Biochemie

Ethanolische Gärung = Alkoholische Gärung

• von Saccharomyces cerevisiae durchgeführt

• dient dem anaeroben Glucose- Abbau im Cytoplasma von Hefen

Ablauf:

-> Glucose wird durch Glykolyse zu 2 Brenztraubensäuren/ Pyruvat abgebaut

• dabei werden 2 ADP + 2 Phosphat -> 2 ATP

-> Pyruvat durch Pyruvat Decarboxylasedecarboxyliert zu Acetaldehyd. Cofaktor: Thiamindiphosphat

-> Acetaldehyd reduziert zu Ethanol

• 2 NADH + 2H+ werden dabei zu 2 NAD+

• Das Cytoplasma eukaryotischer Zellen ist von einem dreidimensionalen Gerüstsystem aus Filamenten (Fasern) durchzogen. Dieses Cytoskelett deint dazu, die Form der Zellen aufrechtzuerhalten, die Position der Organellen zu fixieren, Moleküle und Aggregate in der Zelle zu transportieren und die Zelle zu bewegen.

• man teilt die Filamente nach ihrem Durchmesser in 3 Gruppen ein:

  • die dünnen Mikrofilamente (7-9nm)

  • die Intermediärfilamente (10-12nm)

  • und die dicken Mikrotubuli (ca. 25nm)

• alle Filamente sind Polymere aus typischen Proteinbausteinen. Sie sind mit weiteren Proteinen assoziiert.

Aktinfilamente:

• Actin, das häufigste Protein in eukaryotischen Zellen, ist der Proteinbaustein der Mikrofilamente (Actinfilamente).

• Actin kommt als monomolekulares globuläres G- Actin und als polymeres filamentöses F- Actin vor.

• G- Actin ist ein relativ kleines asymmetrisches Protein (42 kDa). Es kann reversibel zu dem helikalen F- Actin polymerisieren. Dieser Vorgang wird durch ATP gefördert, denn G- Actin trägt ein ATP- Molekül, das im F- Actin langsam zu ADP hydrolysiert wird. Diese ATPase- Aktivität verleiht dem Actin Enzymeigenschaften!

• da sich einzelne G- Actin- Moleküle immer in derselben Richtung aneinander lagern, zeigt auch das F- Actin Polarität!

  -> es hat 2 Enden, an denen die Polymerisation unterschiedlich schnell abläuft. Sind die Enden nicht- wie in Muskelzellen- durch besondere Proteine stabilisiert, wächst das (+)- Ende des F- Actins bei einer kritischen Konzentration des G- Actins ständig, während das (-)- Ende gleichzeitig zerfällt. =>treadmilling

• mit Pilzgiften kann man diese Teilprozesse blockieren! Phalloidin, ein Gift des Knollenblätterpilzes, hemmt durch Bindung an das (-)-Ende den Zerfall!

• Dagegen blockiert Cytochalasine durch Bindung an das (+)- Ende die Polymerisation.

• Actin-assoziierte Proteine

  • im Cytoplasma findet man mehr als 50 verschiedene Proteine, die spezifisch an G- und F- Actin binden. Die Anlagerung an Actin erfüllt vielfältige Aufgaben:

    -> sie kann der Kontrolle des Pools von G- Actin dienen (Bsp. Profilin)

    -> die Polymerisationsgeschwindigkeit des G- Actins beeinflussen (Villin), die Kettenenden von F- Actin stabilisieren (Fragin, beta- Actinin), die Filamente untereinander oder mit anderen Zellkomponenten verbinden (Villin, alpha-Actinin, Spectrin) oder die Helix- Struktur von F- Actin zerstören (Gelsolin).

  -> Diese Proteine werden durch Protein- Kinase gesteuert.

= Energiegewinnung durch den Aufbau organischer Stoffe durch Oxidation anorganischer Stoffe aus der Umwelt.

• zur Energiegewinnung bei chemolithoautotrophen Bakterien

  -> Schwefel, Eisen und nitrifizierende Bakterien

• machen autotrophe Kohlenstoff- Assimilation über Calvin- Zyklus.

• Gewinnung von ATP und NADPH + H+

  = Energiespeicher, Stoffwechselvorgänge, Calvin- Zyklus, etc.

• Energiegewinnende Prozesse:

  • Eisenbakterien:

• 
  

  • nitrifizierende Bakterien

    • bsp. Nitrosomonas, Nitrobacter

  -> oxidation von Ammoniak über Nitrit zu Nitrat

  • Schwefelbakterien

  -> Thiosulfat o.a. Schwefelverbindungen oxidieren zu elementaren Schwefel oder Sulfat.

  • oft von elementaren Schwefel zu Sulfat

• Phosphatidyl mit Glycerin- Rückgrat

• Sphingomyelin mit Sphingosin- Rückgrat

  -> mittlere OH- Gruppe des Glycerins durch NH2- Gruppe ersetzt und mit FS substituiert. letzter Alkohol freistehend, nicht verestert

  -> zweite FS entfällt, da Sphingosin selbst hydrophoben Schwanz hat

  • ungesättigt C15 vom Alkohol- C bzw. C18

AK/ AG:

• Protein- Protein- WW

• KEINE Cofaktoren- Abhängigkeit

• Bindung erfolgt anhand der gegebenen Struktur des Antigens

• resultiert: in Chemotaxis

• Spezifität kann bei kontinuierlichen Epitopen auch nach Denaturierung des gesamten AK noch gegeben sein, da lineare- Struktur zur Affinität führt.

  • bei diskontinuierlichen Epitopen NICHT, da hier Tertiärstruktur dessen Affinität bestimmt

Enzym/ Substrat:

• nicht zwangsläufig Protein- Protein- WW, auch small- molekuls möglich

• kann auf Cofaktoren angewiesen sein

• Bindung erfolgt anhand der Anpassung an Übergangszustand

• resultiert: in Umsetzung des Substrates

• Spezifität ist nach Denaturierung nicht mehr gegeben.

1. H- Brücken

2. hydrophobe WW bzw. hydrophobe Effekte

   • führt zur entropiezunahme des Wassers

3. van-der-Waals WW

   • permanente und induzierte (London)

4. ionische/ elektrostatische WW

   • Coulomb

Endozytose = internalisierung in die Zelle durch Vesikelbildung

1. Rezeptor- Endozytose

   • z.B. Rezeptordichten- Abbau bei Gewöhnungseffekt / Sucht

2. Rezeptor- vermittelte Endozytose

   • z.B. LDL- Rezeptor vermittelte LDL Endocytose mit Clathrin

3. Antigen- Endozytose im Rahmen der Antigenprozessierung durch antigenpräsentierende- Zellen bei Immunantwort

• konstitutive Sekretion/ Exocytose:

  • “default pathway”

  • Transport von Proteinen weg vom trans- Golgi zur direkten Sekretion oder z.B. Bau der Membran

    • Massenfluss als Standard

• regulierte Sekretion/ Exocytose:

  • Speicherung der Proteine in Vesikeln, Ausschüttung erst nach Signal

• Dehydrogenasen (=Oxidoreduktasen)

  • Glykolyse, Pyruvat- Dehydrogenase, Gluconeogenese, Citratzyklus, Atmungskette

  • Laktat- Dehydrogenase im Cori- Zyklus

  • Pyruvat- Dehydrogenase zwischen Glykolyse und Citratzyklus

  • Malat- Dehydrogenase in Gluconeogenese

  • alpha- Ketoglutarat- Dehydrogenase im Citratzyklus

als Hydrid- Ion

• dadurch wird positive Ladung des NAD+ ausgeglichen

  -> NADH selbst ist neutral

  -> NADH + H+ dann positiv

• UV- spektroskopisch bei 340 nm (zusätzliches Absorptionsmaximum von NADH)

  • Abnahme von NAD+ (ca. 265nm) = Zunahme von NADH- Peak (340nm)

    -> Zunahme von NAD+ = Abnahme von NADH- Peak

• Interessant wenn NAD+ / NADH + H+ Beteiligung bekannt (Oxidoreduktasen!) ABER Analyt nicht direkt nachweisbar

-> optische Nachweismethode ohne Einfluss auf Reaktion selbst.

-> bei einem Molekül Acetyl- CoA

• 3 NADH + H+

• 2 CO2

• GTP

• FADH2

-> bei einem Molekül Glucose:

• 2 Moleküle Pyruvat bzw. Acetyl- CoA

-> Glucose vom Darmlumen in Enterozyten:

• Symport: SGLT1 an apikaler Seite des Enterozyten (sodium- glucose- linked transporter 1)

• Antiport: Na+/K+ -ATPase gekoppelt (entgegen dem Konzentrationsgradienten!)

-> von Enterozyten ins Interstitium:

• Uniport: GLUT2 an basolateraler Membran, diffusionsgetrieben, d.h. passiv

GLUT4 Besonderheiten:

• Insulin- abhängig:

  • mehr GLUT4 wird in Membran eingebaut, wenn BZ hoch!

• Clathrin- getriebene Endozythose bei sinkendem BZ

• v.a. in Muskel- und Fettgewebe

• deutlich höhere Glucose- Affinität (ca. 30- fach) als andere Subtypen

• bei Insulinresistenz (absolut/ relativ) weniger Rezeptoren an Zellmembran und somit weniger/ keine Glucoseaufnahme und hoher BZ

  -> Hyperglykämie

• UV/ Vis- Spektroskopie

• molarer Absorptionskoeffizient E

  • [l/mol*cm]

• MS (?)

