1 Validierung

ICH (International Council of Harmonization) Q2 (R2)

Eindeutige Analyse einer Substanz oder einer Substanzklasse in z. B. Einen Gemisch verschiedener Substanzen

Analyse und Unterscheidung mehrerer Analyten nebeneinander in einer Probe

IR: CO Bande wird spezifisch erfasst, aber bei Vorhandensein mehrerer CO Banden im selben Molekül oder mehrerer Moleküle mit CO Banden kann nicht unterschieden werden. Nicht selektiv

Nachweis der zweifelsfreien, (quantitativen) Bestimmung

Bekannte Probe: Vergleich mit Standard (Positiv - und Negativprüfung), Störsubstanzen, Matrix

Unbekannte Probe: Variation der Methodenparameter, Schnelltests: z. B. Auftragung Peak-Breite vs. Retentionszeit

Konzentrationsbereich, für den gezeigt werden kann, dass die Methode geeignet ist

(Voraussetzung: Richtigkeit, Präzision, Robustheit und Linearität)

Korrelation zwischen dem gemessenen Signalen und der Konzentration

y = a + bx

Linearität durch den Koordinatenursprung

y = bx

• festlegen eines Konzentrationsbereichs: 80 - 120%

• Prüfung auf mind. 5 Konzentrationsniveaus (erst ab 5 Punkten sieht man eine Krümmung)

• Statistische Auswertung: Regressionsanalyse

• Kalibriergerade

• lineare Regression: y = ax + b

• Quadratische Regression

  y = ax^2 + bx + c

• Gewichtete Regression

Wert der Abweichung von der Kalibriergerade

• müssen normalverteilt sein, ansonsten hat man einen systematischen Fehler

• besser wenn kein Trend erkennbar

• Prüfung ob Unterschied zwischen linearer und quadratischer Regression signifikant ist

(Signal/Konzentration)/ Konzentration

🔼Signal / 🔼Konzentration

Maß, wie nahe der gemessene Wert am “wahren Wert” (Sollwert) liegt

Richtigkeit + Präzision

• Analyse mit zertifizierten Referenzstandard

• Ermittelter Wert wird mit “wahrem Wert” verglichen

• (Vereinfachte Variante: Doerffel-Test)

• Proben werden mit einer (möglichst unabhängigen, validierten) Vergleichsmethode untersucht

• Statistische Prüfung erfolgt über die Differenzen der Messung der verschiedenen Methoden

• (Differenz-t-Test)

• wieviel der eingesetzten Substanz bei einer Analyse “wieder gefunden” werden kann

• W = gemessener Wert / Sollwert * 100

• Stark durch Matrix und Aufarbeitung beeinflusst

• Auch eine Art der Standardaddition kann verwendet werden: zudosierung: bekannte Menge Analyt wird zudosiert, Verwendung von Analyt freier Probe mit Matrix

  W = c gemessen / c zugesetzt * 100%

• Maß der Übereinstimmung einer Serie von Messungen derselben Probe ODER

• Streuung der Ergebnisse einer Mehrfachbestimmung

• Schlechte Präzision überdeckt gute Richtigkeit

• Präzision: Streuparameter

• Richtigkeit: Lageparameter

• gleicher Analytiker

• Gleiches Gerät

• Kurze Zeitspanne

• Finden instrumenteller und zufälliger Fehler

• leicht unterschiedliche Bedingungen im gleichen Labor

• Aufzeigen der Robustheit der Methode

• Unterschiedliche Labore

• Untersuchung breiter Anwendung

• Grundlage für Ermittlung der Präzision

• Analyse von 6 - 10 Proben unter definierten Bedingungen

• Anzahl der Bestimmungen: Balance zwischen Verlässlichkeit und Kosten

• Statistische Auswertung: standardabweichung + Variationskoeffizient

• Messpräzision: Variationspräzision zwischen 1-2%

• Überprüfung mit dokumentiertem Nachweis, dass ein Prozess oder eine Methode vorher definierte, spezifische Merkmale zuverlässig und reproduzierbar erfüllt

Rechtliche bzw. regulatorische Gründe:

• Deutschland: §55 AMG (sorgt u.A. für Verbindlichkeit validierter AB-Methoden)

• EU (EMA): EU-GMP-Leitfaden (Annex 15)

• USA (FDA): cGMP

• International (ICH): Q2 (Validierung analytischer Verfahren), Q8/Q9/Q10 (Prozessvalidierung)

  Naturwissenschaftliche Gründe:

• Belastbarkeit für Entscheidungsgrundlagen

• Vergleichbarkeit zwischen Ergebnissen

• Patentfähigkeit

— Kontrolle von Fehlern!

