Anna K So24

3 wichtigsten: UV/Vis bzw. DAD, RI und MS

-> UV- Vis-, Fluoreszenz-, chemischer Reaktions-, Brechungsindex-, Leitfähigkeits-, elektrochemischer-, massenselektiver- Detektor

Auswahl des Detektors richtet sich nach den Eigenschaften des Analyten

• UV/Vis bzw. DAD

  • Photometrische Detektoren

  -> UV/Vis- Detektor

  • erste Wahl für biogene Arzneistoffe sofern Chromophor vorhanden (Lichtabsorption)

    -> LM darf keinen cutt-off verursachen = keine wesentliche Eigenabsorption

  • robust, zuverlässt, wartungsarm, hohe Empfindlichkeit, verhältnismäßig preiswert

  • vielseitig einsetzbar

  -> DAD = Diode Array Detector (3D- Plot)

  • Weiterentwicklung des UV/Vis, daher muss auch ein Chromophor vorhanden sein

  • Mehrkanalphotometer -> Messung mehrerer Wellenlängen gleichzeitig

    -> gesamtes Absorptionsspektrum des Analyten messbar

  • schnelle Aussage über Ident. und Reinheit

  • z.T. kann auf Referenzsubstanzen verzichtet werden => Ident. mit Spektrenbibliothek (Auswertung als 3D-Plot)

• Fluoreszenz

  • für Sub. die zur Fluoreszenz angeregt werden können

  • 2 Filter: für die Anregungs- und Messwellenlänge

  • wenn sie selber NICHT fluoreszieren, können fluoreszierende Stoffe eingefügt werden

  • hohe empfindlichkeit, sehr selektiv

  • durch Derivatisierung kann man aus nicht fluoreszierenden Sub., fluoreszierende machen

  • wird gerne für AS- Analysen verwendet.

• chemischer Reaktionsdetektor

  • viele Sub. zu absorbierenden/ fluoreszierenden Derivate umsetzen, die sich empfindlicher und selektiver detektieren lassen. (für Sub. die eigentlich keinen Chromophor haben, die kann man so in messbare Substanzen überführen)

  • bei chromatographischen Trennungen, können Derivatisierungsreagenzien zugesetzt werden, zur nachsäulenderivatisierung

    -> Vorteil wenn man Nachsäulenderivatisierungen macht: KEINE nachträgliech Beeinträchtigung der chromatographischen Trennung

  • Voraussetzung: alles was nach Säulentrennung derivatisiert werden kann

  • auch gerne für Aminosäuren

  
  

• RI = refractive index

  • Brechungsindexdetektor

  • für Substanzen ohne Chromophor (Zucker, Polyethylenglycole, Polymere)

  • universell einsetzbar: nahezu jede gelöste Substanz verändert Brechungsindex

    -> Unterschied der Brechungsindizes von Elutionsmittel und Probe sollte möglichst groß sein

  • nur isokratische Trennung möglich => muss isokratisch sein, da KEINE Elutionsmittelgradienten möglich! (heißt, das LM muss immer die gleiche Zusammensetzung haben)

  • niedrige Empfindlichkeit = weniger empfindlich als UV- Vis

  • empfindlich auf Druck-, Temperatur-, und LM- Änderungen

  • das Elutionsmittel muss möglichst pulsationsfrei aus der Säule austreten

• Leitfähigkeitsdetektor

  • für dissoziierte Verbindungen möglich (in Form von Ionen) => muss also eine dissoziierte Verbindung sein.

  • Einsatz in der Ionenaustauschchromatographie

  • empfindlich, selektiv

  • messen kontinuierlich den Stromfluss zwischen 2 in dem Flüssigkeitsstrom befindlichen Elektroden (V konst.)

  • mit Wechselspannung (zur vermeidung von Polarisationseffekten)

• Elektrochemischer Gradient

  • Nachweis für oxidierbare/ reduzierbare Substanzen

  • Substanzen werden elektrochemsich im Rahmen voltammetrischer/ amperometrischer Verfahren erkannt

  • hohe Empfindlichkeit + Selektivität

  • eher Oxidation, da bei Reduktion schon geringste Mengen Sauerstoff stören!