• Molekülmasse(?)

• verschiebung des Absorptionsmaximums von 465nm auf 595nm durch Komplexierung des unprotonierten Farbstoffes (Coomassie Blue) mit Enzym.

  -> blau

• bildet Komplexe mit den apolaren Seitenketten der Aminosäuren des Peptids vor allem Arginin interagiert auch mit basischen/ kationischen Seitenketten

  -> Sulfonylgruppen sind deprotoniert

• BSA- Eichkurve mit bekannten BSA- Konzentrationen

  -> [Leerwert mit NaOH (1N)]

• MS

• ELISA

• Bradford- Assay

• Biuret- Methode

• Lowry- Methode

• BCA- Methode (Binchinonsäure)

-> Grundprinzip: Inkubation des Proteins mit dem farbgebenden Komplex. Verfärbung wird mit Eichlösung verglichen.

• Blutplasma = Blutserum + Fibrinogen

• Blutplasma:

  • flüssiger Blutbestandteil ohne den Hämatokrit

    • Elektrolyte (Na+, Cl-, K+, Ca2+, Mg2+, Bikarbonat, Phosphate)

    • Plasmaproteine (Albumine, Lipoproteine, Immunglobuline, Fibrinogen)

    • Nährstoffe (z.B. Glukose, Lipide)

    • organische Säuren (z.B. Laktat, Pyruvat, Citrat)

    • Abbauprodukte der diversen Stoffwechselwege (Kreatinin, Kreatin, Harnsäure)

    • Hormone (Signalmoleküle)

• Blutserum:

  • Blutplasma, das von Fibrinogen befreit wurde

  • darüber hinaus ist seine Zusammensetzung mit der des Blutplasma identisch

  • enthält noch einige Bestandteile der Blutgerinnung in aktiver Form, bspw.:

    • Thrombin

    • alle anderen Plasmaproteine

• Serum:

  • 91% Wasser

  • 7% Proteine:

    • Albumin, ca. 62%

    • alpha1- Globuline, ca. 3%

    • alpha2- Globulin, ca. 7%

    • beta- Globuline, ca. 9%

    • gamma- Globulin, ca. 17%

    • 2% Elektrolyte und Nährstoffe, sowie anderen kleinmolekularen Substanzen

-> Erythrozyten:

• Sauerstofftransport (über Hämoglobin)

• gebildet im Knochenmark

-> Thrombozyten:

• Blutgerinnung/ Koagulation

• gebildet im Knochenmark

-> Leukozyten:

• Immunantwort

• gebildet im Knochenmark

Top- Down:

• MS mit intaktem Protein

• liefert Fragment- Ionen des Proteins

Bottom- Up:

• MS mit proteolytisch verdautem Protein

• in-gel oder in-solution digestion vor MS

• liefert Fragment- Ionen der Peptide

Post Source Decay:

• Art der Fragmentierung bei MALDI- TOF (vgl. in- Source Decay bei MALDI: direkte Fragmentierung in der Ionisationsquelle)

  -> Zerfall metastabiler Analyten in Driftstrecke (durch Reflektor verlängert) bei Beschleunigung nach der Ionisationsquelle

  -> Vorselektion des gewünschten Mutterpeaks und anschließende Fragmentierung

Protein mit Disulfidbrücken mittels MS/MS analysieren, anschließend:

• Disulfidbrücken reduzieren mittels DTT (Dithiothreitol)

• Alkylierung mit Iodacetamid (Peak-Molmasse steigt um die Masse von Acetamid-H+)

• Trypsin- Verdau

• Verdau-Stop mit TFA (Trifluoressigsäure)

• erneute Analyse mittels ESI-qTOF-MS/MS

  • gut nach trypischem Verdau, da positiv ionisierbare C- Termini entstehen, die einfach zu detektieren sind

oder

• Chymotrypsin- Verdau

• Reduktion mittels DTT

Michaelis- Menten- Diagramm:

• im Versuch: v0 [1/s] gegen Substratkonzentration [mM]

• nichtlinear

• hyperbolische Kurve

• asymptotische Annäherung an Sättigungsbereich

Linweaver Burk:

• 1/v0 [1/s] gegen 1/Substratkonzentration [1/mM]

• doppelt reziproke Auftragung

-> Enzym C hat die höchste katalytische Effizienz.

• Michaelis- Menten- Konstante: Km = niedrig

  • d.h. ist nur eine geringe Konzentration nötig, um halbmaximale Geschwindigkeit der Umsetzung zu erreichen

• Wechselzahl kcat am höchsten

• Katalytische Effizienz = kcat / Km

  -> je höher kcat und je kleiner Km, desto höher die katalytische Effizienz

-> die Sättigungsfraktion Ys ist als Funktion des O2- Partialdrucks dargestellt

-> sigmoidale O2- Dissoziationskurve des Hämoglobiins im vgl. mit der hyperbolischen Kurve des Myoglobins

• Hämoglobin ist bei niedrigem Sauerstoffgehalt des Blutes wenig gesättigt, bei hohem dann allerdings hoch gesättigt.

• Myoglobin dagegen bereits bei niedrigem O2- Partialdruck hoch gesättigt.

-> Diese Kombination ermöglicht den Übertrag von Sauerstoff, von Hämoglobin auf Myoglobin im vorerst hypoxischen Muskelgewebe.

• das O2- Bindungsvermögen von Hämoglobin ist in diesem Gewebe stark herabgesetzt, während das Myoglobin bereits ein starkes Aufnahmevermögen zeigt.

• so bleibt der Sauerstoff in der Muskelzelle und wird nicht wieder abtransportiert!

• das Hämoglobin kann dann ungesättigt wieder in Richtung Lungenkapillaren geführt und erneut gesättigt werden.

• Hämoglobin ist Tetramer, bestehend aus 2 alpha und 2 beta Subunits

• jede Subunit mit einem Häm, jedes Häm über Histidin an Proteinmatrix gebunden

• tense- und relaxed- Zustand (T und R) des Netzwerkes an ionischen Bindungen der C- terminalen Reste aller Untereinheiten

-> Mechanismus der O2- induzierten Konformationsänderung

• die Bindung von O2 an die freie Koordinationsstelle des Fe2+- Atoms zieht dieses in die Ebene des Hämrings

• der proximale Histidinrest wird mitbezogen und über den Hebel der F- Helix wird die beobachtete Konformationsänderung in Gang gesetzt.

Paradigma des kooperativen Verhaltens:

• die Bindung von Liganden führt zu zunehmenden lokalen Konformationsänderungen

• die noch unbesetzte, benachbarte Untereinheit wird in ihrer Ligandenaffinität verändert

• T- und R- Zustand von Hämoglobin stehen im GGW

• in Abwesenheit des Liganden dominiert der niederaffine T- Zustand

• spontane Übergänge in den hochaffinen R- Zustand sind nur selten möglich

• die Bindung eines Liganden an wenigstens eine UE macht die allosterische Translation des gesamten Tetramers in den R- Zustand wahrscheinlich

Unterschied:

• im Sequenzmodell gibt es 5 verschiedene Zustände, die sich in ihrer Affinität unterscheiden und aufeinander folgen.

• im Symmetriemodell gibt es 2 Zustände. Das Gleichgewicht wird vom umgebenen O2- Angebot bestimmt.

=> von verschiedenen Genen codierte Enzyme, die die gleiche biochemische Reaktion katalysieren.

Sie unterscheiden sich:

• Primärsequenz

• der Art ihrer Regulierung

• ihrem Vorkommen in Geweben

• katalytischen Eigenschaften (Km, vmax, pH-Optimum, Wechselzahl)

• physikalische Eigenschaften (isoelektrischer Punkt. Molekulargewicht, Denaturierungstemperatur)

-> Aufgrund ihrer Gewebsspezifität können Rückschlüsse auf den Status des Gewebes gezogen werden, v.a. bei Schädigung der Gewebszellen.

-> Lactose: Disaccharid aus beta-D-Galactose und alpha/beta-D-Glucose

-> Epimere und Anomere (=Diastereomere, also keine Enantiomere!)

• Als Anomere (grich. = oben) bezeichnet man jene Epimere, die bei der Bildung eines ringförmigen Halbacetals (Ring-Ketten-Tautomerie) von Kohlenhydraten (Aldosen und Ketosen) neu entstehen.

• das anomere Zentrum ist das Chiralitätszentrum, das aus dem prochiralen Carbonyl-Kohlenstoffatom der offenkettigen Form entsteht.

• Es ist dem Ringsauerstoff von Zuckern ( in der Pyranose- oder Furanose- Form) benachbart.

• die beiden gebildeten Anomere sind keine Enantiomere, sondern Diastereomere mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften.

