Was ist die Durchflusszytometrie?
Gerät für zytologische Untersuchungen
Kann Zusammensetzung einer Blutprobe bestimmen
Anfärben der Zellen mit fluoreszierenden Farbstoffen
Kann Eigenschaften bestimmen wie:
Wie schnell teilen sich Zellen?
Weisen Zellen bestimmte Tumormarker auf ihrer Oberfläche auf?
Was ist das Widerstandsprinzip?
Zellproben gelangen in einem Flüssigkeitsstrom durch eine dünne Kapillare in das Zytometer
Durchtritt eines Partikels durch diese Kapillaröffnung erzeugt eine Widerstandsänderung (Impedanz (Wechselstromwiderstand, Coulter-Prinzip), proportional zu Größe und Partikelvolumen
Elektrische Registrierung von Zahl und Höhe dieser Impluse erlaubt die Zuordnung zu einer Blutzellpopulation
Bestimmung von Volumen und Größe der Zellen/Partikel
Was kann mit dem Durchflusszytometer analysiert werden?
Partikel zwischen 0.4 - 50 um Größe
Blutzellen
Chromosomen
Algen
Protozoen
Was ist die hydrodynamische Fokussierung?
Mess-system für Partikel, die einzeln in einem Flüssigkeitsstrom (Hüllstrom) einen Laserstrahl passieren
Man nutzt eine Mantelflüssigekit, die den Zellstrom stabilisiert
FSC misst Größe
SSC die Granularität
Was ist das Streulicht?
Je größer eine Zelle und je mehr Strukturen in ihrem Inneren sind, desto größer ist das entstehende Streulicht
Streulichtmessung
Solange der Laserstrahl ungehindert durch die Flusszelle geht, entsteht kein Streulicht. Quert hingegen eine Zelle den Strahl, wird das Licht in verschiedenste Richtungen gestreut.
Gemessen wird das Streulicht an 2 Stellen:
Vorwärtsstreulicht
in Richtung des ursprünglichen Strahls
Seitwärtsstreulicht
etwa im 90Grad Winkel zum ursprünglichn Strahl
Was ist der FSC?
Hängt von Größe der Zelle ab
kleine Zellen verursachen ein kleines Licht, große Zellen ein großes Licht
Was ist das SSC?
Hängt neben der Größe auch vom Inhalt der Zelle ab
Finden sich viele Lysosome, Granula etc., hat man großes SSC
Wie verläuft die Differenzierung der Leukozyten?
erfolgt nach dem Prinzip der Durchflussztyometrie (Hydrodynamische Fokussierung)
Parallel zur Messung von Erys, Häm und Thrombos
mittels Streulicht, Impedanz
alternativ bei einigen Geräten: Konduktivität (Leitfähigkeit), Fluoreszenz oder Zytochemie (Peroxidase)
> Differenzierung in Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Monozyten und Lymphozyten
Mit Hilfe spezieller Reagenzien werden die Zellmembranen perforiert, sodass die Färbelösung in die Zelle eindringen und Kern und Plasma anfärben
Wie funktioniert die Markierung von Oberflächenmolekülen?
FSC und SSC kann Zell-Typen in einer heterogenen Zell-Population unterscheiden
Klassifizierung weiterer Untergruppen, wie z.B. die Einteilung der Lymphozyten in B-Zellen und T-Zellen erfolgt über die Analyse der Expression bestimmter Oberflächenantigene, den CD-AG
Sub-Klassifizierung erfolgt über die Bindung von fluoreszenz-markierten monoklonalen AK an spezifische CD-AG = Immunophänotypisierung
Was ist das CD-Klassifikationssystem?
Clustder of Differentiation = CD
Zuordnungssystem der nur moAk erkannten Strukturen auf Blutzellen, in regelmäßig stattfindenden workshops definiert (CD1 - ca. CD338)
umfangreicher Werkzeugkasten zur Identifizierung von Blutzellen
Zwei Arten von Markern:
Linienspezifische CD-Marker
Differenzierungsstadien-spezifische CD-Marker
Wie verhaltennsich die Laser von Fluoreszenz-AK?
Je nach Bindung und Farbemission der gebundenen AK
Was ist Fluoreszenz?
