MG-8

• Konzentrationsgleichung = [Ak] + [Ag] <-> [Ak*Ag]

• Dissoziationskonstante: KD = [Ak] * [Ag] / [Ak*Ag]

• Definition von AG und AK:

  • [Ag] = [Ag]tot - [Ak*Ag]

  • [Ak] = [Ak]tot - [Ak*Ag]

• Annahme:

  • [Ak]_tot >> [Ak*Ag], d.h.

  • [Ak]_tot ≈ [Ak]

• Anteil Komplex:

  • [Ak*Ag] = [Ag]_tot * [AK]_tot / KD + [AK]_tot

• Paramter:

  • [Ak]: nicht gebundene Antikörper

  • [Ag]: nicht gebundene Antigene

  • [Ak]_tot: Gesamtkonzentration des Antikörpers bei dem jeweiligen Titrationsschritt

  • [Ag]_tot: Gesamtkonzentration des eingesetzten Antigens

  • [Ak*Ag]: Antikörper/Antigen-Komplexe

  • KD: Ak-Konzentration, bei der Komplex-Konzentration halbmaximal ist

• Microscale Thermophoresis

  • Fluoreszent markierte AK

  • Infrarot Laser -> warm

    • AK weg von Kegel -> weniger Floureszenz

  • Laser aus

    • AK wieder hin

  • —> je größer -> desto langsamer weg

• Fluoreszenztitration

  • Anregung von Tryptophan-Resten in Protein

    • geht nur wenn man das im Protein hat halt

  • je mehr Komplex -> desto weniger Fluorezenz (Quenching)

  • Vorteil: keine Markierung

  • Nachteil: nur für kleine Liganden

• Isothermische Titrationskalorimetrie

  • Komplexbildung -> Wärmeveränderung

  • Vorteil: keine Markierung und keine Immobilisierung

  • Nachteile:

    • relativ hohe Mengen an P/L notwendig

    • dauert lang

    • teuere Geräte

• KD = Kd/Ka

• Dissoziationsphase: (Pufferfluss, Trennung)

  • dPL/dt = -kd * PL

  • PL = R (SPR-Signal)

  • Integrierte Form: -> Kurvenanpassung -> Kd

    • R0 = SPR bei t0

    • Rt = SPR(t)

• Assoziationsphase: (Komplexbildung)

  • dPL/dt = ka * L * P – kd * PL

  • mit P = Ptot – PL:

    • dPL/dt = ka * L * (Ptot – PL) – kd * PL

  • Als SPR-Signal und L = Konstant nachgefüllt = C

    • dR / dt = ka * C * (Rmax – Rt) – kd * Rt

  • Integrierte Form: -> Kurvenanpassung -> Ka

• Tumor im lymphatischen System

• Therapie:

  • bispezifische AK (“künstliche”) -> 2 Bindestellen

    1. AG (tumorassoziert)

    2. Oberfläche immunologische Effektorzelle (NK-cell)

-> Kommt aus der Maus

• CDR-Grafting:

  • hypervariablen Schleifen (CDRs) von murin auf humanes Gerüst übertragen

• Resurfacing:

  • äußere Domäne durch menschliche AA ersetzen

  • innere bleiben gleich

Bispezifischer AK -> Quadrom-technologie

1. Immunisierung einer Maus mit AG1/AG2

2. Isolierung v. Milzzellen -> Fusion mit Myelomzelle -> Hybridomzelle

3. Selektion & Screening v. Hybridomzellen

4. Fusion von AG1-Hybridom/AG2-Hybridom -> Quadromzelle

5. Screening auf Quadromzelle

6. Herstellung bispezifischer AK -> Zellkultur

Probleme:

• humane Immunantwort auf muninen AK -> irgendwann nicht mehr einsetzbar

• Lösung: humanisierung (Gentechnik)

Planung der AS-Sequenz für die humanisierte Form:

1. Analyse der murinen variablen Domänen

   • CDR-Regionen finden

   • Konservierte AS-Reste finden

     • wichtig für

   • Kanonische Strukturen zu CDR zuweisen

     • müssen beibehalten werden

   • Vernier-Region:

     • Platform für CDR Schleifen

       • müssen identisch sein

2. DB -> Homologiesuche

   • finde humanes Gerüst die muriner ähnlich ist

3. murine CDR auf humanes Gerüst

4. Bestimmte AS in Gerüst die murin bleiben müssen

   • strukturell wichtig

5. AS-Sequenz -> DNA, Klonierung, Produktion

6. Analyse vom Affinitätsverlust