Lactose

• beta-Galactose + alpha/beta- Glucose

• beta-1,4-glycosidische Bindung

Saccharose:

• Glucose + Fructose

• alpha,beta-1,2-glycosidische Bindung

Maltose:

• Glucose + Glucose

• alpha-1,4- glykosidische Bindung

• Konkurrenzenzyme in Glykolyse und Gluconeogenese:

  => Fructose-6-phosphat <-> Fructose-1,6-bisphosphat

reziproke Regulation:

• Phosphofructokinase:

  • + Insulin, AMP

  • - Glukagon, Citrat

• Fructose-1,6-Bisphosphatase:

  • + Glukagon, Citrat

  • - Insulin, AMP

Funktion:

• Wenn bei hoher Glucosekonzentration viel Glucose -> Fructose-6-phosphat umgesetzt wird muss die Phosphofructokinase aktiv werden.

  -> hohe Blutglucosekonzentration resultiert in Insulinreaktion, um die Glucose in die Zellen befördern zu können

  -> Entsprechend stimuliert Insulin die Phosphofructokinase, damit die Glucose im weiteren auch abgebaut wird.

• Umgekehrt wird die Fructose-1,6-Bisphosphatase bei einem Glucosemangel, d.h. niedrigerem BZ aktiv, um in der Gluconeogenese mehr Glucose zu synthetisieren. Dies wird durch Glukagon induziert.

  -> Entsprechend stimuliert Glukagon die Fruktose-1,6-Bisphosphatase.

=> da Insulin und Glucagon antagonistisch agieren, hemmen sie die Reaktion, die vom jeweils anderen stimuliert wird.

• darüber hinaus, findet sich eine Regulation durch den Energiestatus der Zelle, d.h. durch die AMP- Konzentration, die hoch ist, wenn wenig ATP gebildet wurde, der Energiestatus also gering ist.

  • dann muss die Glykolyse vermehrt stattfinden und die Phosphofructokinase ist aktiv.

• Umgekehrt bewirkt eine hohe AMP-Konzentration die Inhibition von Fructose-1,6-Bisphosphatase.

=> auch das aus Pyruvat gebildete Citrat wirkt regulatorisch auf die Enzyme.

• ist noch nicht viel Citrat aus dem Glykolyseprodukt Pyruvat entstanden, wird die Glykolyse, hier stellvertretend die Phosphofructokinase, stimuliert.

• liegt nach intensiv betriebener Glykolyse bereits viel Citrat vor, wird die Fructose-1,6-Bisphosphatase stimuliert.

1. Aceton, Acetoacetat, beta-Hydroxybutyrat

1. Wo:

• Ketonkörper werden egbildet, um den Energiebedarf bei fehlender Glykolyse durch beta- Oxidation der Lipide zu decken. Dabei entsteht vermehrt Acetyl-CoA, das nur teilweise (und unter aeroben Bedingungen) im Citratzyklus und der oxidativen Phosphorylierung (Atmungskette) verwendet werden kann.

• Durch Ketonkörpersynthese entstehen Verbindungen, die respiratorisch eliminiert werden können, um dem Überschuss an Acetyl-CoA zu entfliehen, sowie Reduktionsäquivalente in Form von NAD+, die für den Citratzyklus benötigt werden.

1. in Mitochondrien der Hepatozyten

-> Wenn der Citratzyklus nicht ablaufen kann, zB bei:

• fehlendem NAD+

• anaerobem Zustand der Zelle

• fehlender Pyruvat- Zufuhr durch Glykolyse und Pyruvat- Dehydrogenase- Komplex

• fehlender Auffüllung durch anaplerotischer Reaktion, v.a. AS- Mangel

=> zyklischer Abbau der Peptidkette startet am N- Terminus

-> Detektion mittels HPLC

1. Namen:

• Kopplung mit PITC (Phenylisothiocyanat) an freien N- Terminus -> PTC- Peptid (Phenylthiocarbamyl-Peptid)

• Spaltung durch nukleophilen Angriff des S aus Carbonyl-O zu ATZ-AS (Anilinthiazolinon- AS)

• Konvertierung/ Umlagerung der instabilen ATZ-AS in wässriger Säure und erhöhter Temp. zur stabilen PTH-AS (Phenylthiohydantoin-AS)

1. PITC (Phenylisothiocyanat)

• Rezeptoren an Membran -> Signaltransduktion

• Vesikel- Transport

• Integrine

• heterodimere Transmembranproteine

• cytoplasmatische Domäne interagiert mit Komponenten des Cytoskeletts

• extrazellulärer Teil bindet die carboxylterminale Hälfte der Laminine

• somit besteht durch die Integrin- Laminin- WW ein mechanischer Kontakt zwischen Zellinnerem und ECM

• Mikrotubulli: alpha und beta Tubulin

• Mikrofilamente: Actin

• Intermediärfilamente

-> besteht aus Cholin über Phosphodiesterbindung an Glycerin gebunden

• Phospholipid, genauer Phosphoglycerid, genauer Phosphatidylcholin

= 2 Ölsäureester.

• L- AS

• D- Kohlenhydrate

-> wichtig aufgrund der Enzymspezifität

• Glykolyse: ADP/ATP ; NAD+/NADH + H+

• Glykogensynthese: UTP/UDP

  • ausgehend von Glucose-6- Phosphat

• Gluconeogenese: ATP/ADP ; NADH + H+/NAD+

• Harnstoffzyklus: ATP/ADP/AMP

• Citratzyklus: GDP/GTP ; FAD/FADH2 ; NAD+/NADH + H+

• Glykogen

• FS (Lipide)

• AS (Proteine)

• durch Tranport von positiv geladenen Protonen über eine Membran entsteht ein chemiosmotischer Gradient, der letzlich durch Wiedereinstrom der Protonen Energie freisetzt, die ausreicht, um den Energiebedarf einiger Enyme zu decken.

• Bspw. wird die bei der oxidativen Phosphorylierung (Atmungskette) eine zentrale Rolle tragende ATP- Synthase durch eine protonenmotorische Kraft angetrieben.

• die Protonen werden in mehreren Schritten über die innere Mitochondrienmembran herausgeschleust, sodass ein elektrochemischer Gradient entsteht.

• beim späteren enzymatischen Ausgleich dieses Gradienten mittels Komplex V entsteht Energie (hier in Drehbewegung umgesetzt), die von einem anderen Teil desselben Enzymkomplexes genutzt wird, um ADP + Pi -> ATP zu phosphorylieren.

-> am Ende wirken lipophile, schwache Säuren als Entkoppler, die die Membran für die Protonen durchlässig macht und den Prozess des Ladungsausgleiches von der ATP- Synthese entkoppelt. Die frei werdende Energie wird als Wärme abgegeben.

-> Mit entsprechenden Proteinen statt Säuren funktioniert braunes- Fettgewebe!

ein hochreguliertes Enzym, das aufgrund seines verhältnismäßig langsamen Umsatzes oftmals den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt eines Stoffwechselweges darstellt.

Ihre Substrate sind oftmals Metabolite, die Ausgangsstoffe mehrerer Stoffwechselwege, d.h. die Enzyme befinden sich an Knotenpunkten dieser.

->Schlüsselenzym der Glykogensynthese ist die Glykogen- Synthase.

• sie wird durch Dephosphorylierung aktiviert bzw. durch Phosphorylierung inaktiviert!

  -> aktivierte Form: a- Form

  -> allosterisch- regulierte Form: b- Form

• UDP- Glucose -> Glykogen + UDP

• die aktivierte a- Form wird durch Insulin stimuliert.

• wenn der BZ hoch ist und Insulin ausgeschüttet wird, um die Blutglucose in die Zelle aufzunehmen und abzubauen, wird auch die Glykogen- Synthase stimuliert, da auch auf diesem Wege die Glucosekonzentration durch Bildung von der Glucose- Speichereinheit Glykogen herabgesetzt werden kann.

• Letztlich wird die Glykogen- Synthese (bzw. dessen Abbau) vom Energiestatus der Zelle gesteuert, indem die inaktive b- Form stimuliert/ gehemmt wird

• Wenn der ATP- Spiegel hoch ist, müssen keine Energiereserven mobilisiert werden und überschüssige Glucose bzw. Glucose-6- phosphat kann zu Glykogen umgesetzt werden.

• die b- Form wird hierbei in einen partiell aktivierten Zustand versetzt.

• wenn hingegen der AMP- Spiegel hoch ist, müssen Energiereserven durch Glykogenolyse mobilisiert werden, d.h. ide Glykogensynthese darf nicht stattfinden und die b- Form muss komplett in ihrer Aktivität gehemmt werden.

Reziproke Regulation:

• Glykogen- Synthase und Glykogen- Phosphorylase durch Insulin und Glucagon

• von Proeitnkinase A und Prtoenphosphatase I, die die Glykogen- Synthase (de-phosphorylieren und in die a- bzw. b- Form überführen.

-> Glucogen- Phosphorylase

• Glykogen + Phosphat -> Glucose-1-phosphat

Summary:

= Bindung -> GDP/GTP- Austausch -> Dissoziation -> AC -> ATP/cAMP -> PKA

1. Bindung von Glucagon an den Glucagon- Rezeptor (ein GPCR), kommt zur dessen Konformationsänderung

2. Dissoziation von alpha-beta-gamma in -> alpha und beta-gamma Einheiten durch Austausch von GDP zu GTP in der alpha- Einheit

3. durch GTP aktivierte alpha- Einheit migriert zu Adenylatcyclase (AC) und aktiviert diese, sodass ATP zu cAMP umgesetzt wird.

