Vorlesung 3 "Proteinanalytik"

Begriff wird vielseitig verwendet

z.B. für Methoden zum

• Vergleich von chemischen Molekülen

• DNA-profil

• Peptidprofil

• Proteinprofil

• Metabolitenprofil

• Glycanprofil

• Identifikation von Mikroorganismen

1. Arbeitsphase

   1.1 Aufnahme

   1.2 Vorverarbeitung

   1.3 Merkmalsextraktion

2. + Lernphase

   2.1 Merkmalsreduktion >Datenbank>Stichrpobe>Lernen

   2.2 Klassifikation > Lernen

• Erfordert reproduzierbare Probenbereitung und MALDI Analyse

• Suppressionseffekte in MALDI Spektren

• Einfluß von pH Wert auf MALDI Spektren

• Einfluß der Matrix und der Kristallisationrate

• Standardisierte Probenbereitung führt zu reproduzierbaren Peakintensitäten

• Aufbau von Datenbanken

• Lösungsmittel

• Kristallisationsrate

• klassisch

• biochemisch

• DNA Sequenzierung

• Proteinprofil mit MALDI MS

• Färbung

• Zellmorphologie

• Koloniemorphologie (Größe, Form, Farbe)

• Selektive Kultivierung

• Bunte Reihe / API Reihe

• Basiert auf Vorhandensein bestimmter Enzyme

  (Catalase, Oxidase, Coagulase)

• PCR einer 500 bp Sequenz in der 16S rRNA

• Sequenzierung und Vergleich mit Datenbank

• MS sind äbhängig von Alter, Zellkulturbehandlung und Präperationsmethode

• Analyse von Bakterien, Hefen, Pilzen, Mycobakterien

• Unabhängig vom Kulturmedium

• Unabhängig von Temperatur der Kultivierung (doch im

  Kühlschrank aufbewahrte Kulturen unbrauchbar)

• Alter der Mikroorganismen: Kultur am besten 12-48 h alt, bei längeren Zeiten geringe ID Rate.

• Direkte Methode (direct smear) oder Zahnstocher Methode

• Ethanol-Ameisensäure Extraktion

• Mit Zahnstocher kleine Menge einer Kolonie aufnehmen

• Übertragen auf MALDI Target

• Trocknen lassen

• Mit 1 ul HCCA Matrix versetzen und trocknen lassen

• Aufnahme eines MALDI Spektrums

1. Zellen in VE wasser

2. werden durch Ethanol aufgeschlossen, welches Pathogen inaktiviert

3. Ethanol wird entfernt

4. wird FA und Acetonitril beigefügt

5. Pallet fällt aus und kann analysiert werden

Score größer gleich 2

• Aufnahme von MALDI Spektren von der Oberfläche von Gewebeschnitten

• Laser erlaubt Aufnahme aus genau definierten Bereichen mit Flächen zwischen ca. 20 und 200 μm2

• Intensität der Massenpeaks erlaubt über Farbschema Visualisierung der Gewebeschnitts für verschiedene m/z Werte

• Information über Verteilung von Substanzen im Gewebeschnitt

1. Ebene: Nur Reinkultur

2. Kann für unreinere Proben verwendet werden

Accuracy = Genauigkeit: Wie nah man am wahren Wert ist, wie richtig der Wert ist

Precision = Präzision: Wie nah die Messwerte alle aneinander liegen

• Untersuchen der Phosphorylierung und OH-Gruppe oder Acetylierung

• kann die Proteineigenschaften verändern erhöhen/reduzieren

• Phosyphorylierung durch Kinase von Serin, Threonin und Tyrosine, umkehrbar durch Phosphatase

• Acetylierung von Lysin durch Acetyltransferase, umkehrbar durch Deacetylase

Dient der dynamischen Kontrolle von zellulären Signalwegen

• Grad der Phosphorylierung über MS möglich

• Proteine sind an mehreren Stellen mit verschiedenen PTMs modifiziert. Die Modifikation ist meist nicht komplett (sub-stöchiometrisch).

1. Modifizierte Proteine werden aufgetrennt und/oder angereichert

2. Detektion posttranslationaler Modifikationen in Proteinen oder Peptiden

3. Modifizierte AS wird lokalisiert

4. Stöchiometrie wird bestimmt

Bei ausreichender sub-stöchiometrischer Mengen

• Affinitäts-chromatographische Methoden

• Immunpräzipitation mit PTM spezifischen Antikörpern

• Spezifische Anti-phospho-Tyr Ab verfügbar

• Keine spezifischen Ab (Antikörper) für phospho-Ser und phospho-Thr

• Phospho-spezifische Ab die bestimmte phosphorylierte Sequenzen (phospho- Ser oder phospho-Thr mit umgebenden Aminosäuren) erkennen

Immobilized metal affinity chromatography

• Entsalzung der Probe zum Entfernen störender Pufferbestandteile und Salze

• Chelat-Komplex-Bildung der Phosphatgruppe an immobilisierten Metallionen, z-B. Fe3+ oder Ti4+

• Bindung der Phosphoproteine bzw. Phosphopeptide mit guter Spezifität (!Ausnahme Peptide mit hohem Anteil

  saurer Aminosäuren)

• Nach Waschen, Elution z.B. mit MALDI Matrix DHB in 50% Acetonitrile, 1% Phosphorsäure für MALDI MS oder Ammoniak-Lösung (pH 10,5) für LCMS

• Kationenaustausch-Chromatographie mit hoher Bindungsstärke

• Positiv geladene Peptide bzw. Proteine binden an negativ geladene stationäre Phase

• Elution der Peptide/Proteine mit steigender Salzkonzentration

• Negativ geladene Phosphopeptide/-proteine eluieren früher als unphosphorylierte.

• Entsalzung oft notwendig vor weiterer MS Analyse

> Salze binden an Kationen, diese werden dann durch unseren Analyten getauscht

• Charakteristisches Perlenkettenmuster durch unterschiedliche Phosphorylierungszustände im Protein.

• Trennung der negativ geladenen Phosphoproteine in der isoelektrischen Fokussierung

Radioaktivität

• Radioaktive Markierung durch Verwendung von 32PO4

  2- (oder 33PO42- )

• Einbau radioaktiver Phosphatgruppen in metabolisch modifizierte Proteine

• Trennung im 2 D Gel (pI 4- 7) und Visualisierung im Autoradiogram

• Hohe Zahl an Phosphoproteinen (ca. 30% der Proteine werden phosphoryliert)

• Immunpräzipitation mit Acetyl- spezifischen Antikörpern

• Für acetylierte Peptide und Proteine anwendbar

• Detektion der Acetylierung durch MS Analyse oder Edman Abbau

• Acetylierung verkürzt Retensonszeit

• MS Signal wird durch Acetylgruppe verschoben