• MS

  • HPLC- MS

  • Substanzen müssen ohne kaputt zu gehen, in die Gasphase übergehen

  • nicht nur detektion, sondern identifiziert auch

  • extrem hohe Empfindlichkeit

  • Massenspektren liefern zusätzliche Strukturinformationen

  • hoher apparativer Aufwand zur Kopplung der Geräte, daher technisch aufwendig und schwierig

  • häufig gekoppelt mit DAD- Detektor und electrospray- Ionisation (LC- DAD- ESI- MS)

  • Teuer

  -> Spray- Ionisation: die beschriebenen Probleme können gut durch Sprayverfahren gelöst werden.

  • Säuleneluat wird dabei unter Atmosphärendruck fein versprüht und ionisiert

  • = API (atmospheric pressure ionisation), ESI (Elektrospray- Ionisation), APCI (atmospheric pressure chemical ionisation)

a) Kümmel: Carum carvi - Apiaceae (Doldenblütler)

• Carvi aetheroleum (Öl) von Carvi fructus

• auch in Minze

• Carvon- Enantiomere können nur durch chirale GC getrennt werden!

-> S-Carvon (R-Carvon bei Minze)

b)

• Trenssäule

• Cyclodextrine bilden das Kernstück chiraler Kapillarsäulen

• Zucker als Ring (alles Kohlenhydrate)

• der gebildete Hohlraum eigent sich dazu, um Moleküle drinnen zu plazieren und die Bewegungsgeschwindigkeit der Durchströmenden Moleküle zu verringern.

• Flavonoid: Hyperosid

  • Referenzsubstanz (bei Johanniskraut, Sauerampfer)

  • Quercetin + Galaktose

= Triacylglyceride

• natürlich vorkommende Fette sind Gemische verschiedener Triacylglyceride (Glycerinester d. FS)

Funktion:

• sind wichtige Reservestoffe von lebenden Organsimen

Chemisch:

• Ester aus dreiwertigen Alkohol Glycerol und langkettigen Fettsäuren (FS)bzw. Triester von langkettigen Carbonsäuren (=Fettsäuren) mit Glycerol

• wasserunlöslich (lipophil)

Neutralfette

• =Triacylglyceride

• sind Fette, bei denen alle OH-Gruppen mit FS verestert sind.

Physikalisch:

• Fette:

  • sind bei Raumtemperatur fest

  • besitzen einen höheren Anteil von gesättigten FS

• Öle:

  • sind bei Raumtemperatur flüssig

  • besitzen höheren Anteil von ungesättigten FS

-> die physikochemischen Eigenschaften werden durch die Kettenlänge und Anzahl der DB bestimmt.

Fließmittel:

• Träger des Stofftransports über die Sorptionsschicht (stationäre Phase)

Elutionskraft:

• Maß für die Fähigkeit des Fließmittels Probenmoleküle in der mobilen Phase zu halten

• Abhängig von einer Vielzahl von Faktoren (Polarität des LM und der stationären Phase, Löslichkeit der Analyten in der mobilen Phase, Temperatur, …)

Elutrope Reihe:

• empirische Einordnung der LM nach Polarität

• Abhängig von verwendeter stationärer Phase

Aussage 1:

• falsch

• Spot ist blau, bis blau-grün (polares Fließmittel)

• Sprühreagenz: Anisaldehyd

Aussage 2:

• richtig

• Das Trennprinzip der DC beruht auf Adsorption. Apolare Substanzen eluieren schneller, da sie schwächer an der stationären Phase haften. Ein apolares Fließmittel wird verwendet, um apolare Substanzen zu eluieren.