4. cAMP dient als second messenger und aktiviert die Proteinkinase A (PKA), indem der regulatorische Teil abgespalten wird

5. aktivierte PKA passiert die Zellmembran und kann nun Transkriptionsfaktoren phosphorylieren

6. Genexpression (Transkription, Translation)

• An der intrazellulären Domäne des GPCR.

• Sie bindet im Grundzustand GDP, sodass die alpha-beta-gamma -Einheit dort verbleibt.

  -> Erst der Austausch mit GTP lässt die Untereinheit dissoziieren und zu ihren Wirkorten migrieren.

• Peptid- und Proteohormone stellen die größte Gruppe von interzellulären Signalstoffen dar.

• man unterscheidet Neurohormone, glandotrope Hormone, Peptidhormone sowie Cytokine.

• Die Übergänge zwischen den einzelnen Kategorien sind fließend.

• die aktive Form dieser Hormone entsteht häufig durch proteolytische Prozessierung.

• dabei werden aus einem Polyprotein mehrere aktive Hormone hydrolysiert.

• die Zelltypen bestimmen dann, welche Folgemetaboliten enstehen.

• so kann ein Polyprotein mehrere, unterschiedliche Effekte an verschiedenen Orten bewirken.

• Verdauungspeptidasen

• Gerinnungsfaktoren

• Apotose

• POMC (Pro-Opiomelanocortin)

• Somatotropin

• Glukagon

• Insulin

• Ubiquitinylierung

• Posttranslationale Modifikationen

und

• Antigenprozessierung: Antigen wird hydrolytisch prozessiert und ein Teil als “präsentierbares” Peptid an den MHC- Komplex gebunden und an die Lymphozyten- Membran transportiert.

  -> so funktioniert die Antigenpräsentation antigenpräsentierender Zellen (B- Lymphozyten und dendritische Zellen)

=> Apoptose ist der gewollte Zelltod.

• dadurch entsteht keine sichtbare Veränderung, da idR neue Zellen die alten apoptoischen Zellen ersetzen.

=> Nekrose bezeichnet das ungewollte Absterben von Zellen.

• es entstehen Funktionsstörungen, da keine neuen Zellen in ausreichender Geschwindigkeit und Anzahl gebildet werden können, da ein pathophysiologischer Zustand besteht.

• der Zellverbund ist gestört, nicht schlüssig und entsprechend anfällig für Invasion

  -> was anfänglich durch rötlich bis livide gefärbte und später durch schwarze, faulige Gewebe erkennen lässt.

Verhindern Superspiralisierung bei Trennung der DNA- Einzelstränge durch die Helikase bei der Replikation.

Klasse 1: ohne ATP- Verbrauch -> Einzelstrangbruch

Klasse 2: mit ATP- Verbrauch -> Doppelstrangbruch

1. DNA- bindende Proteine schaffen Platform für…

2. … die Helicase: ATP-abhängige Spaltung des Doppelstranges

3. SSB- Proteine (single strand binding proteins) verhindern Reassoziation

4. Topoisomerasen verhindern Superspiralisation

5. Primase synthetisiert RNA- Primer bzw. Okazaki- Fragmente am Folgestrang

-> Polymerase synthetisiert den Komplementärstrang von 5` nach 3`

IgA (Dimer), IgD, IgE, IgG, IgM (Pentamer)

• Stellvertretend: IgG- AK:

  • y- Form

  • Stamm: C- Termini der 2 schweren Ketten mit fc- Teil

  • V- Teil: N- Termini aller vier Ketten mit fab- Teil bzw. Paratopen

  • 4 Ketten: 2 leichte Ketten, 2 schwere Ketten

  • jede Kette jeweils ein variabler Teil und ein konstanter Teil

  • hypervariable Region in der fab- Region, bestehend aus variablen Teil aller 4 Ketten

  • 4 Disulfidbrücken: je eine verbindet leichte Kette mit schwerer Kette auf jeder Seite, 2 weitere verbinden an hinge- Region die schweren Ketten miteinander.

-> aus B- Lymphozyten von Kaninchen und Ziege

• polyklonale und monoklonale AK

• BSA wird als Blockierungsmittel genutzt, um die Sensivität zu erhöhen und niederaffine Bindungen der AK mit der Mikrotiter- Platte zu unterdrücken.

a) 1 Unit

b) LDH1 = 1U ; LDH2 = 2U

G-Protein- Inaktivierung:

• intrinsische GTPase- Aktivität der alpha- Einheit durch GAP- Unterstützung (GTPase- aktivierende Proteine)

G-alpha i- gekoppelte Signalwege:

• Inaktivierung der AC, somit kein bzw. weniger cAMP

homologe Desenitivierung:

• da von eigener beta-gamma- Einheit induziert: Rezeptordesensitivierung mittels Arrestin

  • GRK- G- Protein- Rezeptor- spezifische Kinase wird durch beta-gamma- Einheit aktiviert und Phosphoryliert Serin- und Threoninreste am GPCR, sodass Arrestin- Bindungstasche zugänglich wird, dann Clathrin

heterologe Desensitivierung:

• da von PKA induziert: PKA phosphoryliert GPCR, sodass Arrestin- Bindungstasche zugänglich wird

cAMP- Phosphodiesterase:

• cAMP- Abbau durch cAMP- Phosphodiesterase: Hydrolyse von cAMP zu AMP + H+

Proteinphosphatasen:

• dephosphorylieren Effektorproteine, die zuvor durch PKA aktiviert wurden

• Flavin- Adenin- Dinukleotid

• Pyruvat- Dehydrogenase- Komplex, Citratzyklus, Atmungskette, beta-Oxidation

• TATA- Box: ist eine DNA- Sequenz in der Promototr- Region eukaryotischer Gene, Konsensus- Sequenz 5´-TATAAA-3´ Sequenz

  • meist 25-30 bp vor dem Startpunkt der Transkription

• an der Sequenz bindet TBP (TATA box- binding protein)

  • bewirkt eine massive Verzerrung der DNA- Struktur

  • induziert eine Biegung von ca 90° und entwindet 1/3 einer DNA- Helixwindung.

Struktur der alpha- Helix:

• eine Peptidkette

• kontinuierliche Sequenz

• rechtsgängige Helix 3,6 AS pro Windung

• Seitenketten zeigen nach außen

Stabilität:

• H- Brücken innerhalb der gleichen Peptidkette zwischen Peptidbindungen übereinander liegender Helixwindungen

• zwischen der Carbonylfunktion der n-ten AS und dem Amidwasserstoff der (n+4)- ten AS

• Glycin (30%)

• Prolin (Xaa; 20%)

• Hydroxyprolin (Yaa; 20%)

PTMs:

• Hydroxylierung

• Glykosylierung

• limitierte Proteolyse

AS:

• Prolin: hydroxylierung

• Lysin: hydroxyliert und glykosyliert

-> Skorbut (Avitaminose C)

• zur richtigen Funktion benötigen die Hydroxylasen von Prolin und Lysin Vit. C als Cofaktor!

  -> sonst fehlerhafte Biosynthese des Kollagens.

• kovalent an ein Enzym gebunden und für dessen Funktion notwend.

• Bsp.: Häm ist die prosthetische Gruppe des Hämo- und Myoglobind und vermittelt durch sein gebundenes Fe2+ die Sauerstoffaufnahme

• bezeichnet den Übergangszustand aus Enzym und gebundenem Substrat bei einer enzymkatalysierten Reaktion.

• Enzyme verfügen über ein aktiven Zentrum, welches das Substrat bindet.

• nichtkovalente- Bindung!

-> der Pyruvat- Dehydrogenase- Komplex

• besteht aus:

  -> Pyruvat- Dehydrogenase (E1)

  -> Dihydrolipoyl- Transacetylase (E2)

  -> Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (E3)

• Außerdem involviert:

  -> TPP (Thiaminpyrophosphat)

kompetitive Hemmung:

• Km erhöht

• Vmax unverändert

-> die Konzentration muss erhöht werden, um denselben Effekt zu erzielen, die Umsetzungsgeschwindigkeit bei erfolgter Bindung ist dieselbe)

nicht- kompetetive Hemmung:

• Km nicht oder nur leicht erhöht

• Vmax verringert

-> die Konformation ändert sich idR, sodass die Affinität herabgesetzt wird, d.h. die Konzentration muss erhöht werden, um denselben Effekt zu erzielen, die Umsetzung ist durch den Inhibitor erschwert, d.h. die Aktivierungsenergie ist erhöht und die Geschwindigkeit entsprechend herabgesetzt.

reversible Hemmung:

• Inhibitor bindet reversibel/ nicht- kovalent an das Enzym und senkt damit die Geschwindigkeit der Substrat- Produkt- Reaktion

• Der Inhibitor kann vom Substrat verdrängt werden.

Irreversible Hemmung:

• Inhibitor bindet kovalent an das Enzym, wodurch das Enzym inaktiv bleibt.

Dixon- Plot:

• Verdünnungsreihe anfertigen

• Inkubationsansatz aus Indikatorreagenz (z.B. Ellmanns- Reagenz), Substratlösung der entsprechenden Konzentration, Inhibitiorlösung und Enzymlösung.

