K So24

-> UV- Vis-, Fluoreszenz-, chemischer Reaktions-, Brechungsindex-, Leitfähigkeits-, elektrochemischer-, massenselektiver- Detektor

Auswahl des Detektors richtet sich nach den Eigenschaften des Analyten

• UV/Vis bzw. DAD

  • Photometrische Detektoren

  -> UV/Vis- Detektor

  • erste Wahl für biogene Arzneistoffe sofern Chromophor vorhanden (Lichtabsorption)

    -> LM darf keinen cutt-off verursachen = keine wesentliche Eigenabsorption

  • robust, zuverlässt, wartungsarm, hohe Empfindlichkeit, verhältnismäßig preiswert

  • vielseitig einsetzbar

  -> DAD = Diode Array Detector (3D- Plot)

  • Weiterentwicklung des UV/Vis

  • Mehrkanalphotometer -> Messung mehrerer Wellenlängen gleichzeitig

  • gesamtes Absorptionsspektrum des Analyten messbar

  • schnelle Aussage über Ident. und Reinheit

• Fluoreszenz

  • für Sub. die zur Fluoreszenz angeregt werden können

  • 2 Filter: für die Anregungs- und Messwellenlänge

  • wenn sie selber NICHT fluoreszieren, können fluoreszierende Stoffe eingefügt werden

  • durch Derivatisierung kann man aus nicht fluoreszierenden Sub., fluoreszierende machen

  • wird gerne für AS- Analysen verwendet.

• chemischer Reaktionsdetektor

  • viele Sub. zu absorbierenden/ fluoreszierenden Derivate umsetzen, die sich empfindlicher und selektiver detektieren lassen.

  • bei chromatographischen Trennungen, können Derivatisierungsreagenzien zugesetzt werden, zur nachsäulenderivatisierung

    -> Vorteil wenn man Nachsäulenderivatisierungen macht: KEINE nachträglcieh Beeinträchtigung der chromatographischen Trennung

  • auch gerne für AS

  
  

• RI = refractive index

  • Brechungsindexdetektor

  • für Substanzen ohne Chromophor (Zucker, Polyethylenglycole, Polymere)

  • universell einsetzbar: nahezu jede gelöste Substanz verändert Brechungsindex = weniger selektiv

    -> Unterschied der Brechungsindizes von Elutionsmittel und Probe sollte möglichst groß sein

  • nur isokratische Trennung möglich => muss isokratisch sein, da KEINE Elutionsmittelgradienten möglich!

  • niedrige Empfindlichkeit = weniger empfindlich als UV- Vis

  • empfindlcih auf Druck-, Temperatur-, und LM- Änderungen

  • das Elutionsmittel muss möglichst pulsationsfrei aus der Säule austreten

• Leitfähigkeitsdetektor

  • für dissoziierte Verbindungen möglich (in Form von Ionen)

  • Einsatz in der Ionenaustauschchromatographie

  • empfindlich, selektiv

  • messen kontinuierlich den Stromfluss zwischen 2 in dem Flüssigkeitsstrom befindlichen Elektroden (V konst.)

  • mit Wechselspannung (zur vermeidung von Polarisationseffekten)

• Elektrochemischer Gradient

  • Nachweis für oxidierbare/ reduzierbare Substanzen

  • SUbstanzen werden elektrochemsich im Rahmen voltammetrischer/ amperometrischer Verfahren erkannt

  • hohe Empfindlichkeit + Selektivität

  • eher Oxidation, da bei Reduktion schon geringste Mengen Sauerstoff stören!

• MS

  • HPLC- MS

  • nicht nur detektion, sondern identifiziert auch

  • extrem hohe Empfindlichkeit

  • Massenspektren liefern Strukturinformationen

  • hoher apparativer Aufwand zur Kopplung der Geräte, daher technisch aufwendig und schwierig

  • häufig gekoppelt mit DAD- Detektor und electrospray- Ionisation (LC- DAD- ESI- MS)

  • Teuer

  -> Spray- Ionisation: die beschriebenen Probleme können gut durch Sprayverfahren gelöst werden.

