Biophysik

Ein interdisziplinäres Wissenschaftsfeld, das sich mit der Anwendung der Prinzipien und Methoden der Physik auf biologische Systeme befasst

Biologische Phänomene auf Grundlage physikalischer Gesetzeund modelle zu verstehen

1. Kinetische Mechanismen von potentiellen Wirkstoffen uuntersuchen

2. Beitrag zur Überprüfung publizierter Daten

3. Mechanistische Untersuchung zur Interaktion potentieller Wirkstoffmoleküle

4. Nutzung als orthogonale Methode zur Vermeidung von falsch positiven Hits aus anderen Screens

1. Dierekte Interaktionsmessung

2. Nutzen von physikalischen Methoden zur Untersuchung von molekularen Untersuchungen

• ka = Assoziazionskonstante = 1 / kd

• kd = Dissoziationskonstante

• kon = Assoziationsgeschwindigkeit

• koff = Dissoziatonsgeschwindigkeit

• kobs = KD = Affinität = kon/koff

• IC50 = Konzentration eines Inhibitors, bei der eine halbe Enzymaktivität erreicht ist

• Michaelis-Menten-Funktion mit Vmax- und Km-Wert

1. Falsche Lagerung der Proteine

2. Löslichkeit von Proteinen

3. Pipettierfehler

—> Zwiespalt immer zwischen Durchsatz und Qualität

1. HTS

2. Focused Screen

3. Fragment Screen

4. Structural aided drug Design

5. Virtual Screen

6. Physiogical Screen

• Merken: bei gleicher Affinität kann es trotzdem verschiedene Bindungsmechanismen geben

• z.B.: Compound 1: langsame Assoziation und langsame Dissoziation —> langsame aber lang anhaltende Wirkung

• z.B.: Compound 2: schnelle Assoziation und schnelle Dissoziantion —> schnelle aber kurzweilige Wirkung

• einfache Motive

  1. Wasserstoff-Brücken

  2. Ionische Interaktion

  3. Salz-Bindung

  4. Metall-Komplexe (z.B. bei Polymerase Mg)

  5. Hydrophobe Interaktion

  6. Aromatosche Interaktion

—> Wichtig: Einfluss des Puffers auf die Ineraktion (siehe Ladung der AS)

—> Blut pH = 7,4

—> die Interaktionskraft fällt

Wärmegehalt eines Systems H

Maß für Unordnung oder die Wahrscheinlichkeit eines Zustandes S

• Änderung der freien Enthalpie = Maß für Gleichgewicht

• Wärmefreisetzung = Energieaustausch

• Freisetzung von Wasser aus der Bindungstasche hat Einfluss auf die Eneregie

• Proteine sind sehr felxibel (Passform ist relevant für die Energie): Je mehrVeränderung nötig ist, wird mehr Energie aufgewendet, weil die Passform nicht ideal ist

• Affinität als zentralerBestandteil der Thermodynamik

• Gleichgewichtsparameter

• Assoziation und Dissoziation = Man kriegt kinetische Mechanismen der Interaktion = Einsicht der Wechselwirkung von Proteinen und Inibitor

—> KD = koff/kon => Ergibt die Affinität

—> Residence Time = 1/koff -> Halbwertszeit = 0,693/koff

• Die Diffusion begrenzt die Assoziationsgeschwindigkeit

• Mehr Moleküle erhöhen die Geschwindigkeit der Assoziation

• Vorteil gegenüber der Thermodynamik ist der Einblick in Mechanismen

Surface Plasmos Resonance —> zeigt Änderungen an der Oberfläche in einer bestimmten Zeit

Freie Elektronen in einer Goldschicht, die freien Stromfluss haben —> Resonanzerscheinung

Über Überströmung der Reaktionsspots kann die Interaktion an der Oberfläche gemessen werden

• Über SPR kann Kinetik gemessen werden

  1. Primäre Daten: Affinität KD, Assoziation ka und Dissoziation kd S

  2. Sekundäre Daten: Enthalpie (durch Variation der Temperatur) und Stöchiometrie (Abhängigkeit der Amplitude zum Molekulargewicht ist proportional)

Man muss chemische/kovalente Veränderungen zur Immobilisierung an der Dextranmatrix durchführen