• Enzymaktivität wird bei verschiedenen Kombinationen an Substrat und Inhibitorkonzentration ermittelt.

• Reziproke Enzymaktivität wird gegen die Inhibitorkonzentration aufgetragen.

-> jede Gerade entspricht einer Substratkonzentration. Die höchste Substratkonzentration entspricht dem untersten Graphen.

-> der Schnittpunkt der Geraden entspricht der Inhibitorkonstanten Ki

• Acetyl-CoA- Carboxylase

  • Co- Faktor: Biotin/ Vit. B7

-> positiver Effektor: Citrat

-> negativer Effektor: Palmityl- CoA

-> Bestehen aus Kollagenmolekülen, die die charakteristische Form einer Tripelhelix aufweisen.

• Moleküle sind gegeneinander versetzt angeordnet, was in einer Querstreifung resultiert.

im Cytoplasma

-> Weil sie durch ihre C- Skelette nur Acetyl- CoA liefern

• dessen Acetylrest im Citratzyklus zu CO2 oxidiert wird, bevor die Stufe des Oxalacetats erreicht wird.

• somit können sie nicht für die Gluconeogenese genutzt werden.

vgl. beim Abbau gucogener AS entsteht: Pyruvat, alpha-Ketoglutarat, Succinyl-CoA, Oxalatacetat oder Fumarat

Es kann zur Übersäuerung (Ketoazidose) des Blutes führen, was im diabetischen Koma mundet.

• Diabetis Typ I -> Insulinmangel -> Aktivierung von Lipase -> Hydrolyse von Triacylglycerinen -> FS- Konz. steigt -> vermehrte beta- Oxidation -> erhöhte Koz. an Acetyl-CoA -> Bildung von vielen sauren Ketonkörpern -> senkung des Blutes-pH- Wertes

Polymerase- Chain- Reaktion:

=> DNA- Amplikation

• anhand eines DNA- Templates mit bek. Sequenz des zu amplifizierenden Abschnittes erfolgt eine in- vitro Replikation mit:

  • nNTPs (Adenin, Thymin, Cytosin, Guanin)

  • thermostabile Polymerase (z.B. taq- oder pfu- Polymerase)

  • DNA- Primer bekannter Sequenz und geeigneter Schmelztemperatur (kann anhand der verwendeten Basen geschätzt werden: A/T + 2°C und G/C + 4°C

• es wird ein cyclische Programm durchlaufen, das verschiedene spezifizeirte Temperaturen durchläuft!

3 Phasen:

• Denaturierung

• Annealing

• Amplikation

-> erster Durchgang resultiert in “long fragments”, da die Polymerase keine Endsequenz erkennt. Die Zeit des Amplikationsschrittes ist die einzige Begrenzung.

-> ab zweiten Durchgang, dann exponentielle Zunahme des zu amplifizierenden Abschnittes

vgl. long fragments nur lineare Zunahme

=> theoretische Ausbeute:

• die DNA- Verpackung (Form des Chromatins) und damit die Größe

• die Zusammensetzung des Gels (Trenngel/ Sammelgel)

• die Wanderungsgeschwindigkeit ist umgekehrt proportional zum log (Anzahl Basenpaare)

• die Ladung ermöglicht die Wanderung zur positiv geladenen Anode (negative Ladung des Phosphatrückgrates)

Restriktionsenzyme:

• BamHI

• Xhol

• Xbal

Benutzung des Restriktionsverdau:

• zur erstellung von Restriktionskarten

• Insertion eines Gens in ein Plasmid zur Herstellung rekombinanter Proteine

• Proteasen

a) isoelektrische Fokussierung

b) Agarose Gelelektrophorese

c) ELISA, Western- Blot

• cAMP: cyclisches adenosinmonophosphat

• DAG: Diacylglycerin

• IP3: Inositol-1,4,5- triphosphat

DOPA = 3,4-Dihydroxyphenylalanin

GABA = 4-Amino butyric acid (gamma- Aminobuttersäure)

• RNA- Polymerase I

  • katalysiert Bildung von rRNA als prä- rRNA im Nucleolus

• Polymerase II

  • kat. Bildung von prä-mRNA, snoRNAs, snRNAa, siRNA und miRNA

• Polymerase III

  • kat. Bildung von tRNA, 4S rRNA, snRNA und kleiner RNAs

• Polymerase IV

  • kat. Bildung von siRNA

-> Die Prozessierung erfolgt im Zellkern und umfasst 3 Reaktionen:

1. 5´Capping: ein 7-Guanylrest wird an das 5´- Ende der prä-mRNA geheftet.

2. Spleißen: Entfernen der Introns und Verknüpfung der Exons (am Spleißosom)

3. Polyadenylierung: Poly(A)- Schwanz aus 50-250 Adeninresten wird an das 3´-Ende geheftet

Introns:

• sind nicht- codierende, enthalten meist Regulationselemente für die Transkription

• sind bei Prokaryonten nicht vorhanden.

Exons:

• codierende Sequenzen der prä-mRNA Introns

Nach der Transkription entsteht eine prä-mRNA, die neben Exons auch nicht-proteincodierende Introns enthält. Während der posttranskriptionellen Prozessierung werden die Introns durch das Spliceosom entfernt, sodass die (reife) mRNA entsteht. Meist beginnt die Intronsequenz mit der Basenabfolge Guanin-Uracil und endet mit Adenin-Guanin (GU-AG-Introns).

Eine besondere Rolle nehmen selbstspleißende Introns (Ribozyme) ein, die sich autokatalytisch aus der prä-mRNA entfernen. Dabei unterscheidet man zwischen Gruppe-I- und Gruppe-II-Introns.

Üblicherweise enthalten die Introns die für die Transkription unerlässlichen Regulationselemente (cis acting elements). Häufig finden sich hier auch sich regelmäßig wiederholende Basen (Triplett-Repeat)

Palmitinsäure:

• C16

Ölsäure:

• C18

• ungesättigt zwischen C9 und C10

• Delta9- Octadecenoat

• 18:1 Omega-9-FS

Palmitinsäure: C16

• 6 Acetyl-CoA (=12C)

• 1 Acetoacetyl- CoA (=C4, Ketonkörper) -> Ketonkörperabbau zu 2 Acetyl- CoA (2x C2)

• 6 FADH2

• 6 NADH

Ölsäure: C18 (18:1 Omega-6)

• 7 Acetyl-CoA (=14C)

• 1 Acetoacetyl- CoA (=C4, Ketonkörper) -> Ketonkörperabbau zu Acetyl-CoA (2x C2)

• 7 FADH2

• 7 NADH

-> cis- DB wird durch Isomerase in zyklustypische trans- Konfiguration überführt

siehe auch:

• ungeradzahlige FS:

  • am Ende Acetyl-CoA (C2) + Propionyl-CoA (C3)

  • durch Propionyl-CoA Carboxylase mit Bicarbonat (C1) zu Methmalonyl-CoA (C4)

  • durch Methylmalonyl-CoA Mutase (MUT) zu Succinyl-CoA (C4) isomerisiert

  • Succinyl-CoA geht in den Citratzyklus ein

• mehrfach ungesättigte FS:

  • Isomerase und Reduktase für Überführung in geeignete Konfiguration und ANpassungen der DB- Position

  • NADPH + H+ wird benötigt für die Reduktase (NADP+ entsteht)

beta- Oxidation:

• Ort: Mitochondrienmatrix

• Träger (E- Träger oder Red. äquivalent)

  • FAD+ -> FADH2

  • NAD+ -> NADH + H+

• Redoxenzym:

  • Acetyl-CoA- Dehydrogenase

  • Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase

FS-Synthese:

• Ort: Cytosol, v.a. Leber und Fettgewebe

• Träger: NADPH -> NADP+

• Redoxenzym:

  • Fettsäure-Synthase-Multienzymkomplex

    -> 3-Ketoacyl-ACP-Reduktase

    -> Enoyl-ACP-Reduktase

  
  

-> Pentosephosphatweg

• Glucose-6- phosphat + NADP+ -> 6-Phospho- Gluconolacton + NADPH + H+

• Oxidoreduktase: Glucose-6- Phosphat- Dehydrogenase

Elektronentransport

• Reduktionsäquivalent von NADP+ in

  -> Malatenzym (Citrat-SHuttle)

  -> FS- Synthese

  -> Cholesterin- Biosynthese

  -> beta- Oxidation

  -> Pentosephosphatweg

  -> AS- Abbau

Nicotinamid- Adenin- Dinukleotid- Phosphat (Vit.B3)

• Ribose-5- Phosphat (Aldose) <-> Ribulose-5- phosphat (Ketose)

• für die Synthese von Nucleotiden bzw. Nucleotidoenzymen

-> AMP

-> GMP

-> FAD

-> NAD+ / NADP+

1. Glucose fehlt; Lactose vorhanden

   -> aktiv (Substratinduktion, Lactose bindet an Repressor)

2. Glucose vorhanden, Lactose vorhanden

   -> inhibiert (keine CAP- Aktiviert)

3. Glucose vorhanden, Lactose fehlt

   -> inhibiert (keine CAP- Aktivierung und keine Substratinduktion)

4. Glucose fehlt, Lactose fehlt

   -> inhibiert (CAP- Aktivierung, aber Repressor aktiv)

positive Regulation:

