Vorlesung 3 "Proteinanalytik"

Begriff wird vielseitig verwendet

z.B. für Methoden zum

• Vergleich von chemischen Molekülen

• DNA-profil

• Peptidprofil

• Proteinprofil

• Metabolitenprofil

• Glycanprofil

• Identifikation von Mikroorganismen

• Erfordert reproduzierbare Probenbereitung und MALDI Analyse

• Suppressionseffekte in MALDI Spektren

• Einfluß von pH Wert auf MALDI Spektren

• Einfluß der Matrix und der Kristallisationrate

• Standardisierte Probenbereitung führt zu reproduzierbaren Peakintensitäten

• Aufbau von Datenbanken

• Läsungsmittel

• Kristallisationsrate

• klassisch

• biochemisch

• DNA Sequenzierung

• Proteinprofil mit MALDI MS

• Färbung

• Zellmorphologie

• Koloniemorphologie (Größe, Form, Farbe)

• Selektive Kultivierung

• Bunte Reihe / API Reihe

• Basiert auf Vorhandensein bestimmter Enzyme

  (Catalase, Oxidase, Coagulase)

• PCR einer 500 bp Sequenz in der 16S rRNA

• Sequenzierung und Vergleich mit Datenbank

• MS sind äbhängig von Alter, Zellkulturbehandlung und Präperationsmethode

• Analyse von Bakterien, Hefen, Pilzen, Mycobakterien

• Unabhängig vom Kulturmedium

• Unabhängig von Temperatur der Kultivierung (doch im

  Kühlschrank aufbewahrte Kulturen unbrauchbar)

• Alter der Mikroorganismen: Kultur am besten 12-48 h alt, bei längeren Zeiten geringe ID Rate.

• Direkte Methode (direct smear) oder Zahnstocher Methode

• Ethanol-Ameisensäure Extraktion

• Mit Zahnstocher kleine Menge einer Kolonie aufnehmen

• Übertragen auf MALDI Target

• Trocknen lassen

• Mit 1 ul HCCA Matrix versetzen und trocknen lassen

• Aufnahme eines MALDI Spektrums

Score größer gleich 2

• Aufnahme von MALDI Spektren von der Oberfläche von Gewebeschnitten

• Laser erlaubt Aufnahme aus genau definierten Bereichen mit Flächen zwischen ca. 20 und 200 μm2

• Intensität der Massenpeaks erlaubt über Farbschema Visualisierung der Gewebeschnitts für verschiedene m/z Werte

• Information über Verteilung von Substanzen im Gewebeschnitt

• Untersuchen der Phosphorylierung und OH-Gruppe oder Acetylierung

• kann die Proteineigenschaften verändern erhöhen/reduzieren

• Grad der Phosphorylierung über MS möglich

• Proteine sind an mehreren Stellen mit verschiedenen PTMs modifiziert. Die Modifikation ist meist nicht komplett (sub-stöchiometrisch). Dies dient der dynamischen Kontrolle von

  zellulären Signalwegen.

1. Modifizierte Proteine werden aufgetrennt und/oder angereichert

2. Detektion posttranslationaler Modifikationen in Proteinen oder Peptiden

3. Modifizierte AS wird lokalisiert

4. Stöchiometrie wird bestimmt

Aufgrund sub-stöchiometrischer Mengen

• Affinitäts-chromatographische Methoden

• Immunpräzipitation mit PTM spezifischen Antikörpern

• Spezifische Anti-phospho-Tyr Ab verfügbar

• Keine spezifischen Ab (Antikörper) für phospho-Ser und phospho-Thr

• Phospho-spezifische Ab die bestimmte phosphorylierte Sequenzen (phospho- Ser oder phospho-Thr mit umgebenden Aminosäuren) erkennen

Immobilized metal affinity chromatography

• Entsalzung der Probe zum Entfernen störender Pufferbestandteile und Salze

• Chelat-Komplex-Bildung der Phosphatgruppe an immobilisierten Metallionen, z-B. Fe3+ oder Ti4+

• Bindung der Phosphoproteine bzw. Phosphopeptide mit guter Spezifität (!Ausnahme Peptide mit hohem Anteil

  saurer Aminosäuren)

• Nach Waschen, Elution z.B. mit MALDI Matrix DHB in 50% Acetonitrile, 1% Phosphorsäure für MALDI MS oder Ammoniak-Lösung (pH 10,5) für LCMS

• Kationenaustausch-Chromatographie mit hoher Bindungsstärke

• Positiv geladene Peptide bzw. Proteine binden an negativ geladene stationäre Phase

• Elution der Peptide/Proteine mit steigender Salzkonzentration

• Negativ geladene Phosphopeptide/-proteine eluieren früher als unphosphorylierte.

• Entsalzung oft notwendig vor weiterer MS Analyse

> Salze binden an Kationen, diese werden dann durch unseren Analyten getauscht

• Charakteristisches Perlenkettenmuster durch unterschiedliche Phosphorylierungszustände im Protein.

• Trennung der negativ geladenen Phosphoproteine in der isoelektrischen Fokussierung

• detektiert durch Radioaktivität

• Radioaktive Markierung durch Verwendung von 32PO4

  2- (oder 33PO42- )

• Einbau radioaktiver Phosphatgruppen in metabolisch modifizierte Proteine

• Trennung im 2 D Gel (pI 4- 7) und

  Visualisierung im Autoradiogram

• Hohe Zahl an Phosphoproteinen (ca. 30%

  der Proteine werden phosphoryliert)

• Immunpräzipitation mit Acetyl- spezifischen Antikörpern

• Für acetylierte Peptide und Proteine anwendbar

• Detektion der Acetylierung durch MS Analyse oder Edman Abbau

• Acetylierung verkürzt Retensonszeit

• MS Signal wird durch Acetylgruppe verschoben