennung

• Verschiedene O-Glycosidasen (Endo-α-N-Acetyl-

  galactosaminidase) werden verwendet

• Spezifisch für bestimmte core-Strukturen und meist wenig

  aktiv bei ausgedehnten Glykanstrukturen (sterisch behindert)

• In Kombination mit Exoglycosidasen Abspaltung der core-

  Struktur nachdem die ausgedehnte Glykanstruktur durch

  Exoglycosidase abgebaut ist.

• Untersuchung der intakten O-Glykan Struktur erfordert

  chemische Methoden zur Freisetzung

• durch Hydrazinolase

• durch ß-Eliminierung

• beide Methoden spalten N-Glykane

• Pelling Effekt, Verlust endständiger Monosaccharide durch Nebenreaktionen

• Hydrazinolyse für 5 h bei 60 °C zur Freisetzung von O-Glykanen Regeneration des reduzierenden Endes und damit Möglichkeit zur reduktiven Aminierung des freigesetzen Glykans

• Anion Exchange (z.B. MonoQ) zur Fraktionierung nach Ladung

• High Performance Anion Exchange Chromatography (HPAEC) mit gepulster amperometrischer Detektion (PAD)

• Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC)

• HPLC mit graphitized carbon column

• Vergleich der Retentionszeiten der Glykanpeaks zu Glykanstandards (Dextran-ladder) erlaubt Zuordnung

• Meist wird vor der Trennung die Glykane modifiziert (Permethylierung oder reduktive Aminierung)

• Glykanprofil liefert Verteilungsprofil der geladenen (sialylierten) Isoformen.

• Glykanprofil liefert Verteilungsprofil der Isoformen nach Trennung über Graphitsäule.

• Bestimmung der Verknüpfungstelle durch Methylierung der freien OH Gruppen gefolgt von Hydrolyse der glykosidischen Bindung und Reduktion zum Alditol.

• Frei gewordene OH Gruppen werden dann acetyliert und die Position der Acetylgruppe bestimmt.

• Analyse mit GCMS: Identifizierung und Quantifizierung der einzelnen permethylierten Alditolacetate

• Bindung- und Function-assays

• metabolisch markiert

• Bindung von DIFO Alexa FLuor der die Sonde trägt

• Native proteine werden derivatisiert und an eine nitrocellulose seite adsorbiert

• es wirf ein sandwich assax mit lektinen genutzt, der die proteine mit den antikörper berknüpft

• die bindungen werden mit straptividin-fluorphoren konjuguert

• antikörper werden derivatisiert

• probe wird aufgetragen

• lektine werden zugesetzt

• SA-PE wird aufgetragen

• scan

• lektine werden auf NHS-Glass Seiten immobilisiert mitrels ammine verbindungs chemie

• die proben werden fluoreszenz mariert und binden an die lektine durch ihre Glykan struktur

• die microarray technologie zeigt die entiwkclung

Das vollständige Repertoire von Glycanen und Glycoconjugaten die Zellen under bestimmten Bedingungen enthalten

Die Untersuchung des Glycome Profils und seiner Veränderungen

(Step A) Cells can be directly probed for

glycan expression using labeled lectins

and glycan-specific antibodies. This top–

down experiment provides a global view

of the distribution of certain glycan

epitopes on cells and tissues but does not

afford detailed structural information.