• Lactose vorhanden, induziert seinen eigenen Abbau

  -> Substratinduktion

• Ablauf:

  • Lactose bindet an Repressor

  • Repressor bindet nicht mehr an Operator + ihn inhibiert

  • Operator dient als Bindungsort für RNA- Polymerase

  • Strukturgene

negative Regulation:

• Glucose als Einfachzucker energetisch günstiger als Disaccharid, Glucose- Abbau erfolgt bevorzugt gegenüber Lactose- Abbau

-> Glucose unterdrückt Lactose- Abbau

• Ablauf bei wenig Glucose:

  • cAMP steigt

  • cAMP bindet an CAP (cAMP- Aktivatorprotein)

  • CAP bindet an CAP- site

  • RNA- Polymerase- Aktivität erhöht

  • verstärte Expression der Strukturgene

• Ablauf bei viel Glucose:

  • cAMP sinkt

  • CAP wird nicht aktiviert

  • RNA- Polymerase- Aktivität herabgesetzt

  • wenig Strukturgen- Expression

-> Isopropyl- beta- D- thiogalactopyranosid

• stabiles Lactose- Analogon

• künstlicher Induktor des lac- Operons

• wird nicht abgebaut, d.h. bindet dauerhaft an Repressor

• Repressor bleibt inaktiviert

• RNA- Polymerase bleibt aktiv

Verwendung:

• IPTG wird in der Molekularbiologie dazu benutzt, rekombinante Proteine durch Expression von klonierten Genen herzustellen.

• das gewünschte Gen befindet sich dabei unter der Kontrolle eines Lac- Repressor regulierten Promotors

• eine solche Promotor- Gen- Fusion befindet sich meist auf einem Plasmid, mit dem Bakterien transformiert werden.

• damit das Gen zunächst abgeschaltet ist und erst durch Zugabe von IPTG kontrolliert in Protein umgesetzt wird (Transkription & Translation), müssen die Zellen Lac- Repressor in ausreichenden Mengen exprimieren.

• keine Helicase, Topoisomerase, SSB- Proteine, Primase, Ligase, Promotor, Telomerase

• keine Okazaki- Fragmente

• DNA- statt RNA- Primer

• Primer legen Amplifikationsabschnitt fest

• bakterielle Polymerase (taq, pfu)

• Temperaturprogramm

• Denaturierung thermisch statt enzymatisch

• Regulation zeitlich statt physiologisch (hormonell, etc.)

=> ATP- Diphosphat- Lyase

• Mag2+ -abhängig

• Transmembranprotein

• 2 x 6 transmembranäre Segmente M1 und M2

• 2 homologe cytoplasmatische Domänen C1 und C2

  -> bilden Dimer und so das aktive Zentrum

• nucleophiler Angriff von 2 Aspartat- Resten der C1- Domäne auf 3`-OH- Gruppe des ATP

• ATP zu cAMP

=> GPCR

• Ligandenbindung

• G- Protein tauscht GDP gegen GTP aus

• a,b,y- Subunits des G- Proteins dissoziieren

• GTP- assoziierte a- Einheit migriert zu AC

• ATP wird zu cAMP umgewandelt

• Signalamplifikation: aus einem Liganden resultieren viele cAMP- Moleküle, die weitere Enzyme stimulieren können

• cAMP dient als second messenger und stimuliert Proteinkinase A

• Proteinkinase A wird durch Dissoziation der inhibierenden reg- Einheit aktiviert

• Proteinkinase A kann in Zellkern migrieren und Zielproteine phosphorylieren (Transkriptionsfaktoren, Enzyme, etc.)

Biosynthese:

-> Präprokollagen -> Prokollagen -> Tropokollagen -> Kollagenfibrillen -> Kollagenfasern

• Präprokollagen mit aminoterminalem Signalpeptid

• Protease im ER entfernt Signalpeptid

  -> Prokollagen mit Propeptiden entsteht

• Prolyl- Hydroxylase: Prolin wird teilweise hydroxyliert (Vit. C abhängig - Skorbut!)

• Lysin wird mit UDP- Glucose und UDP- Galactose substituiert

• Propeptide dreier alpha- Ketten bilden am C- Terminus Disulfidbrücken, um die Tripelhelixstrukturbildung zu starten

• Transport aus dem ER in Golgi- Vesikel

• Prokollagen- Peptidasen entfernen Propeptide

  -> Tropokollagen entsteht

• assoziation mehrerer Tropokollagene zu Kollagenfibrillen

• Quervernetzung der Kollagenfibrillen über Lysin, Allysin (modifiziertes Lysin) und Histidin

• Organisation zu Kollagenfasern

EDTA, NaOH, SDS, PDS:

-> Prinzip der alkalischen Lyse von Bakterien zur Isolierung der Plasmid- DNA

-> 1. Schritt werden Bakterien mithilfe von SDS lysiert und die DNA durch NaOH denaturiert

-> 2. Zugabe von K- Acetat neutralisiert die Lösung. Denaturierte Proteine und chromosomale DNA präzipitieren mit dem K- Salz des Dodecylsulfats. Die niedermolekulare Plasmid- DNA bleibt in Lösung und kann renaturieren.

-> 3. die unlöslichen Komplexe werden abgetrennt und die Plasmid- DNA kann isoliert werden.

1. die Bakterienkulturen werden zentrifugiert und in EDTA- haltigem Puffer resuspendiert.

   • EDTA komplexiert zweiwertige Kationen (Mg2+, Ca2+), die für die Stabilität der Bakterienzellwände wichtig sind und destabilisiert somit die bakterielle Zellwand.

   • je nach Protokoll kann dem Resuspensionspuffer bereits RNase A zugesetzt werden, die einen Großteil der bakteriellen RNA degradiert.

2. Die Bakteriensuspension wird anschließend durch Zugabe einer Mischung aus SDS und NaOH vollständig lysiert.

   • SDS löst als Detergens die Phospholipide und Proteinkomponenten der Zellwand.

   • NaOH denaturiert chromosomale und Plasmid-DNA sowie Proteine.

   • die Dauer der Inkubation unter alkalischen Bedingungen ist für die Qualität der Plasmid- DNA wichtig:

     -> muss so gewählt werden, dass möglichst viel Plasmid- DNA freigesetzt wird, ohne auch chromosomale DNA freizusetzen.

   • eine zu lange Inkubationszeit denaturiert die Plasmid- DNA irreversibel, ineffiziente Lyse der Bakterien senkt die Ausbeute an Plasmid- DNA dratsisch.

   • vollständig denaturierte Plasmid- DNA lässt sich im Agarosegel leicht erkennen: Sie läuft schneller als die superhelikale DNA und lässt sich schlechter mit Ethidiumbromid anfärben.

3. Das Lysat wird mit saurem K-Acetatpuffer neutralisiert. K-dodecylsulfat ist wesentlich schlechter in Wasser löslich als Na-dodecylsulfat und fällt unter den herrschenden hohen Salzkonzentrationen aus.

   • denaturierte Proteine, hochmolekulare RNA, denaturierte chromosomale DNA und bakterieller Zelldebris bilden in Anwesenheit von K-dodecylsulfat unlösliche Komplexe und werden zusammen mit dem Salz präzipitiert.

   • die kleineren Plasmidmoleküle bleiben in Lösung und können durch die Neutralisation der Lösung wieder renaturieren.

4. Die unlöslichen Komponenten werden abzentrifugiert, und die DNA kann weiterbearbeitet werden.

   • für viele Anwendungen reicht die Reinheit der DNA bereits aus, und die DNA wird lediglich mit Ethanol oder Isopropanol gefällt und anshcließend gewaschen.

-> diese einfache und schnelle Methode eignet sich zur gleichzeitigen Präparation sehr vieler verschiedener Plasmide und wird deshalb zum Austesten von Klonierung verwendet (Schnellaufschlüsse). Hierzu werden viele verschiedene Bakterienkolonien jeweils in einigen Millilitern Medium angezogen und die Plasmid-DNA mithilfe von Restriktionsspaltungen auf die richtige Insertion des Fragments in den Vektor analysiert

-> DNA-Histon-Polymer wird Chromatin genannt

Euchromatin:

• geringer Verpackungsgrad

• Genaktivität ermöglicht

• im Euchromatin findet sich die Mehrzahl der Gene

• viele aktivierende Modifizierungen

• realtiv leicht zugänglich für die Transkriptionsmaschinerie

• im Euchromatin dagegen binden die Transkriptionsfaktoren so an die DNA, dass sie sich ergänzen. Dies erlaubt eine fein abgestimmte Kontrolle der Genaktivität

Heterochromatin:

• hoher Verpackungsgrad

• legt Gene still

• hauptsächlich repetitive Sequenzen, die nicht- kodierende RNA- Moleküle bilden können

• durch repressive chemische Modifizierungen dicht verpackt

• liegen bspw. rund um die Zentromere und an den Chromosom- Enden, den Telomeren

• Etablierung und Aufrechterhaltung dieses konstitutiven Heterochromatins ist äußerst wichtig für Zelltyp- Identität, Genregulation und eine korrekte Chromosomenregulation

• Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren eher zufällig verteilt, so dass sie sich nicht synergistisch verstärken können. Die DNA kann deshalb dort nicht so abgestimmt abgelesen werden. Insgesamt überwiegen hemmende Einflüsse, die das Heterochromatin weitgehend abschalten.

