3. Analysemethoden

• X-Ray cristallography

• NMR

• cryo EM

  
  

• CD (circular dichroism)

• Struktur:

X-ray, NMR, cryo-EM

• Infos über spez. Anteil v. Proteinstruktur:

CD, UV-Vis, Fluoreszenz

1. Probenvorbereitung: Kristallisation

2. Beleuchtung Kristall mit Röntgenquelle (0,154 nm ≈ Länge kovalente Bindung)

3. Erfassung Beugungsmuster (mit Hilfe v. CCD)

   • Struktur v. Kristall steht in direkter Beziehung zu Beugungsmuster (Braggs Gesetzt beschreibt Beziehung zw. beiden)

   • Strahlen werden durch Atome im Kristall in versch. Richtungen gebeugt

   => Rückschließung auf Anordnung Atome im Kristall (Kristall besteht aus n-mal dem gleichen Protein -> Signal n-mal verstärkt)

4. Rückrechnung, bzw. Datenverarbeitung

   • Fourier Transformation: Rückrechnung Beugungsmuster in e- Dichtenkarte / 3D-Modell (je präziser e- Dichte-Verteilung, desto spez. Zeuteilung Atome)

5. Strukturverfeinerung

   • gute Strukturen haben R-Faktor (=Gütewert; Übereinstimmung zw. Beugungsmuster u. Modell) ab unter 2 Å (0,2 nm, 0,1-0,15 nm)

1. Probenvorbereitung:

   • hochkonz. Proteinlsg. meist mit ^13C und ^15N angereichert -> heteronukleare Messung

2. Erzeugungs NMR-Signal

   • Platzierung in starkes, homogenes Magnetfeld

   • Einstrahlung hochfrequente Radiowellen -> Anregung d. Spins in Atomkern (Proton) -> gehen in angeregten Zustand

   • Aufnahme Spektrum durch Messung Relaxation d. Spins in Grundzustände (abhängig v. chem. Umgebung & e- in Hülle)

     -> untersch. chem. Gruppen (H+,…) verursachen untersch. Resonanzfrequenzen -> chrakteristische chem. Verschiebung

• Untersuchung v. großen Makromolekülkomplexen (Enzyme, Capsidstrukturen,…) u. viralen Strukturen

• nützlich, wenn sich Proteine nicht gut kristallisieren lassen o. für NMR ungeeignet sind (zB wegen Mobiliät o. Polymerisationsrkt.)

• Untersuchung der Sekundärstruktur (Anteil an alpha-Helix, beta-Faltblatt) in Proteine

• Analyse von Konformationsänderungen und Proteinfaltung

• Untersuchung von Protein-Interaktionen

• Immunopräzipitationen (häufig in Kombination mit MS oder Co-Immunopräzipitation)

  -> Co: nicht nur Zielprotein, sondern auch assoziierten Proteine ("Interaktionspartner") mitzupräzipitieren —> ermöglicht Untersuchung von Protein-Interaktionen

α-Helices (höhere Intensität bei CD-Signal):

• neg. min.: ~207nm

• rel. min (Überang): ~222nm

• pos. max: ~192 nm

β-Faltblätter (schwächere Intensität u. breiteres Signal):

• max.: 195 nm

• min.: 215-220 nm

• Nein. Die CD-Spektrum nur Aufschluss über die Anteile der Sekundärstruktur (% α-Helices, β-Faltblätter und ungeordnete Strukturen) aber sie kann NICHT direkt die Sekundärstruktur einem bestimmten Abschnitt der Primärsequenz zuordnen

1. Xray

   Vorteil:

   -hochauflösend (Wellenlänge ~ 0,154 nm (ca. 1,5 Å) = Länge v. kovalenter Bindung) -> präzise Positionsbestimmung v. Atome in Protein

   Nachteil:

   -Kristallisation erforderlich

   -Starrheit (liefert nur Momentaufnahmen)

2. NMR

   Vorteil:

   -Proben in Lösung -> Zustand v. Proteinen näher an natürlichen Bedingungen/nativen Struktur

   -Untersuchung v. Dynamiken u. WW in Proteinen, bzw. Zuordnung benachbarter Atome

   Nachteil:

   -Größenbeschränkung (beschränkt auf <100 kDa)

   -hohe Konz. erforderlich (≈ 1mM)