Wie heißen die Richtlienien?
ICH (International Council of Harmonization) Q2 (R2)
Spezifität
Eindeutige Analyse einer Substanz oder einer Substanzklasse in z. B. Einen Gemisch verschiedener Substanzen
Selektivität
Analyse und Unterscheidung mehrerer Analyten nebeneinander in einer Probe
Beispiel nennen für spezifische aber nicht selektive Methode
IR: CO Bande wird spezifisch erfasst, aber bei Vorhandensein mehrerer CO Banden im selben Molekül oder mehrerer Moleküle mit CO Banden kann nicht unterschieden werden. Nicht selektiv
Ziel der Prüfung auf Selektivität
Nachweis der zweifelsfreien, (quantitativen) Bestimmung
Prüfung auf Selektivität: Vorgehen bei bekannter Probe und unbekannter Probe
Bekannte Probe: Vergleich mit Standard (Positiv - und Negativprüfung), Störsubstanzen, Matrix
Unbekannte Probe: Variation der Methodenparameter, Schnelltests: z. B. Auftragung Peak-Breite vs. Retentionszeit
Definition Messbereich, welche Voraussetzung müssen gegeben sein?
Konzentrationsbereich, für den gezeigt werden kann, dass die Methode geeignet ist
(Voraussetzung: Richtigkeit, Präzision, Robustheit und Linearität)
Linearität
Korrelation zwischen dem gemessenen Signalen und der Konzentration
y = a + bx
Proportionalität
Linearität durch den Koordinatenursprung
y = bx
Wie kann man die Linearität experimentell nachweisen?
festlegen eines Konzentrationsbereichs: 80 - 120%
Prüfung auf mind. 5 Konzentrationsniveaus (erst ab 5 Punkten sieht man eine Krümmung)
Statistische Auswertung: Regressionsanalyse
Kalibriergerade
Regressionsmodelle nennen + Geradengleichung
lineare Regression: y = ax + b
Quadratische Regression
y = ax^2 + bx + c
Gewichtete Regression
Residualanalyse
Wert der Abweichung von der Kalibriergerade
Abweichungen von der Kalibriergerade normalverteilt? Warum ist das wichtig
müssen normalverteilt sein, ansonsten hat man einen systematischen Fehler
Abweichungen von der Kalibriergeraden: Trend erkennbar?
besser wenn kein Trend erkennbar
Mandel - Test
Prüfung ob Unterschied zwischen linearer und quadratischer Regression signifikant ist
Responsefaktor
(Signal/Konzentration)/ Konzentration
Steigung der Geraden
🔼Signal / 🔼Konzentration
Richtigkeit
Maß, wie nahe der gemessene Wert am “wahren Wert” (Sollwert) liegt
Genauigkeit
Richtigkeit + Präzision
Richtigkeit: wahrer Wert bekannt, Vorgehen?
Analyse mit zertifizierten Referenzstandard
Ermittelter Wert wird mit “wahrem Wert” verglichen
(Vereinfachte Variante: Doerffel-Test)
Richtigkeit: wahrer Wert unbekannt, Vorgehen?
Proben werden mit einer (möglichst unabhängigen, validierten) Vergleichsmethode untersucht
Statistische Prüfung erfolgt über die Differenzen der Messung der verschiedenen Methoden
(Differenz-t-Test)
Richtigkeit - Wiederfindungsrate
wieviel der eingesetzten Substanz bei einer Analyse “wieder gefunden” werden kann
W = gemessener Wert / Sollwert * 100
Stark durch Matrix und Aufarbeitung beeinflusst
Auch eine Art der Standardaddition kann verwendet werden: zudosierung: bekannte Menge Analyt wird zudosiert, Verwendung von Analyt freier Probe mit Matrix
W = c gemessen / c zugesetzt * 100%
Präzision + Zusammenhang zur Richtigkeit
Maß der Übereinstimmung einer Serie von Messungen derselben Probe ODER
Streuung der Ergebnisse einer Mehrfachbestimmung
Schlechte Präzision überdeckt gute Richtigkeit
Präzision: Streuparameter
Richtigkeit: Lageparameter
Wiederholpräzision
gleicher Analytiker
Gleiches Gerät
Kurze Zeitspanne
Finden instrumenteller und zufälliger Fehler
Laborpräzision
leicht unterschiedliche Bedingungen im gleichen Labor
Aufzeigen der Robustheit der Methode
Vergleichspräzision
Unterschiedliche Labore
Untersuchung breiter Anwendung
Präzision - Mehrfachbestimmung
Grundlage für Ermittlung der Präzision
Analyse von 6 - 10 Proben unter definierten Bedingungen
Anzahl der Bestimmungen: Balance zwischen Verlässlichkeit und Kosten
Statistische Auswertung: standardabweichung + Variationskoeffizient
Messpräzision: Variationspräzision zwischen 1-2%
Validierung Definition
Überprüfung mit dokumentiertem Nachweis, dass ein Prozess oder eine Methode vorher definierte, spezifische Merkmale zuverlässig und reproduzierbar erfüllt
Validierung: Warum?
