P53

• Wichtigster Tumorsuppressor in human Zellen

• Hemmt unkontrolliertes Zellwachstum

• Aktiv bei: DNA-Schäden, oxidativem Stress, Replikationsstress

• Inaktiv bei meist allen Tumoren

• Steuert:

  • Zellzyklus-Arrest,

  • Seneszenz,

  • Apoptose

• Größe: 53 kDa

• Tetrameres Transkriptionsfaktor-Protein.

• Enthält:

  • Transaktivierungsdomäne,

  • Proline-reiche Region,

  • DNA-Bindedomäne,

  • Oligomerisierungsdomäne,

  • C-terminale Domäne.

• Ungestresste Zellen:

  Ubiquitinierung

  → schneller Abbau von p53 über Proteasom (über Mdm2)

• Gestresste Zellen:

  Posttranslationale Modifikationen:

  • Phosphorylierung

    → Schützt p53 vor Mdm2-vermitteltem Abbau → Aktiviert transkriptionelle Funktion → Typisch nach DNA-Schaden (z. B. durch UV/IR)

  • Acetylierung,

    → vermittelt durch CBP/p300

    -> Aktiviert p53, v. a. am C-Terminus → Fördert DNA-Bindung → erleichtert Transkription durch Öffnung des Chromatins

  • Methylierung (Me), Sumoylierung (Su), Neddylierung (Ne), ADP-Ribosylierung (ADPr)

    → Weitere Feinregulation der Funktion und Lokalisation von p53

    → wirken je nach Kontext aktivierend oder hemmend→ beeinflussen z. B. Subzelluläre Lokalisation, DNA-Bindung, Protein-Stabilität

→ in ungestressten Zellen:

• Mdm2 bindet an p53

• Mdm2 wirkt als E3-Ligase

  → Ubiquitinierung von p53

• Polyubiquitiniertes p53

  → Abbau durch 26S-Proteasom

→ Bei Zellstress:

• p53 wird an S15/S20 phosphoryliert

  → verhindert Mdm2-Bindung

• Mdm2 selbst wird gehemmt (z. B. durch p14^ARF, ATM-abhängige Modifikation)

  → p53 akkumuliert & wird aktiviert

→durch Zellstress (DSB, SSD, usw…) → bei Aktivierung wird der MDM2-vermittelte p53-Abbau unterdrückt = führt zur p53 Akkumulation im Zellkern → Ablauf der Aktivierung:

1. verschiedene Upstream Kinasen aktivieren p53 bei Zellstress

   • ATM (Ataxia telangiectasia mutated-Kinase) → wird bei DSBs aktiviert

   • DNA-PK → ebenfalls durch DSB (z.B. d. ionisierende Srahlung)

   • ATR → reagiert auf ssDNA (z.B. bei Replikationsstress)

   • P38 → reagiert auf sonstigen Stress (z.b oxidativen Stress, onkogene)

   • Chk1/Chk2, JNK… etc

   → diese Phosphorylieren p53 an Serin-/Threoninresten (z. B. S15, S20) → Folge: Stabilisierung von p53 (verhindert Interaktion mit Mdm2 → schützt vor Abbau)

2. Aktiviertes p53 → Expression von Zielgenen

3. Feedback: Rückkopplungsschleifen durch Mdm2 → aktiviertes p53 stimuliert die Expression von Mdm2

   • p53 → aktiviert Mdm2

   • Mdm2 → fördert p53-Abbau

   → So wird p53-Aktivität nach erfolgreicher Stressantwort wieder herunterreguliert

4. Downstream Ziele:

   • Zellzyklus-Arrest,

   • Seneszenz,

   • Apoptose

! Zusatz Info: DNA-Schaden (γ oder NCS) → Aktiviert ATM → ATM phosphoryliert Mdm2 an Ser-395 → Das führt zu schneller Inhibition und Degradation von Mdm2

• Negative Feedback-Loops erzeugen verschiedene Dynamiken:

  • Überdämpfung (overdamping) – blau → Keine Oszillationen, langsames Einschwingen

  • Gedämpfte Oszillation (damped oscillations)- rot → Abnehmende Oszillationen (realistisch für p53!)

    ->  In Zellpopulationen zeigt p53 gedämpfte Oszillationen aufgrund der Mittelung der heterogenen Einzelzelldynamiken

  • Ungedämpfte Oszillation (undamped oscillations) → Konstante Schwingung (nur unter speziellen Bedingungen)

    -> Live-Zell-Bildgebung mit fluoreszierenden Proteinen (p53-CFP, Mdm2-YFP) zeigt, dass p53 und Mdm2 in einzelnen Zellen gleichmäßige, ungedämpfte Oszillationen über mehrere Tage aufweisen.