Das Fluorchrom-Molekül absorbiert kurzfrsitig die Energie des Laserlichtes und wird hierdruch angeregt
Es gibt die energie in Form von
Wärme
Licht einer höheren Wellenlänge ab
Was ist der Stroke Shift?
Stroke Shift:
Verschiebung der Wellenlänge bzw. der Frequenz von Licht (elektromagnetische Strahlung) zwischen Absorption und Emission
Das abgestrahlte Fluoreszenzlicht ist immer längerwelliger als das Anregungslicht
Wie kann eine Fluoreszenz-Markierung erfolgen?
Wie viele Fluoreszenzen können gleichzeitig gemessen werden?
Abhängig vom Gerätetyp 4 - 30
Was ist besser, viel oder wenig Fluorchrome?
Mehr Proben = mehr Infos, jedes Flurchrom erhöht die Aussage exponentiell
Was sind Photomultiplier Tubes?
Erfordert Strom auf den Dynoden
Ist lichtempfindlich
Empfindlich gegenüber spezifischen Wellenlängen
Kann End- (wie gezeigt) oder Seitenfenster-PMTs sein
PMT`s sind farbenblind
multiplizieren die Photonen des einfallenden Lichts
Konvertieren Licht in ein elektronisches Signal
Signal steigt und fällt mit der Menge des einfallenden lichts (0-10 Volts)
Höhe des Signals wird über die an der PMT angelegte Spannung kontrolliert
Was gibt es für Filter in der Durchflusszytometrie?
Was für Faktoren haben Einfluss auf zytometrische Analysen?
Präperation
Ficoll vs. Lyse
Wash / no Wash
Antikoagluanzien
Fluorchrome
bis zu 20 Farben
Konjugate
Isotypenkontrolle
Kompensation
Gating
Immunologisches Gating
Lebend/Tot-Diskriminierung
Dublettendiskriminierung
Absolutzahl Zellen/uL: Dual vs. Single-Platform
Zytometer
Spezifikationen (laser, Filter…)
Überprüfen der Laser und Fluidik
Regularien
GLP, Akkreditierung, Zertifizierung
Studien-/Prüfpläne
Abrechnungsmöglochkeiten
Was für Einfluss hat die Präanalytik auf die Durchflusszytometrie?
Antikoagulanzien
Ammonium-Heparin am stabilsten
EDTA: Absatz binnen 12 h
Citrat: kann Oberflächenmarker angreifen
Lyse
Ammoniumchlorid ist nicht pH-stabil
Jede Lyse andere Scattereigenschaften
Fixierende Lysen sind stabiler. Cave: Lebend/Tot-Färbung
Zelaggregate
Zellsiebe (40-70 um) verhindern ein Verstopfen des Zytometers
Evtl. Zugabe von DNAse bzw. Kollagenase/Dispase
Was ist der Vorteil/Nachteil gewaschener / ungewaschener Ansätze?
Gewaschen
Besseres Signal-Rausch-Verhältnis
Population sind besser darstellbar
Geeignet für qualitative Untersuchungen
Aber: Unspezifischer Zellverlust
Nicht geeignet für Absolutzellzahl-Bestimmung
Ungewaschen
Kein Zellverlust
Geeignet für quantitative Untersuchungen
Optimal für absolutzellzahl-Bestimmungen
Am besten in Kombination mit pH-stabiler Lyse
Wie erfolgt eine Vitalitätsbestimmung?
Tote Zellen binden unspezifische AK und können so zu falsch-positiven ergebnissen führen
Wie funktioniert immunologisches Gating?
Ein immunologisches Gate ermöglicht oftmals eine bessere Abgrenzung der Zielpopulation als reines Scattergate
Was muss bei Arbeit mit Fluoreszenzen kontrolliert werden?
Autofluoreszenz
Unspezifische AK-Bindung
Spektrale Überlappung
Was ist Autofluoreszenz?
Laser regen nicht nur Fluorcrhome an, sondern auch Substanzen in der Zelle z.B. Flavine, Lipide etc.
Je komplexer die Zelle, desto größer ist die Eigenfluoreszenz
Eigenfluoreszenz abhängig von der Anregungswellenlänge
Was ist eine interne Negativkontrolle?
negative Population im selbeln Röhrchen wie die Probe
Vorteil: identische Behandlung von Negativpopulation und Zielzellen
kann oftmals eine zusätzliche Isotypenkontrolle überflüssig machen
Kombiniert Autofluoreszenz und unspezfische Bindung
was ist eine Isotypenkontrolle?