• „Prozess zur Darlegung, ob eine Einheit zur Erfüllung festgelegter Anforderungen fähig ist"

• Beispiel: Überprüfung von Gerätespezifikationen: Erreicht die Lampenenergie des HPLC-Detektors einen bestimmten Wert?

• „Überprüfung auf eine typische Forderung (eines Gerätes)"

• Einzelnachweis: Erreicht der Detektor mit MeOH als Eluent bei 254 nm ein Basislinien-rauschen von unter 0,04 mAU?

• „Ermittlung von Leistungs- oder Verfahrensmerkmalswerten einer Methode einschließlich aller spezifischen Eigenheiten und Einflüsse"

• Beispiel: Die Flussgeschwindigkeit der HPLC ist auf 0,3 mL/min begrenzt, da das ESI-Interface sonst keine Zerstäubung gewährleisten kann.

• Einstellen eines Messgerätes zur Optimierung von z.B. Validierungsparametern

• Festlegung der Messabweichung am Messgerät

• Prüfung der Eichbehörde von einem Messgerät nach den entsprechenden Eichvorschriften (z.B. vorgeschriebener Toleranzbereich)

• unabhängige dritte Stelle bestätigt Einhaltung bestimmter Anforderungen

• Validierungsprotokoll: Nachvollziehbarkeit, Vergleichbarkeit, Regulatorische Pflicht (EMA, FDA …)

• Definierte quantitative oder qualitative Grenzwerte

• Entscheiden über „Bestehen" des Validierungsparameters

• Art der zu validierenden Methode

• Einsatzzweck

• Matrix

Regulatorische Anforderungen und SOPs

• Präzision als Prüfgröße: maximale akzeptable Abweichung zweier Analyseergebnisse der selben Probe

• r = 2,8 • Sr

• 95% der Differenzen durch zufällige Varianz abgedeckt, wenn:

• r ≤ 2,8 • sr

• Wiederholgrenze ist kein Validierungskriterium, sondern ein effizientes Werkzeug für Plausibilität

• „regulatorisch vorgeschriebener, akzeptabler Analysebereich für ein Produkt" im Eu. Pha.

• Regel: „Der Vertrauensbereich, also die zweifache Messunsicherheit, sollte nicht größer sein, als der halbe Toleranzbereich der Spezifikationsgrenzen."

„Limit of Detection" (LOD)

• Kleinste Menge/Konzentration eines Analyten, die mit „Ja/Nein-Entscheidung" vom Blindwert unterscheidbar ist

• S/N = ca. 3

• niedrigste Konzentration für ein eindeutig erkennbares Signal

• wesentlich vom gewählten analytischen Gerät abhängig

„Limit of Quantification" (LOQ)

• Geringste Menge/Konzentration des Analyten, die quantitativ mit akzeptabler Präzision und Richtigkeit bestimmt werden kann

• S/N = ca. 10

• Niedrigste Konzentration, die Reproduzierbar integriert werden kann

• wesentlich vom gewählten analytischen Gerät abhängig

• Reproduzierbarkeit einer Methode, bei Veränderung diverser Einflussfaktoren

• Chromatographie: pH-Wert der mobilen Phase, Flussrate, Temperatur, Laufmittelzusammensetzung, Saulenchargen

• Spektroskopie: Wellenlängengenauigkeit, Küvettenmaterial, Streulicht, Lösungsmittel

• Titration: Indikatorchargen, Konzentration der Maßlösung, Tropfgeschwindigkeit

• Statistische Vergleiche der Validierungs- und Methodenparameter (F-Test, t-Test, ...)

• Verifikation, für tagesaktuelle Tauglichkeit der Methode für den vorgesehenen Zweck

• Schutz vor „Blindflug" und damit Grundlage für gültige Ergebnisse

• Kriterien werden während der Methodenvalidierung ausgewählt

• Chromatographie: Retentionszeit, Auflösung, Theoriezahl, Peak-Symmetrie, Wiederholpräzision

• Spektroskopie: Extinktionskoeffizient bei Amax stabil?, S/N-Verhältnis

• Titration: Blindwerte, Farbumschläge, Standardabweichungen