-> Epigenetische Veränderungen, wie z.B. chemsiche Modifizierungen der Histone oder der DNA- erlauben plastische Übergänge zwischen diesen beiden Chromatinzuständen und somit die Herstellung einer Vielzahl epigenetischer Varianten unseres Genoms (Epigenom).

-> ein Genom aber biele Epigenome:

• während jedes Individuum nur ein Genom besitzt, finden sich in den unterschiedlichen Zelltypen viele unterschiedliche Epigenome. Epigenetische Mechanismen wie z.B. Histonmodifizierungen (mod), DNA- Methylierung (Me) oder nicht- kodierende RNAs (ncRNAa) erlauben die Etablierung unterschiedlicher Chromatinzustände und damit die organisierte Nutzung der gespeicherten Information.

=> Tumorsupressor- Protein =Transkriptionsfaktor

• Tetramer mit dominant- negativem Effekt, d.h. eine defekte/mutierte Untereinheit resultiert in funktionslosem Tetramer

• reguliert Zellteilung und -differenzierung

• leitet konzentrationsbedingt entweder vorübergehenden Stillstand der Mitose oder gar Apoptose der Zelle ein

• bei Defekt bzw. inaktivierender Mutation erfolgt keine Apoptose -> maligne Zellproliferation

-> p53- vermittelte Signalwege. Normalerweise ubiquitinyliert die Ubiquitin-E3- Ligase Mdm (mouse double minutes) p53 und markiert es damit für den nucleären Export und proteasomalen Abbau. Entsprechend kurz ist seine HWZ mit ca. 20 min in ruhenden Zellen. Ein Zielgen des Transkriptionsfaktor- Komplexes p53/WT1 ist mdm2 selbst: Über diese negative Rückkopplung hält die Zelle den basalen p53- SPiegel niedrig. Mdm ist ein potentes Onkogen; WT1 ist häufig bei Wilms- Tumoren der Niere mutiert. E6 ist ein virales Protein

s. weitere Tumorsupressoren mit Einfluss auf Zellteilung- und differenzierung: TGF- und Rb (vgl. Tumorsupressoren mit Einfluss auf Apoptose: NF- kB- und PI3K, mTOR

NF-kB- Signalweg:

• NF-kB besteht aus 2 Untereinheiten, p50 und p65, und liegt im Grundzustand als ternärer Komplex mit seinem Inhibitor IkB im Cytosol vor.

• Tumornekrosefaktor wie TNF- a, Interleukine wie IL-1 oder proapototische Faktoren

-> der NF-kB- Signalweg. Trimere TNF- alpha- und FAS- Rezeptoren können nach Ligandenbindung TAK-1 rekutrieren und aktivieren, die wiederum die Kinase IKK mit ihren 3 Untereinheiten alpha, beta und gamma aktiviert. Die IKK- vermittelte Phosphorylierung und Ubiquitinylierung von IxB setzt NF-kB frei, sodass er nun in den Kern translozieren und dort die Transkription seiner Ziegene induzieren kann. Dazu gehört auch induzierbare NO- Synthase (iNOS), die über ihre NO- Produktion bekterizid wirkt. Das humane Genom codiert für 5 verschiedene Mitglieder der NF-kB- Familie.

PI3- Kinase- Signalweg:

• Wachstumsfaktoren (wenn nicht via Ras-Raf-MAPK-Weg)

-> PI3- Kinase-Signalweg und PTEN. Die Lipidphosphatase PTEN dephosphoryliert PIP3 (Phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat) zu PIP2 (Phosphatidylinositol-4,5-phosphat) und hält dadurch Akt-Kinase in Schach, die ihrerseits durch inaktivierende Phosphorylierung von Bad (direkt) bzw. FOXO/Bim (indirekt) die Wirkung des antiapoptischen Faktor Bcl-2 entfaltet. Die Kinase PDK-1 und mTOR phosphorylieren und aktivieren Akt/PKB an der Memrban (nicht gezeigt)

s. weitere Tumorsupressoren mit EInfluss auf Apoptose: NF-kB- und PI3K, mTOR. Vgl. Tumorsupressoren mit Einfluss auf Zellteilung- und differenzierung: TGF- und Rb

Antagonismus von Onkogenen und Suppressorgenen: Bei aktivierenden Mutationen oder Überexpression wirkt Bcl-2 als Onkogen, während inaktivierende Mutationen oder Deletionen beider PTEN- Allele zu einem Ausfall seiner tumorsuppressiven Wirkung führt. Beide Effekte führen zu drastisch verlängerten Überlebensraten und damit zu einem entscheidenden Wachstumsvorteil betroffener Zellen.

-> Phospholipase C spaltet das Phosphat Phosphocholin vom Diacylglycerin

Phospholipase D spaltet den Alkohol Cholin von der Phosphatidsäure.

Molybdatophosphorsäure:

• Oxidationsmittel für ungesättigte FS

• selbst reduziert von Mo(VI) zu Mo(V) -> Mischung dieser führt zu grauem Mischoxid

b)

• I/L = Isoleucin und Leucin sind isobar = selbe Masse

• K/Q = Lysin und Glutamin fast isobar = ähnliche Masse

c)

• Endoproteasen, v.a. Trypsin häufig verwendet

• Funktionseinheit auf der DNA von Prokaryoten und manchen Eukaryoten

• (Regulatorgen), (Aktivatorprotein, site), Promotor, Operator, Strukturgene

• Lactose und IPTG (Isopropyl-beta-D- Galactopyranosid) binden

• binden an Repressor, der den Operator dann nicht weiter inhibieren kann.

• Die RNA- Polymerase bindet dann an den Operator und die Transkription (und im weiteren die Translation) kann erfolgen.

• Konzentration an Bisacrylamid + Acrylamid (+ Ammoniumpersulfat + TEMED)

• pH- Wert

• Puffer (Glycin und TRIS-HCl)

Das Sammelgel:

• hat eine geringere Konzentration an Acrylamid, weist also eine größere Maschenweite auf.

• Der pH im Sammelgel ist ebenfalls niedriger bei pH 6,8 (IEP von Glycin aus Puffer!), sodass Glycin ungeladen und Cl- geladen vorliegt.

• die Motilität der zu analysierenden, als Polyanion vorliegenden Proteine ist zwischen der des Chlorids und des Glycins einzuordnen.

• das Chlorid gibt die Geschwindigkeit vor, der Rest folgt mit gleicher, konstanter Geschwindigkeit => Isotachyphorese

Das Trenngel:

• hat eine höhere Konzentration an Acrylamid, also engere Maschen.

• pH 8,8 im Trenngel höher, sodass Proteine als Polyanionen vorliegen und den selben Speed erfahren. die Trennung erfolgt mur aufgrund des unterschiedlichen Retentionsverhaltens begründet in der Größe der Proteine. => Größenausschluss

SDS:

• lagert sich an Proteinrückgrat an.

• es entstehen Micellen mit konstanter negativer Ladung pro Masseneinheit mit ca. 1,4g SDS pro g Protein.

• Dabei ragen die negativen Ladungen nach außen und stoßen sich gegenseitig ab.

• das Protein wird linearisiert und liegt als Polyanion vor.

Glycerin:

• erleichtert aufgrund seiner hohen Dichte das Absinken in die Geltaschen

Bromphenolblau:

• ermöglicht die in- process- Überwachung der Elektrophorese durch Sichtbarmachung der Lauffront.

1. Glykolyse

2. Gluconeogenese

3. Glykogenolyse

4. Glykogensynthese

5. Pentosephosphatweg

• Glucose-6-phosphat

• Glycerinaldehyd-3-phosphat

• Pyruvat

• Acetyl-CoA

• Citrat

• Oxalacetat

• Malat

• alpha-Ketoglutarat

• Succinyl-CoA

• Lactat

a)

• b- Ionen mit O=C+ und NH2

• y- Ionen mit H3N+ und OH

b)

• b1: AS1 + 1

• b2: (AS1 + 1) + AS2

• y1: AS3 + 17 + 1 + 1

• y2: (AS2 + 2) + (AS3 + 17)

c) vor dem Zeichnen des Spektrums erst [M+H]+ berechnen!

Am Ribosom mit 3 Bindungsstellen:

• A- Stelle (Aminoacyl- Stelle)

• P- Stelle (Polypeptid- Stelle)

• E- Stelle (Exit- Stelle)

-> AS1 von A in P-Stelle

-> AS2 kommt in A-Stelle, AS1 wird an AS2 gebunden

-> t- RNA von AS1 wird auf E- Stelle verschoben, wenn AS3 in A-Stelle bindet

Generell:

• Initiation

• Enlongation

• Termination

Eukaryoten:

• 40S + 60S = 80S Ribosom

• kleine ribosomale Subunits bindet zuerst über 7-Methylguanosinkappe der mRNA bis Startcodon gefunden wird

• dann bindet große Subunit

• wenn Stop-Codon in A- Stelle bindet, wird Translation mittels eines Translationsfaktors terminiert

• Ribosom zerfällt

Prokaryoten:

• 30S + 50S = 70S Ribosom mit 16S- rRNA der kleinen Subunit

• kleine ribosomale Subunit bindet zuerst über Shine-Dalgarno-Sequenz der mRNA und dirigiert das Startcodon an P- Stelle

• dann bindet große Einheit

• wenn Stop-Codon in A- Stelle bindet, wird Translation mittels zweier Translationsfaktoren terminiert

• Ribosom zerfällt

-> Transaminasen katalysieren die Übertragung einer Aminogruppe von einer AS auf eine alpha- Ketosäure.

