Muller

a)

Positives delta S sagt, dass die Entropie in dem gefaltetem Protein größer ist, als im ungefalteten.

Unter der Bedingung, dass delta H negativ ist —> delta G ist negativ —> alles gut

Unter der Bedingung, dass delta H positiv ist, muss delta S * T größer sein als delta H —> delta G ist negativ —> alles gut

b)

• marginal stabil = kein großer Unterschied in Stabilität von gefalteten und ungefalteten Proteinen

  • ∆G ist klein, da [∆G = ∆H - T∆S]

    • ∆H -> groß

    • ∆S mit T multiplitiert -> groß

• wichtig für den Protein Turnover

• wichtig für dynamisches Verhalten von Proteinen

a)

• positiver ∆G-Wert sagt -> ∆G-Wert ist nach der Faltung höher als vor der Faltung

• dazu müssen ∆H positiv und ∆S negativ sein -> so kann die Entropie nicht durch die Enthalpie ausgeglichen werden -> es entsteht kein gefaltetes Protein

b)

• kleinste Veränderungen können zu Entfaltung führt -> Filligranes Gleichgewicht

a)

• wichtig für den Protein Turnover

• wichtig für dynamisches Verhalten von Proteinen

b)

• kleinste Veränderungen können zu Entfaltung führt -> Filligranes Gleichgewicht

a)

• Strukturerhalt trotz Mutationen -> sonst schnell Funktionsverlust von Proteinen

• Evolution von Proteinen -> zufällige Mutationen + Selektion

b) , c)

• genaue Sequenz des Inhibitors muss nicht bekannt sein

• durch andere Aminosäurezuammensetzung kann gleiches Ergebnis erziehlt werden

• wichtig zu wissen welche strukturellen Komponenten benötigt werden

• durch Computational design können Ligantenbindung an bekannten Protein backbone errechnet werden

Strukturveränderung eines Proteins, bei Beibehaltung von 50% Sequenzidentität

a)

• Faltung der DNA, um nanoskalierte Formen und Muster zu kreieren

• DNA-Origami nutzt einen langen Einzelstrang (das Gerüst) und viele kurze Einzelstränge (die "Klammern" oder "Staple Strands"), die sich komplementär an verschiedenen Stellen des Gerüstes binden

• Für den Einbau/Präsentierung von unterschiedlichen Rezeptoren in definierten Abständen und Geometrien in das DNA-Origami

a)

• Weil man weiß wie DNA-Basenpaarung funktioniert, und wie die Räumliche Anordnung dieser aussieht (Drehung)

  => Making educated guesses

b)

• Molekular evolution

  = generieren von Vielfalt + Selektion dieser + Phänotyp-Genotyp-Verknüpfung

  • Phage display

  • Ribosome display

  • Yeast two-hybrid

• Computational de novo Protein design

  => Trial and error

“Für das Phagendisplay von Peptiden und Antikörpern” und “the directed evolution of enzymes”

• benutzt für directed Evolution

1. Erstellen von Oligos, durch randomisierte Nukleotidkombinationen (Erzeugen von Vielfalt)

2. in Phagen einbringen -> exprimieren möglicher Proteine auf Oberfläche

3. Binden von gut passenen Proteinen an spezifisches Antigen (Selektion)

Hefedisplay:

• Hefe

• Bindung an zweiten Antikörper

• Sortierung durch FACS (Ladung)

Phagendisplay

• Phagen

• Bindung an immobilisierte Targets

• Sortierung nach runterwaschen + Screening

1. Erstellen von Antikörpern, welche vielfältige Bindestellen haben -> Bibliothek

   1. Erstellen durch Mutations-PCRs

   2. Durch B-Zellen -> erstellen sowieso Antikörpervielzahl

2. Einbringen der Bibilothek in Phagen (in p13-Protein)

3. Vermehrung der Phagen in E.coli

4. Phage expremiert und präsentiert Antikörper an Oberfläche

5. Binden von gut passenen Antikörpern an spezifisches Antigen -> waschen

   1. Vorgang kann wiederholt werden mit strengem waschen um besser zu selektieren

Natürliche Bibliotheken

• Gene von Pro-B Zellen und Naiven B-Zellen machen lassen

• in Phagen klonieren

Synthetische Bibliotheken

• künstliche DNA synthese

• in Phagen klonieren

Sowohl in Dispaly-techniken, als auch in der Evolution setzen sich die Proteine/Antikörper durch, die die beste Bindung zum Bindungspartner aufweisen

Natürliche Evolution:

• natürlicher Selektionsdruck

• Varianz durch zufällige Mutationen

• über lange Zeit hinweg

Displaytechniken:

• künstlich erzeugter Selektionsdruck

• Starker Selektionsdruck (wegwaschen von nicht bindenden Proteinen)

• Varianz durch gezielten unterschiedlichen Einbau verschiedener Basen

• schnell

Display-Techniken

Methode, die die Prinzipien der natürlichen Evolution im Labor nachahmt

1) Vielfalt erzeugen

2) Selektionsverfahren

3) Phänotyp-Genotyp Verknüpfung

alle Varianten an Aminosäuren in 6 Positionen?

• 3*6 = 18 verschiedene Basenpositionen

• 4^18 = 10^7 Varianten

alle Varianten an Aminosäuren in 7 Positionen?