Guaranae semen: Paullinia cupana; Sapindaceae (Seifenbaumgewächse)

• Coffein (Purinalkaloid)

Ephedrae herba: Ephedra sinica, E. distachya; Ephedraceae (Meerträubelgewächse)

• Ephedrin (Alkaloid)

Nicotianae folium: Nicotiana tabacum; Solanaceae (Nachtschattengewächs)

• Nicotin (Pyridinalkaloide)

Yohimbehe cortex: (Yohimberinde) Pausinystalia yohimbe; Rubiaceae

• Yohimbinhydrochlorid

Leicht stimulierend: dient eher als Lokalanästetikum

• Cocae folium; Erythroxylum coca; Erythroxylaceae (Rotholzgewächse)

• zunächst muss rel.-Enzymaktivität bestimmt werden.

• mit relativen Enzymaktivität + nach Lowry/ Potty bestimmten Proteingehalt [mg/ml], kann die spezifische Aktivität bestimmt werden

-> relative Enzymaktivität = Konz. des Edukts / Zeit

-> spezifische Enzymaktivität = zusätzlich im Nenner der Massengehalt des eingesetzten Enzyms [mg/ml]

b)

• Cosubstrat: Sauerstoff

• Klasse: Oxidoreduktase

Zweiter Punkt:

Co-Substrat bei der Phenolase-Reaktion:

• Ein Co-Substrat, das in der Phenolase-Reaktion eine Rolle spielt, ist Sauerstoff (O₂). In der Reaktion wird Sauerstoff verwendet, um die Substrate zu oxidieren, was zur Bildung von Melanin führt. Es kann auch ein zusätzlicher Cofaktor wie Cu²⁺ (Kupferion) vorhanden sein, da Phenolase ein Kupfer-abhängiges Enzym ist.

Enzymklasse von Phenolase:

• Phenolase gehört zur Enzymklasse der Oxidoreduktasen (EC 1), da es an der Oxidation von Phenolen zu Quinonen beteiligt ist, unter Verwendung von Sauerstoff als Elektronenakzeptor. Genauer gesagt, handelt es sich um eine Polyphenol-Oxidase, die mit Sauerstoff oxidiert.

Die Phenolase ist aus mehreren Untereinheiten aufgebaut, wobei die Untereinheit ein meist zweiwertiges Kupfer als Cofaktor besitzt. Zwei Kupfer bilden zusammen ein binucleäres Zentrum, es sind also mindestens zwei Untereinheiten für die Funktion des Enzyms nötig. Das Enzym kann zwei verschiedene Reaktionen katalysieren.    

I. Catecholase-Reaktion: Oxidation von ortho-Diphenolen zu ortho-Chinonen. Dabei werden zwei Elektronen auf eine Sauerrstoff übertragen.    

2. Cresolase-Aktivität: Oxidation von Monophenolen unter Einbau eines Sauerstoff-Atoms in ortho-Position. Dabei kann das gebildeter Diphenol zum Chinon weiteroxidiert werden.    

Durch die Zugabe von Cyanid zur Phenolase wird diese gehemmt. Grund dafür ist die Komplexierung des katalytischen Kupferatoms im Zentrum der Phenolase, die infolge dessen den Elektronentransport zwischen Sauerstoff und Substrat über die Oxidationsstufe + I nicht mehr gewährleisten kann. 

dieser Versuch wurde im Praktikum nicht besprochen

1) AK an homologe Primer Anlagern

2) RNA Sonde

• Southern Blotting

  -> Blotten = Nachweis durch spezifisch markierte DNA-Sonde

  -> Goldstandard für Nachweis homologer DNA-Sequenzen in einem Gemisch

  • über komplementäre Basenpaaung (Hybridisierung) -> erkennt Sequenzähnlichkeit

  • wird verwendet bei:

    • Genkartierung

    • Nachweis von Genfamilien

    • Kontrolle transgener DNA

  -> Blotting-Arten:

  • Southern-Blotting: DNA-Fragmente werden nach einer Gelelektrophorese auf eine Membran (hier: Nylonmembran) übertragen und dort durch spezifische markierte DNA-Sonde nachgewiesen

  • Methode des Kappilarblotting, daher Übertragung der Proben vom Agarose-Gel auf die Membran durch Kapillarkräfte (Flüssigkeitsdiffusion)

• PCR (polymerase Kettenreaktion) mit Gelelektrophorese; mit spezifischen Primern