Analyse des unspezifischen Hintergrundes (Blank)
Essentiell, wenn keine interne negative Population vorhanden ist
Isotypen müssen an die selben Fluorchrome gekoppelt sein
Vorteil: Berechnung des relativen anstiegs der Fluoreszenzitensität
Was ist eine Spektrale Übersprechung?
Kontrolle erfolgt mit Einzelfärbungen für jedes verwendete Fluorchrom
Es sollten helle Signale verwendet werden
Da optische Filter nicht alle spektrale Überschneidungen der einzelnen Fluorchrome beseitigen können, ist eine elektronische Substraktion, die sog. spektrale Kompensation nötig, um diese Fluoreszenzen zu entfernen. Kompensation immer abhängig von den Verstärkereinstellungen.
Was ist eine spektrale Kompensation?
Durchflusszytometrische Messung von FITC- und PR-markierten Beads (ohne Kompensation)
FITC Emission ist auch bei derjenigen WL hoch, bei der das PE-Signal gemessen wird. Deshalb erscheinen die FITC-beads als falsch positiv für PE-Markierung
Durch die elektronische Kompensation erscheinen die PE-markierten beads nur als PE-markierten beads nur als PE-positiv und die FITC-markierten beads nur als FITC-positiv
Wie wird die Kompensation berechnet?
Wie können die Lymphozyten bei der Durchflusszytometrie getrennt werden?
Wie setzt sich ein Dot Plot zusammen?
Was für verschiedene Darszellungsmöglichkeiten in der Durchflusszytometrie gibt es?
Was ist FACS?
Ultraschall Generator zerlegt Zellsuspension am ausgang der Düse in einzelne Tröpfchen (nur eine Zelle pro Tropfen)
Bevor Suspension Düse erreicht, wird Fluoreszeztest gemacht
was ist das prinzip von FACS?
Fluorchromhaltige Zelle passiert das Messfnester, Fluoreszenzsignal gelangt zu Lichtdetektor (MT) und das gerät lädt Tropfen auf
Markierte Zellen reisen in geladenern Tropfen, unmarkierteZellen in ungeladenen tropfen, sodass die geladenen das elektrische Feld gelangen
Was ist besser an modernen Analysegeräten?
Jede Zelle trifft auf mehrere Laserstrahlen
Je nach Größe und Beschaffenheit der Zelle (auch Aufnahme von Farbstoffen) wird das Laserlicht unterschieldich stark gestreut
Computer wertet aus
Was ist die Sysmex Fluoreszenz-Durchlusszytometrie?
können fluoreszenzitensität von zellen messen, die vorher automatisch verdünnt und angeräbt werden
Messgröße reflektiert den Nukleinsäuregehalt der Zellen
Aufwändiges System mit behandelten Zellen, Photomultiplier detektiert auch schwache Signale und kann elektronische Signale umwandel bzw. verstärken
Fluoreszenzitensität der RNA und DNA des Kerns und zytoplasmatische Zellorganellen ermöglichen Analyse des SSC eine Differenzierung der normalen Zellklassen sowie eine Quantifizierung der unreifen Granulozyten
Aktivierte B-Zellen liefern durch hohen RNA-Gehalt der Ribosomen besonders hohe Fluoreszenzsignale udn bilden seperate Lymphozytenpopulation
Was ist ein DIFF-Scattergramm?
Wie werden Leukozyten gefärbt?
Pappenheimer Färbung nicht möglich
Zytochemische Färbung und Nachweis der CD-AG
Wie kann zytochemisch gefärbt werden?
Alkalische Leukozytenphosphatase-Färbung (ALP, LAP,NAP)
Alkalische Leukozytenphosphatase bei CML vermindert (<10) bei Entzündungen erhöht (>110)
Alpha-Napthylazetat-esterase (unspezifische esterase)-Färbung
Esterase positiv. Wichtig ist, ob unreife Leukämiezellen (Blasten) einer AL positiv sind
PAS (Periodic-Acid-Schiff)-Färbung
Grobkörnige PAS-positive (glycogenhaltige) Zelle bei ALL
(Myelo)-Peroxidase-Färbung (MPO)
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