  • Säuleneluat wird dabei unter Atmosphärendruck fein versprüht und ionisiert

  • = API (atmospheric pressure ionisation), ESI (Elektrospray- Ionisation), APCI (atmospheric pressure chemical ionisation)

a) Kümmel: Carum carvi - Apiaceae (Doldenblütler) - Carvi aetheroleum (Öl) von Carvi fructus

• auch in Mandarinenschalen

• Carvon- Enantiomere können nur durch chirale GC getrennt werden!

b)

• Trenssäule

• Cyclodextrine bilden das Kernstück chiraler Kapillarsäulen

• Zucker als Ring (alles Kohlenhydrate)

• der gebildete Hohlraum eigent sich dazu, um Moleküle drinnen zu plazieren und die Bewegungsgeschwindigkeit der Durchströmenden Moleküle zu verringern.

• Flavonoid: Luteolin (Kamille)

  • liegen frei vor oder als Glykosid

  • hydrophile Stoffe

Marcus:

laut ChatGPT:

1. Fette und Öle sind lipophile (fettliebende) Substanzen, die in der Chemie hauptsächlich aus FS und Glycerin bestehen.

   • chemischen Unterschiede zwischen Fetten und Ölen erfolge aufgrund ihrer Konsistenz bei Raumtemperatur

-> Fette: bei Raumtemperatur fest (Butter, Schmalz)

-> Öle: bei Raumtemperatur flüssig (Pflanzenöl, Fischöl)

1. beide bestehen im wesentlichen aus Triglyceriden (Neutralfetten), bilden die chemische Grundlage dieser Stoffe.

• Triglyceride/ Neutralfette sind Ester, die aus einem Molekül Glycerin (Glycerol) + 3 Moleküle FS bestehen.

• Triglyceride = Triester der Fettsäuren (FS) mit Glycerin

-> Glycerin (C3H8O3) ist ein 3- wertiger Alkohol, der in seiner Struktur 3 Hydroxylgruppen (-OH) enthält

-> FS sind langkettige Carbonsäuren (R-COOH), wobei R eine Alkylgruppe ist. In Fetten sind es typerscherweise gesättigte oder ungesättigte FS

Reaktion zur Bildung von Triglyceriden ist eine Veresterung:

3 FS + Gly -> Triglycerid + 3 H2O

1. Fette und Öle unterscheiden sich in ihrer Konsistenz bei Raumtemperatur wegen der Eigenschaften ihrer FS

• Fette sind meist gesättigte Triglyceride, die bei Raumtemperatur fest sind. Haben höhere Schmelzpunkte, da die Moleküle durch gerade Struktur der gesättigten FS enger gepackt sind

• Öle bestehen häufig aus ungesättigten FS, die bei Raumtemperatur flüssig sind. Diese FS haben durch DB eine kürzere Packungsfähigkeit, was die Schmelztemperatur senkt

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• Chemisch: Fette und Öle sind Triglyceride (Ester aus Fettsäuren und Glycerin).

• Physikalisch: Fette sind fest und Öle flüssig bei Raumtemperatur, was auf den Gehalt an gesättigten bzw. ungesättigten Fettsäuren zurückzuführen ist.

Fließmittel:

• Träger des Stofftransports über die Sorptionsschicht (stationäre Phase)

Elutionskraft:

• Maß für die Fähigkeit des Fließmittels Probenmoleküle in der mobilen Phase zu halten

• Abhängig von einer Vielzahl von Faktoren (Polarität des LM und der stationären Phase, Löslichkeit der Analyten in der mobilen Phase, Temperatur, …)

Elutrope Reihe:

• empirische Einordnung der LM nach Polarität

• Abhängig von verwendeter stationärer Phase

laut ChatGPT:

Aussage 1:

• Falsch: Guajazulen ist ein blauer Farbstoff, der Spot ist in der Regel blau

• Korrektur: Durch Wasserdampfdestillation kann Guajazulen aus ätherischen Ölen gewonnen werden und auf der DC-Platte eindeutig nachgewiesen werden. Der Rf-Wert kann bestimmt werden und man sieht einen blauen Spot auf der Platte.

Aussage 2:

• könnte richtig sein.

• Das Trennprinzip der DC beruht auf Adsorption. Apolare Substanzen eluieren schneller, da sie schwächer an der stationären Phase haften. Ein apolares Fließmittel wird verwendet, um apolare Substanzen zu eluieren.