Protein könnte sich verändern und deswegen eine andere Interaktion aufweisen, die Dynamik könnte sich verändern oder die Mobilität könnte eingeschränkt sein

über Temperaturvariationen

von pM bis mM —> auch für schwache Affinität

• Isothermal Titration Calorimetry

• Die spontane Reaktion von Molekülen führt zur Freisetzung von Energie in Form von Wärme, welche durch angelegten Strom ausgeglichen wird, um die freigesetzte Energie zu messen

• Die freigesetzte Wärme kann durch unterschiedliche Pufferbedingungen beeinflusst werden => typische Fehlerquelle

1. Beide Reaktionszellen haben einen gleichen Wärmefluss

2. Wärme wird durch eine Reaktion der Moleküle frei (Proben-Reaktionszelle)

3. Temperatur steigt im Vergleich zur Vergleichs-Zelle

4. Das Calorimeter detektiert die Veränderung und die Wärme der Proben-Zelle wurd reduziert, bis kein Unterschied mehr zur Vergleichs-Zelle vorliegt

5. Die aufzuwendende Energie lässt auf Reaktionsenergie schließen

• es werden Thermodynamische Daten erhoben

  1. Primäre Daten: Affinität Keq (Steigung), Enthalpie deltaH (Spikes), Stöchiometrie (Wechselpunkt kann an der Molar ratio abgelesen werden => ist dort 1 weil Reaktanten im gleichen Verhältnis stehen)

  2. Sekundäre Daten: Wärmekapazität und Ionisationswechsel

• Nachteile: der Durchsatz ist beschränkt und hoher Proteinverbrauch

• Vorteile: Keine Modifikation am Protein notwendig = lable-free und frei in Lösung

Die Untersuchung der Anordnung von Atomen in kristallinen Festkörpern, wobei typischerweise Röntgenbeugungstechniken (x-ray) verwendet werden, um die dreidimensionale Struktur von Molekülen auf atomarer Ebene zu untersuchen

1. Protein muss sehr rein sein

2. Saubere und uniforme/monodisperse Verteilung

3. Stabilität

Proteinkonstrukte mit viel Beweglichkeit nehmen nicht gerne stabile Konformationen ein

Über Diffusion wird das Wasser aus dem Proteintropfen in die Prezipitationslösung gezogen, was zur Konzentrationserhöhung der Proteine im Tropfen führt

• Stabilität und Art der Kristallisation ermitteln => welche Konstrukte sind stabil?

• Kristallisation soll erreicht werden

• Salze sind wichtig zum Präzipitieren

• Faktoren: Physikalisch (Temperatur, Zeit, Druck); Chemisch (pH, Ionen, Metallionen); Biochemisch (Reinheit, PTM, chem. Modifikationen)

• x-ray Strahlen kann mann nicht fokussieren und man erhält nur ein Streuungsmuster/Difraktionsbild => Intensitäten werden erhalten und man muss diese Daten erst umrechnen bevor man die Struktur erhält

• x-rays: Am Gitter wird der Rückstrahl gestreut und man dreht den Kristall in 1° Schritten und pro Winkel gibt es ein Difraktionsbild => Außen hohe Auflösung und innen niedrige Auflösung im Bild; In der Mitte ist die Nadel mit dem Kristall

• Größe und Dichte des Kristalls beeinflussen die Streuung

• Cryo-Elektronen-Mikroskopie

• Biologische Moleküle werden ultraschnell auf extrem niedrigen Temperaturen (<-150°C) schockgefroren, um die native Struktur zu erhalten und hochauflösende Bilder von Molekülen zu ermöglichen

• Moleküle sind nicht geordnet, wie in der Kristallstruktur, aber zeigen Struktur

• Suche im Bild nach Molekülen mit gleicher Orientierung

1. Elektronenstrahlen können fokussiert/refokussiert werden => hohe Auflösung und direktes Bild => Auflösung sogar für Moleküle kleiner als 200 kDa

2. Anforderung an das Protein sind nicht so hoch

3. Weniger Protein ist nötig und es können auch Protein-Komplexe dargestellt werden

4. Proben sind näher am physiologischen Zustand

5. Struktur von Membranproteinen darstellbar, was in Kristallographie nicht möglich ist

1. Cryo-EM dauert mehrere Wochen

2. Kristographie dauert nur Stunden