Sterilität und der ganze Bums

Unbedenklichkeit

und

Wirksamkeit

Zur Infektion des Patienten

und

Zum Verderb des Arzneistoffs

Methode 2.6.12

-Gesamtkeimzahl aerober Mikroorganismen (TAMC)

-Gesamtkeimzahl an Hefen und Schimmelpilzen (TYMC)

Methode 2.6.13

-Abwesenheit bestimmter Keime (z.B. E.coli, S.aureus, P.aerug.)

Erfüllen Prüfung auf Sterilität (2.6.1)

Sterilität: Abwesenheit lebensfähiger Mikroorganismen

Nein, sondern durch validierte Herstellungsverfahren: muss wirksam und reproduzierbar mögliche Mikroorganismen abtöten, ohne die Qualität des Produkts zu mindern.

In der Praxis gilt der SAL (Sterilitätssicherheit-Wert = sterility assurance level)

➝ Für gewähltes Sterilisationsverfahren gilt die Wahrscheinlichkeit, dass maximal 1 lebensfähiger Keim in 10⁶ sterilisierten Zubereitungen zu finden ist.

Also 10⁻⁶ = SAL

• Einsatz qualifiziertes, geschultes Personal

• Angemessene Räumlichkeiten

• Geeignete Geräteausstattung

• Möglichst geringe mikrobiologische Belastung vor Sterilisation

• Validierte Standardverfahren für alle kritischen Herstellungsschritte

• In-Prozess-Prüfungen von Kontamination der Umgebung und der Herstellung

Dampfsterilisation: 15 min., 121 ℃, 2 atm Druck

trockene Hitzesterilisation: 120 min., 160 ℃, 1 atm Druck

γ-Strahlensterilisation: 25 KGy (Absorptionsdosis)

Membranfiltration: 0,22 μm Porenweite

(Ethylenoxid-Gassterilisation)

Aufheiz- und Ablühlzeiten tragen mit zur Sterilisation bei ➝ Eigentliche Autoklavierzeit kann reduziert werden ➝ Zeit und energiesparend

Je größer die Temperatur und der Druck bei der Dampfsterilisation, desto stärker die Reduktion der Keime und desto kürzer die benötigte Zeit

Farbindikatoren

Sie verändern ihre Farbe bei Einwirkung von bestimmter Temperatur über bestimmte Zeit.

Bioindikatoren

Genormte Zubereitungen, die Sporen ausgewählter Bakterien (Bacillus, Clostridium) mit hoher Hitze- bzw. Strahlenresistenz enthalten und kontaminationsgeschützt gehandhabt werden können.

➝ Nach Einwirkung der Autoklavierbedingungen muss vollständiges Abtöten der Bioindikatoren nachweisbar sein.

Messung und automatische Aufzeichnung der Autoklavierbedingungen: Mit Thermometer und Manometer (Druck) im Autoklaven

• Reinhaltung der Umgebung (Luft, Oberflächen)

• Einsatz geschultes Personal für jeden Schritt

• Beachtung von Höchstlagerzeiten der Bestandteile vor der Abfüllung

• Erhaltung der Sterilität von Behältnis, Verschluss etc.

• Regelmäßige Kontrolle der o.g. Punkte inkl. chargenweiser Sterilitätsprüfung

• Simulation der Herstellungsverfahren mit Nährmedien

Mindestens Klasse 100 Luftgüte = max. 3000 Partikel/m³

Verhältnis Klasse zur Partikelzahl: Klasse 1 = max. 30 Partikel, 30 Partikel pro Klasse.