Guaranae semen:

• Coffein

Nicotianae folium:

• Nicotin

Yohimbehe cortex: Yohimberinde

• Yohimbinhydrochlorid

Chat GPT:

Erster Punkt:

• Spezifische Enzymaktivität ist ein Maß für die Aktivität eines Enzyms pro Menge Protein. Sie wird oft in Einheiten pro Milligramm Protein angegeben:

wobei U die Enzymaktivität in Einheiten (definiert als die Menge des Substrats, die pro Zeiteinheit umgesetzt wird) ist.

• Relative Enzymaktivität beschreibt die Aktivität eines Enzyms in Bezug auf eine Referenzbedingung (z.B. maximale Aktivität oder Aktivität bei einer bestimmten Temperatur):

Zweiter Punkt:

Co-Substrat bei der Phenolase-Reaktion:

• Ein Co-Substrat, das in der Phenolase-Reaktion eine Rolle spielt, ist Sauerstoff (O₂). In der Reaktion wird Sauerstoff verwendet, um die Substrate zu oxidieren, was zur Bildung von Melanin führt. Es kann auch ein zusätzlicher Cofaktor wie Cu²⁺ (Kupferion) vorhanden sein, da Phenolase ein Kupfer-abhängiges Enzym ist.

Enzymklasse von Phenolase:

• Phenolase gehört zur Enzymklasse der Oxidoreduktasen (EC 1), da es an der Oxidation von Phenolen zu Quinonen beteiligt ist, unter Verwendung von Sauerstoff als Elektronenakzeptor. Genauer gesagt, handelt es sich um eine Polyphenol-Oxidase, die mit Sauerstoff oxidiert.

• PCR (polymerase Kettenreaktion) mit Gelelektrophorese

  • Isolierung der DNA, mit Annealing.

  • Auswertung der Gelelektrophprese bei UV-Licht

dieser Versuch wurde im Praktikum nicht besprochen

chat GPT:

Damit pUC19 als Klonierungsvehikel bzw. Plasmid erfolgreich eingesetzt werden kann, sind folgende vier Faktoren notwendig:

1. Multiple Klonierungsstellen (MCS): pUC19 besitzt eine Multiple Klonierungsstelle, die eine Vielzahl von Restriktionsenzym-Schnittstellen enthält. Dadurch können fremde DNA-Fragmente an verschiedenen Stellen des Plasmids eingefügt werden, was die Flexibilität bei der Klonierung erhöht.

2. Selektionsmarker (z.B. Antibiotikaresistenz): pUC19 enthält ein Gen für die Ampicillinresistenz. Dies ermöglicht die Selektion von Bakterien, die das Plasmid erfolgreich aufgenommen haben. Nur Bakterien, die das Plasmid tragen, können in einer Umgebung mit Ampicillin überleben und sich vermehren.

3. Origin der Replikation (Ori): pUC19 enthält einen funktionalen Origin der Replikation, der sicherstellt, dass das Plasmid in Bakterien repliziert wird. Dies ermöglicht die Vervielfältigung des Plasmids und die Produktion von vielen Kopien des Klonierungsvektors.

4. LacZ-Gen (zur Blue/White-Selektion): pUC19 trägt ein funktionelles LacZ-Gen, das in ein Blue/White-Selektion-System integriert ist. Wenn ein Fremd-DNA-Fragment in das Plasmid eingefügt wird und das LacZ-Gen inaktiviert, führen die transformierten Bakterien zur Bildung von weißen Kolonien auf einem X-gal-haltigen Nährmedium (während Bakterien ohne Insert blaue Kolonien bilden). Diese Methode ermöglicht die einfache Identifikation von Bakterien mit einem erfolgreichen Klonierungsinsert.

Schritt 1: Bestimmen der Fragmente nach jedem Schnitt

• Wenn Enzym A bei Position 300 schneidet, wird die DNA in zwei Fragmente aufgeteilt: eines mit 300 bp und das andere mit 700 bp.

• Wenn Enzym B bei Position 700 schneidet, wird das Fragment, das von Enzym A nach dem Schnitt bei 300 bp erzeugt wurde, weiter in zwei Fragmente aufgeteilt. Das Fragment von 700 bp wird in zwei Fragmente mit einer Größe von 400 bp und 300 bp unterteilt.