Rechtliche bzw. regulatorische Gründe:
Deutschland: §55 AMG (sorgt u.A. für Verbindlichkeit validierter AB-Methoden)
EU (EMA): EU-GMP-Leitfaden (Annex 15)
USA (FDA): cGMP
International (ICH): Q2 (Validierung analytischer Verfahren), Q8/Q9/Q10 (Prozessvalidierung)
Naturwissenschaftliche Gründe:
Belastbarkeit für Entscheidungsgrundlagen
Vergleichbarkeit zwischen Ergebnissen
Patentfähigkeit
— Kontrolle von Fehlern!
Qualifizierung (+Beispiel)
„Prozess zur Darlegung, ob eine Einheit zur Erfüllung festgelegter Anforderungen fähig ist"
Beispiel: Überprüfung von Gerätespezifikationen: Erreicht die Lampenenergie des HPLC-Detektors einen bestimmten Wert?
Verifizierung (+Beispiel)
„Überprüfung auf eine typische Forderung (eines Gerätes)"
Einzelnachweis: Erreicht der Detektor mit MeOH als Eluent bei 254 nm ein Basislinien-rauschen von unter 0,04 mAU?
Charakterisierung (+Beispiel)
„Ermittlung von Leistungs- oder Verfahrensmerkmalswerten einer Methode einschließlich aller spezifischen Eigenheiten und Einflüsse"
Beispiel: Die Flussgeschwindigkeit der HPLC ist auf 0,3 mL/min begrenzt, da das ESI-Interface sonst keine Zerstäubung gewährleisten kann.
Justieren
Einstellen eines Messgerätes zur Optimierung von z.B. Validierungsparametern
Kalibrieren
Festlegung der Messabweichung am Messgerät
Eichen
Prüfung der Eichbehörde von einem Messgerät nach den entsprechenden Eichvorschriften (z.B. vorgeschriebener Toleranzbereich)
Zertifizierung
unabhängige dritte Stelle bestätigt Einhaltung bestimmter Anforderungen
Warum muss während der Validierung dokumentiert werden?
Validierungsprotokoll: Nachvollziehbarkeit, Vergleichbarkeit, Regulatorische Pflicht (EMA, FDA …)
Akzeptanzkriterien und wovon hängen sie ab?
Definierte quantitative oder qualitative Grenzwerte
Entscheiden über „Bestehen" des Validierungsparameters
Art der zu validierenden Methode
Einsatzzweck
Matrix
Regulatorische Anforderungen und SOPs
Präzision - Wiederholgrenze
Präzision als Prüfgröße: maximale akzeptable Abweichung zweier Analyseergebnisse der selben Probe
r = 2,8 • Sr
95% der Differenzen durch zufällige Varianz abgedeckt, wenn:
r ≤ 2,8 • sr
Wiederholgrenze ist kein Validierungskriterium, sondern ein effizientes Werkzeug für Plausibilität
Spezifikationgrenze
„regulatorisch vorgeschriebener, akzeptabler Analysebereich für ein Produkt" im Eu. Pha.
Regel: „Der Vertrauensbereich, also die zweifache Messunsicherheit, sollte nicht größer sein, als der halbe Toleranzbereich der Spezifikationsgrenzen."
Nachweisgrenze
„Limit of Detection" (LOD)
Kleinste Menge/Konzentration eines Analyten, die mit „Ja/Nein-Entscheidung" vom Blindwert unterscheidbar ist
S/N = ca. 3
niedrigste Konzentration für ein eindeutig erkennbares Signal
wesentlich vom gewählten analytischen Gerät abhängig
Bestimmungsgrenze
„Limit of Quantification" (LOQ)
Geringste Menge/Konzentration des Analyten, die quantitativ mit akzeptabler Präzision und Richtigkeit bestimmt werden kann
S/N = ca. 10
Niedrigste Konzentration, die Reproduzierbar integriert werden kann
Robustheit
Reproduzierbarkeit einer Methode, bei Veränderung diverser Einflussfaktoren
Chromatographie: pH-Wert der mobilen Phase, Flussrate, Temperatur, Laufmittelzusammensetzung, Saulenchargen
Spektroskopie: Wellenlängengenauigkeit, Küvettenmaterial, Streulicht, Lösungsmittel
Titration: Indikatorchargen, Konzentration der Maßlösung, Tropfgeschwindigkeit
Statistische Vergleiche der Validierungs- und Methodenparameter (F-Test, t-Test, ...)
Qualifizierung (System Suitability Testing)
Verifikation, für tagesaktuelle Tauglichkeit der Methode für den vorgesehenen Zweck
Schutz vor „Blindflug" und damit Grundlage für gültige Ergebnisse
Kriterien werden während der Methodenvalidierung ausgewählt
Chromatographie: Retentionszeit, Auflösung, Theoriezahl, Peak-Symmetrie, Wiederholpräzision
Spektroskopie: Extinktionskoeffizient bei Amax stabil?, S/N-Verhältnis
Titration: Blindwerte, Farbumschläge, Standardabweichungen
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