-Umgebungsbedingungen verhindern Kontamination während Prüfung

➝ z.B. aseptische Bedingungen unter LAF-Werkbank (Abzug ist falsch) im Reinraum, Sterilität des Nährmediums und der Arbeitsgeräte

-Testbedingungen erlauben Wachstum von Kontaminationskeimen

➝ Abwesenheit keimschädigender Maßnahmen und antimikrobieller Substanzen, Eignung des Nährmediums für mögliche Kontaminationskeime

1. Sterilität des Nährmediums

   • autoklaviertes Medium 14 Tage bebrüten ohne Wachstum

2. Eignung der Medien (Soja-Casein für aerobe; Thioglykolat für anaerobe)

   • Beimpfen mit Test-Mikroorganismen (10-100 Keime) und Bebrüten (3-5 Tage) ➝ Wachstum als Trübung sichtbar

3. Fehlen keimhemmender Zusätze in Zubereitung

   • Beimpfen der Probe mit Testkeim ➝ nach Bebrütung Wachstum

4. Einhaltung aseptischer Arbeitsbedingungen

   • Testdurchführung mit Nährmedien anstelle der Probe

   • Luftkeimzahlbestimmung (“Fangplatten”, Luftkeimzahlmessgeräte)

   • Oberflächenkeimzahl (“Abklatschplatten”)

Testprinzip ist die selektive Anreicherung

Zu Achten ist auf:

• Inaktivierung antimikrobieller Zusätze

• Ausschaltung inaktivierender Maßnahmen

• Mögliche Reaktivierung subletal (fast getötet) geschädigter Zellen (können sich erholen)

1. Lipid A bindet an Rezeptorproteine im Blut (LBP, sCD14) und auf Makrophagen (CD14)

2. Makrophagen bildet Cytokine (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α), die Fieber hervorrufen (endogene Pyrogene)

   Lipid A ist das stärkste Pyrogen, es können aber auch Virusbestandteile pyrogen wirken.

1. Erhöhung der Körpertemperatur bei Kaninchen (2.6.8)

2. Koagulation von Limulus-Amöbozytenlysat (2.6.14)

3. Bestimmung des IL-1 oder IL-6 Gehalts in Zellkulturen von Monozyten (2.6.30)

2.6.8 Prüfung auf Pyrogene (“Kaninchentest”)

• Auswahl geeigneter Kaninchen (Haltung, Gewicht, Gesundheit, Aufzucht)

• Vorprüfung mit pyrogenfreier NaCl-Lösung ➝ Fiebermessung

• Hauptprüfung mit mind. 3 Kaninchen:

  ➝ Anfangstemperatur mit 2 Messungen 30 min vor Probeninjektion

  ➝ Probe (0,5ml-10ml/kg KG) langsam intravenös injizieren

  ➝ Fiebermessung für 3 Stunden alle 30 Minuten

• Summe der Tempersturanstiege darf nicht >2,65 ℃ sein ➝ sonst Pyrogene festgestellt

2.6.14 Prüfung auf bakterielles Endotoxin (“Limulustest”)

Lysat aus Amöbozyten (“blaue Blutkörperchen”) des Pfeilschwanzkrebses wird für 3 Prüfungen auf bakterielles Endotoxin eingesetzt:

• Gerinnung des Lysats durch Endotoxin (Gelbildungsmethode)

• Trübung des Lysats durch Endotoxin (turbidimetrische Methode)

• Spaltung eines synthetischen Peptid-p-Nitroanilin-Substrats durch ein Endotoxin-aktivierbares Protein im Lysat (chromogene Methode)

  ➝ Testergebnis wird als Endpunkt oder kinetische Messungen bestimmt.

2.6.30 Prüfung auf Monozytenaktivierung (“MAT”)

• Blutserumpool (flüssigblut-Mischung) aus mind. 4 Spendern werden mit Probe versetzt

• Monozyten im Blut reagieren nicht nur auf bakterielles Endotoxin (BET) von gn. Bakterien, sondern auch auf Nicht-Endotoxin Pyrogene: z.B β-Glucan aus Pilzen und Lipoteichonsäure aus gp. Bakterien

• Monozyten binden Pyrogene über TLR (“toll-like receptors”) ➝ sezernieren Cytokine wie IL-1, IL-6 und TNF-α

• Diese Cytokine sind “endogene Pyrogene”, die mittels ELISA quantifiziert werden.

  Es wird auf Monozytenaktivierung durch Pyrogene getestet, nicht auf sie selbst.