Schritt 2: Fragmentgrößen

Nach dem Schneiden mit beiden Enzymen entstehen folgende Fragmente:

• Fragment 1: 300 bp

• Fragment 2: 400 bp

• Fragment 3: 300 bp

Wenn du also die genaue Sequenz und die Position der Schnittstellen kennst, kannst du die Fragmente berechnen, die durch das Schneiden entstehen.

Chat GPT:

Die Biosynthese von Purinen ist ein komplexer, mehrstufiger Prozess, der in allen Zellen stattfindet und für die Synthese der Purin-Nukleotide (Adenosinmonophosphat (AMP) und Guanosinmonophosphat (GMP)) notwendig ist. Purine sind essentielle Bestandteile der Nukleinsäuren (DNA und RNA) sowie von energiehaltigen Molekülen wie ATP.

Hier sind die grundlegenden Schritte der Purin-Biosynthese:

1. Vorbereitung und Bildung des Ribosephosphats (PRPP)

Der Prozess beginnt mit der Bildung von Phosphoribosylpyrophosphat (PRPP), einem wichtigen Vorläufermolekül. PRPP wird durch die PRPP-Synthase aus Ribose-5-phosphat (einem Zucker aus dem Pentosephosphatweg) und ATP gebildet.

Reaktion: Ribose-5-phosphat + ATP → PRPP + AMP

2. Bildung des Purinrings

Der eigentliche Purinring wird in mehreren Schritten direkt auf PRPP aufgebaut. Hierbei werden verschiedene Aminosäuren, Ein-Kohlenstoff-Verbindungen und ATP benötigt:

• Schritt 1: PRPP reagiert mit Glutamin (eine Aminosäure), wobei Phosphoribosylamine entsteht. Dies ist der erste Schritt der Purinsynthese und wird durch das Enzym Glutamin-PRPP-Amidotransferase katalysiert.

• Schritt 2–6: Der Phosphoribosylamin-Komplex wird durch eine Reihe von Enzymen (darunter Glycin, Glutamin, Formyl-Tetrahydrofolat (THF) und Aspartat) schrittweise weiter modifiziert, sodass schließlich der geschlossene Purinring (Hypoxanthin) entsteht.

  
  

3. Bildung von AMP und GMP

Nach der Bildung von Hypoxanthin wird es durch spezifische Enzyme weiter zu den Purinnukleotiden AMP (Adenosinmonophosphat) und GMP (Guanosinmonophosphat) umgewandelt:

• AMP wird durch die Adenylosuccinat-Synthase gebildet, indem Hypoxanthin mit Aspartat und GTP reagiert, wobei Adenylosuccinat entsteht, das dann in AMP umgewandelt wird.

• GMP wird durch die Inosinmonophosphat-Dehydrogenase gebildet, wobei Hypoxanthin zu Inosinmonophosphat (IMP) oxidiert wird und dann mit Glutamin und ATP zu GMP umgewandelt wird.

  
  

4. Regulation der Purin-Biosynthese

Die Biosynthese von Purinen wird streng reguliert, um eine Überproduktion von Purinnukleotiden zu verhindern. AMP und GMP regulieren ihren eigenen Syntheseweg negativ durch Feedback-Hemmung. Wenn die Konzentrationen dieser Nukleotide hoch sind, hemmen sie die Aktivität von Schlüsselenzymen wie der Glutamin-PRPP-Amidotransferase und anderen Enzymen der Biosynthese.

5. Wiederverwertung von Purinen (Salvage Pathway)

Neben der de novo-Synthese gibt es auch den Salvage Pathway, der es der Zelle ermöglicht, Purinbasen wie Adenin und Guanin wiederzuverwenden, anstatt sie vollständig neu zu synthetisieren. Hierbei werden die freien Purinbasen über spezifische Enzyme wie Adeninphosphoribosyltransferase (APRT) und Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) mit PRPP kombiniert, um AMP bzw. GMP zu bilden.

Zusammenfassung:

Die Biosynthese von Purinen umfasst mehrere Schritte, beginnend mit der Bildung von PRPP aus Ribose-5-phosphat und ATP. Der Purinring wird dann schrittweise mit Hilfe von Aminosäuren und Ein-Kohlenstoff-Gruppen aufgebaut. Nach der Bildung des Zwischenprodukts Hypoxanthin erfolgt die Umwandlung in die Nukleotide AMP und GMP. Dieser Prozess wird durch Feedback-Hemmung kontrolliert, um die Produktion der Purinnukleotide zu regulieren.