• so kann aus diversen überschüssigen AS durch Übertragung der Aminogruppe alpha- Ketoglutarat und eine andere benötigte AS entstehen.

siehe AST- Aspartat und ALT- Alanin

• Cofaktor der Transaminasen ist das vom Vitamin B6 abstammende Pyridoxalphosphat

Enzymhauptklasse: Transferase

7 Klassen:

1. Oxidoreduktasen

2. Transferasen

3. Hydrolasen -> hydrolytische Spaltung

4. Lyasen -> nichthydrolytische Eliminierungsreaktionen

5. Isomerasen

6. Ligasen (=Synthethasen) -> Bindungsknüpfung unter ATP- Hydrolyse

• vgl. Synthasen -> Bindung ohne ATP- Bildung

1. Translokasen -> Transport von Stoffen (oft unter ATP- Verbrauch)

1. ungehemmte, schnelle Proliferation und Unempfindlichkeit gegen wachstumshemmende Signale

2. keine Apoptose (oft Genmutationen)

3. undifferenzierte Zellen

4. Infiltrierung anderer Gewebe

5. Funktionseinschränkung betroffener Organe durch Zerstörung des Gewebes

6. Metastasierung

7. hohe Rezidivwahrscheinlichkeit

8. (Angiogenese)

durch die hydrophoben Eigenschaften der aliphatischen Reste dieser AS werden die hydrophilen Amine- und Carboxygruppen nach außen zum wässrigen Milieu ausgerichtet, während die aliphatischen Reste nach innen orientiert sind, um die Grenzfläche zu minimieren.

• Glutamat (GABA)

• Aspartat (NMDA)

• Glycin (NMDA)

• Glutamat -> gamma-aminobutyric acid

• Tryptophan -> Serotonin

-> sie kommen beide im Rahmen der Inhibition von Rezeptoren mit mehreren Substraten vor.

Nicht- kompetitive Inhibitoren:

-> binden im aktiven Zentrum, allerdings an einer anderen Stelle als das eigentliche Substrat.

-> Km ist unverändert bzw. durch Konformationsänderung leicht erhöht, Vmax verringert.

Unkompetitive Inhibitoren:

-> binden nicht im aktiven Zentrum, sondern am Enzym-Substrat-Komplex.

-> Km vermindert, da Vmax und somit auch halbmaximale Geschwindigkeit herabgesetzt wird.

-> Pyruvat- Dehydrogenase- Reaktion am Enzym- Komplex

• Pyruvat + CoA- SH + NAD+ -> Acetyl-CoA + CO2 + NADH + H+

• mithilfe von Enzymkomplexen I-V werden die Reduktionsäquivalente NADH und FADH2 aus dem Citratzyklus verwendet, um Protonen aus der Mitochondreinmatrix in den Mitochondrien- Intermembranraum zu pumpen.

• dabei wird ein elektrochemischer Gradient aufgebaut, während die Elektronen über die Komplexe transportiert werden.

• Am Komplex IV wird Atemsauerstoff unter Einwirkung von Protonen und den transportierten Elektronen zu Wasser reduziert.

• Anschließend wird am Komplex V durch die protonenmotorische Kraft ADP zu ATP phosphoryliert, was den energiegewinnenden Schritt darstellt.

-> oxidative Phosphorylierung:

• am Mitochondrien- Intermembranraum

• Protonen werden aus Mitochondrienmatrix in den Intermembranraum gepumpt, dann zurück in die Matrix.

• Wasser und ATP entstehen in der Mitochondrienmatrix

-> Citratzyklus:

• in der Mitochondrienmatrix

• Enzyme setzen die Aktivierungsenergie einer Reaktion herab.

• die Aktivierungsenergie kann eine Reaktion soweit verzögern, dass sie praktisch nicht abläuft, obwohl der energetische Zustand nach der Reaktion deutlich besser ist als vor der Reaktion.

-> klassisches Diagramm mit y = deltaG; x = t)

• Ausbildung von Lipidankern zur Befestigung von Proteinen in der Plasmamembran.

  • Hydrophobe Gruppen

    • Myristol

    • Prenylierung

    • Farnesyl

    • Gernaylgeranyl

    • Palmitoylierung

• Ras und Rho (beide G- Proteine)

Affinität:

• beschreibt die Spezifität eines antikörpereigenen Paratops mit einem bestimmten Epitop eines AG.

Avidität:

• beschreibt das quantitative Bindungsvermögen eines AK.

Epitop:

• ist eine Erkennungssequenz eines AG und kann als Bindungsstelle für ein AK dienen.

Paratop:

• ist eine hochspezifische AS- Sequenz, auf den variablen Teil (N- Terminus) von AK.

• amplifizieren das zu detektierende Signal

  • sek. AK polyklonal, d.h. gegen verschiedene Epitope des prim. AK gerichtet

• können allgemein gegen einen Host- Organismus des primären AK gerichtet sein (primäre AK können spezifisch für verschiedene Epitope sein)

• können gängige Konjugate binden, mit denen die Detektion erfolgen kann

Denaturierung:

1. TCA = Trichloressigsäure

2. SDS = Na- Dodecylsulfat

Reduktion:

1. DTT = Dithiothreitol

2. BME = beta-Mercaptoethanol

• freie Sulfhydrylgruppen zu stabilisieren und

• Disulfidbindungen von Proteinen und Peptiden zu reduzieren.

• bei Hitze- Denaturierung können die H- Brücken im Protein NICHT aufrecht erhalten werden, sodass die Sekundärstrukturen, daher auch die Tertiär- und Quartär- Strukturen zertsört werden.

• die AS- sequenz = Primärstruktur bleibt unverändert.

1. die Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen, sowie die Abspaltung vom Harz nach der Synthese erfolgt in einem Schritt durch konzentrierte Trifluoressigsäure unter Zusatz von 5-20% Scavenger. Hierbei handelt es sich um Kationen- und Radikalfänger, die unerwünschte Nebenreaktionen unterdrücken.

   • elektronenreiche Aromate (Thioanisol, Kresol) und Thiole zum Abfangen der Abspaltungsprodukte (Ethandithiol).

• da Thiole jedoch sehr geruchsintensiv und toxisch sind, werden zunehmend Silane wie Triisopropylsilan (TIS) für diese Zwecke eingesetzt

1. RP-HPLC + Photodiodenarraydetektor:

   • Protein polar, TFA pH 2 protoniert Protein

   • UV- Messung der aromatischen AS

2. oder MS/MS

-> Rb ist ein Tumorsupressor

• der am Restriktions- Punkt am Ende der G1- Phase die Zelldifferenzierung- und proliferation steuert.

• Bei Mutation des Gens, dass für Rb codiert kann es zu einer fehlerhaften Funktion des Proteins kommen und ein unreguliertes Zellwachstum bewirken.

1. Ende G1/ Restriktions- Punkt (Rb, p53)

2. Ende G2

3. Ende M

-> p53 leitet bei fehlerhaftem genetischen Material einen Stop der Interphase ein, sodass der Zellzyklus für DNA- Reparaturen unterbrochen wird.

• sowohl am Ende der G1- Phase, also VOR der DNA-Synthese

• als auch am Ende der G2- Phase, daher NACH der DNA-Synthese

… finden Kontrollen statt, um das DNA- Ausgangsmaterial sowie die entstandene Kopie von der Mitose ggf. reparieren zu können.

-> prä-mRNA = hnRNA mit Introns, also primäres Transkript

-> mRNA:

• wird abgeschrieben (Replikation) und ist dei Kopie eines DNA- Strangs

  • Beachte: Uracil anstelle von Thymin

• nach splicing ohne Introns, nur Exons

• 5´Capping

• 3´Polyadenylierung

-> rRNA = ribosomale RNA

• Ribosomen = rRNA + ribosomale Proteine

• wichtig bei Translation

-> snRNA = small nuclear Ribonucleoprotein particles

• wirken beim splicing mit

-> snoRNA = small ribonucleic acid

• Prozesierung und Modifikation anderer RNA

• v.a. rRNA

-> siRNA = small interfering RNA

• unterdrückt die Funktion von komplementären RNAs

-> tRNA = Kleeblattstruktur

• mit AS und Anticodon versehen

• wichtig bei Translation

-> miRNA = Haarnadelstruktur

• kurz, hochkondensiert, Genregulation, Gensilencing

Gaq - PIP2 -> IP3 + DAG

• IP3

  • Ca- Ausstoß aus ER ins Cytosol

• DAG

  • Hydrolyse zu MAG und freier- FS

  • Cofaktor für Transkriptionsfaktoren

  • Cofaktor für Glykogen-Synthese

Gai/Gas - cAMP

• Aktivierung der AC (Adenylatcyclase)