• 3*7 = 21 verschiedene Basenpositionen

• 4^21 = 10^12 Varianten

Problem:

• Um alle Möglichkeiten und Interaktionen zu analysieren bedarf es zu vieler Variationen

• Diese sind unmöglich alle zu testen

• CDR besteht aus 65 Aminosäuren

  => 20^65 = 10^80 Variationen

• Reele größen sind ~10^8 - 10^12 Variationen

• Aus erkrankten könnte man Blutproben entnehmen und aus diesen die B-Zellen zu isolieren

• diese könnte man in Phagen einbringen

• SARS-Cov-2 Antigene könnten als Antigene für die Selektion eines Phagendisplays verwendet werden

• Fusionsprotein mit Aga2p, dem Protein of interest und einem c-myc tag

• Fusionsprotein wird extrazellulär präsentiert

• An das Protein of interest wird Interaktionspartner of interest gebunden mit antikörper 2 (oder halt auch nicht)

• Selektion via FACS (detektion der Antikörper und Sortierung über die Ladung)

1) Man nehme ein Enzym das bekannt ist, und eine ähnliche funktion hat, wie die, die man gerne hätte

2) man identifiziere eine “backbone” Struktur und eliminiere alle Seitenketten

3) man platziere den Liganden in die Mitte des Enzyms und ersetze die Seitenketten durch zufällige Aminosäureabfolgen in den verschiedenen Rotationszuständen

4) behalte die Seitenketten, die den Übergangszustand am besten stabilisieren (Global Minimum Energy Conformation (GMEC))

1) Man nehme ein Enzym das bekannt ist, und eine ähnliche funktion hat, wie die, die man gerne hätte

2) man identifiziere eine “backbone” Struktur und eliminiere alle Seitenketten

3) man platziere den Liganden in die Mitte des Enzyms und ersetze die Seitenketten durch zufällige Aminosäureabfolgen in den verschiedenen Rotationszuständen

4) behalte die Seitenketten, die den Übergangszustand am besten stabilisieren (Global Minimum Energy Conformation (GMEC))

Enzyme katalysieren Reaktionen, indem sie den Übergangszustand stabilisieren und somit die benötigte Energie für die Reaktion verringern

Alpha/beta-Propensities: Statistisches Maß für AS, die dazu neigen alpha-Helixes bzw beta-Faltblätter auszubilden

Janus-Protein ist eine Mischform von dem B1 und dem Rop-Protein

Ausgangsprotein war B1-Protein, und dann austauschen der AS mit beta-Faltblatt-Propensities zu alpha-Helixes-Propensities -> Mutieren Beta-Faltblatt-Strukturen zu Alpha-Helixes

(- IgG Antikörper-Proteine

- Affibodys

- Darpins)

-Antivirale Antikörper gegen:

• Spike Glycoprotein (MERS-CoV)

• Spike RBD (SARs-CoV)

-Antikörper gegen Darmkrebs (VEGF)

• VEGF = Angiogenesefaktor (Bildet neue Blutgefäße)

• Antikörper gegen VEGF

  => Gegen Darmkrebs und Makuladegeneration

Strukturvorhersage

• Startpunkt: Sequenz

• Endpunkt: Welche Struktur bekomm ich daraus?

Proteindesign

• Startpunkt: Gewünschte Struktur eines Proteins

• Endpunkt: Welche Equenz brauche ich für die gewünschte Struktur

=> Du fängst immer mit dem Startpunkt an, was die jeweils andere Methode herausfinden will

Strukturen sind mehr konserviert als Sequenzen

=> Ab einer Sequenzähnlichkeit von 20%, kann man von einer Strukturähnlichkeit ausgehen

Proteindesign

-viele Möglichkeiten, da man große Freiheit hat in der Sequenz, um trotzdem gleiche Struktur zu erhalten

-Theorietisch nicht nötig alle möglichen Sequenz-Möglichkeiten zu testen, um gewünschte Struktur zu erhalten

Natur/Evolution

-Wenn man durch kleine Sequenzunterschiede (durch Mutation) komplett unterschiedliche Struktur erhalten würde, dann gäbe es garkeinen Spielraum für Evolution etwas zu verändern

=> direkter Funktionsverlust/Tod durch nur kleine Mutation

Bibliothekengröße ist zu beschränkt, um alle Varianten eines Proteins zu erstellen

Alle Varianten würde viel viel zu lange dauern zu testen

=> “Nur” 10^8 bis 10^12 Varianten testbar

a) Natürliche Pro-B-Zellen machen durch Rekombination viele verschiedene Varianten von DNA für Antikörper für die daraus entstehenden B-Zellen

b) Durch künstliche DNA-Synthese Erstellung vieler verschiedener Varianten von DNA für Antikörper

Größere Entropie nach der Faltung

Mehr Möglichkeiten der Konformation des Proteins

=> Keine Spontane Faltung des Proteins

=> Muss gefaltet werden

Kleinere Entropie nach der Faltung

Weniger Möglichkeiten der Konformation des Proteins

=> Spontane Faltung des Proteins

Phagen-Display

• DNA wird hinter Transmembranprotein kloniert, von Phage in Protein umgesetzt und präsentiert

• Selektion über immobiles Target/Antigen

Puromycin-Display

• Hat eingebautes Pyromycin => Ribosom fällt da ab

• Selektion über immobiles Target/Antigen

Ribosomen-Display

• Translation ohne STOP-Codon => Gefaltetes Protein bleibt am Ribosom heften

• Selektion durch immobiles Target/Antigen

Hefen-Display

• DNA wird hinter Transmembranprotein kloniert, von Hefe in Protein umgesetzt und präsentiert

• Selektion über FACS