  • erkennt Sequenzhomologie über Primerbindung

  • wenn sich Primer anlagern können, ist die Zielregion homolog genug

  • Nachweis durch Amplifikation -> klar interpretierbare PCR-Produkte

  
  

Voraussetzungen für ein Plasmid, um als Vektor eingesetzt zu werden:

• ori = Origin of replication, Replikationsursprung

  -> dadurch autonome Replikation (Vervielfältigung) des Plasmids in E.coli

• Multi-copy-Plasmide (effiziente Amplifikation)

  • effiziente Amplifikation

• geringe Molekülmasse

• MCS (multiple cloning site); Polylinker

  • möglichst viele Restriktionsschnittstellen, die sich überlappen.

  • hier wird DNA zur Klonierung eingebracht

  -> wird bei der Klonierung in die MCS ein Insert eingebaut, wird das lacZ-Gen unterbrochen und dadurch unwirksam gemacht. Es kann keine beta- Galactosidase gebildet werden.

• mindestens ein Selektionsmarker

  -> z.B. Antibiotikaresistenz

  • Ampicillin-Resistenz: codiert für beta-Lactamase -> spaltet beta-Lactamring -> Ampicillin wird dadurch unwirksam

(lacZ-Gen- Teil des lacZ-Gens für beta-Galactosidase, wird für Blau-Weiß- Selektion verwendet)

Theophyllin gehört zu den Purin-Alkaloiden. Stoffe, die auch gegen Migräne eingesetzt werden können, gehören zu den Ergot-Alkaloiden. Wärend von den Opioid- Alkaloiden Morphin am stärksten analgetisch wirksam ist, ist Codein eher antitussiv.

Die Biosynthese von Purinen ist ein komplexer, mehrstufiger Prozess, der in allen Zellen stattfindet und für die Synthese der Purin-Nukleotide (Adenosinmonophosphat (AMP) und Guanosinmonophosphat (GMP)) notwendig ist. Purine sind essentielle Bestandteile der Nukleinsäuren (DNA und RNA) sowie von energiehaltigen Molekülen wie ATP.

-> Ausgangspunkt: alpha-D-Ribose-5-phosphat (Ribose-5-phosphat) (Produkt des Pentosephosphatwegs) wird mit ATP umgesetzt (katalytische Reaktion)

• Aktivierung zu 5-Phosphoribosyl-alpha-Pyrophosphat (= Phosphoribosylpyrophosphat = PRPP) durch PRPP-Synthetase     

  -> Pyrophosphat = Diphosphat

• Bildung von 5-Phosphoribosyl-1-amin mit Amidophosphoribosyl-1-amin (Enzym: Amidophosphoribosyl-Transferase = Glutamin-PRPP-Amido-Transferase)

-> Reaktion 1-5: Bildung eines Imidazolrings

-> Reaktion 6-10: Aufbau des Pyrimidinrings... 

• Produkt: zu Inosin-5`-monophosphat (= Inosinmonophosphat = IMP), das volles Puringrundgerüst enthält 

• Geschwindigkeitsbestimmender Schritt: Bildung von 5-Phosphoribosylamin durch Übertragung der Aminogruppe von Glutamin auf PRPP mithilfe der Glutamin-PRPP-Amidotransferase (erster Schritt)

Gelelektrophorese von genomischer DNA

• dabei entstehen unterschiedlich viele detektierbare Fragmente durch restriktion mit Restriktionsenzym -> erkennbare Schienen

• links: Größenstandard

laut Prof: richtige Reihenfolge

1. Denaturierung von Sonde und markiertem Größenstandard

2. Zugabe zur Hybridisierungslösung

3. Inkubation bei 37°C => Anlagerung der Sonde an Zielsequenz (muss nicht immer Amp sein)

4. waschen bei erhöhter Temperatur 56°C => zur Entfernung nicht gebundener Sonde

=> der markierte Größenstandard lagert sich nur an den auf das Gel aufgetragenen und auf die Membran transferierten Lambdastandard, nicht bauf die Amp Sonde!