    -> Wip1 ist ein p53-Zielgen, das über Hemmung von ATM/Chk2 (durch dephosphorylierung) ungedämpfte p53-Pulse ermöglicht

• das p53-Mdm2-Feedback Modell kann diese Dynamiken mathematisch nachbilden (Lev Bar-Or et al.). -> damit können zum Beispiel gedämpfte Schwingungen vorausgesagt werden

• Beispiel: → Nach einem Stresspuls (z. B. IR):

  • p53 steigt zuerst an

  • Mdm2 folgt mit zeitlicher Verzögerung

  • Mdm2 baut p53 wieder ab → p53 sinkt

  • Weniger p53 → weniger Mdm2 → p53 steigt erneut

  • Oszillationen dämpfen sich mit der Zeit (typisch für biologisches Feedback)

• Parameterraum der p53-Mdm2-Rückkopplung → Nur bei bestimmten Kombinationen aus:

  • p53-induzierter Mdm2-Produktion (p2max)Mdm2-induzierter p53-Abbau (1/kdeg) tritt ein oszillatorisches Verhalten auf.

  • Ist der negative Feedback zu stark oder zu schwach, → entstehen keine Oszillationen.

  • Das System benötigt ein dynamisches Gleichgewicht zwischen Aktivierung und Hemmung.

• p53-Impulse halten mehrere Tage lang an

• p53-Antwort ist pulsatil, nicht konstant

• starke Zell-zu-Zell-Variabilität

• gleiche Dosis ≠ gleiche Antwort

• Oszillationen durch negative Feedback-Loops (siehe nächster Abschnitt)

p53 & Mdm2 Feedback Loop:

• p53 induziert Mdm2 → Mdm2 baut p53 wieder ab → Puls endet

• zeigen regelmäßige, gedämpfte Oszillationen (können mehrere Tage andauern)

• p53–Mdm2-Loop allein reicht für Oszillationen (Nachgewiesen durch synthetische p53 aktivierung durch Zink [ZnCl2] – dadurch keine upstream Kinasen aktiv [wie ATM], aber dennoch gedämpfte Oszillationen erkennbar)

ATM Feedback Loop:

• DNA-Schaden → ATM aktiviert → ATM löst Reparatur aus → ATM wird durch Feedback deaktiviert

  → Fokus liegt auf Selbstbegrenzung des Signals (ATM → ATM ↓)

• Upstream-Kinasen (z. B. ATM) pulsen ebenfalls

  → z. B. durch Wip1-vermittelte Dephosphorylierung von ATM

p53-Wip1 Feedback Loop:

• p53 aktiviert Wip1 (Phosphatase)→ Wip1 hemmt ATM & Chk2

  → Fokus auf Rückkopplung auf Upstream-Signal

  → sorgt für ungedämpfte p53-Impulse notwendig

  → Ohne Wip1: Oszillationen werden gedämpft oder verschwinden

Analoges Signal:

• DSBs (Doppelstrangbrüche): Führen zu digitalem p53-Signalisierung

•  z.B. durch Neocarcinostatin (NCS) oder Gammastrahlung

• Mehr DNA-Schaden führt zu mehr Pulsen -> aber nicht zu stärkeren oder längeren Pulsen (Pulsdauer & Amplitude bleibt trotz höherem Schaden gleich)

  → Bei niedrigem Schaden: 1 Puls

  → Bei hohem Schaden: mehrere Pulse (aber gleiche Form)

Digitales Signal:

•  ssDNA (Einzelstrang-DNA): Führen zu analoger p53-Signalisierung,

• z.B durch UV-Bestrahlung

• durchschnittliche Amplitude nimmt mit Reaktion der Signaleingabe kontinuierlich zu

p53 reagiert nicht schwellenwertabhängig – Exzitabilität

• 53-System ist exzitable, nicht graduell -> Ein kurzer Input über Schwelle -> vollständiger p53-Puls

• Stärke & Dauer des Pulses sind unabhängig vom Input nach der Schwelle

• typisches Verhalten exzitabler Systeme (z. B. Neuron mit Aktionspotenzial)

Experimenteller Nachweis:

• Nach DNA-Schaden wurde Wortmannin hinzugegeben (hemmt ATM & PI3K) → trotzdem vollständiger p53-Puls →

• Interpretation: kurzer Aktivierungsimpuls reicht aus

• danach kaum weitere p53-Aktivierung → System „feuert“ nur einmal

Mechanistische Voraussetzung:

• Mdm2 muss rasch abgebaut werden → Ohne Mdm2-Abbau kann p53 nicht stark aktiviert werden (→ Schwellenmechanismus blockiert)

→ p53 pulsiert, solange DNA-Schäden (DSBs) vorliegen

→ Pulsanzahl & -dauer korrelieren mit Reparaturstatus (z. B. γH2AX-Foci)

→ Signalantwort ist dynamisch an Schadenstatus gekoppelt

→ Nach vollständiger Reparatur → keine weiteren Pulse

p53-System erkennt kontinuierlich den DNA-Schadenstatus und passt Antwort an

-> Messmethode:

Live-Imaging: p53-Verlauf + gleichzeitige Marker für DSBs (z. B. 53BP1 oder γH2AX) → Auswertung auf Einzelzellebene

-> Bedeutung: p53 reagiert nicht stumpf oszillatorisch, sondern adaptiv → nach vollständiger Reparatur → keine weiteren Pulse → effiziente Signalverarbeitung mit Schaden-spezifischem Timing

1. Molekulare Fluktuationen → Transkriptions- & Translations-Bursts (stochastisch). → Führen zu protein-level Schwankungen, z. B. p53-Pulsvariabilität.

2. Zellulärer Zustand → Unterschiedliche Stadien im Zellzyklus oder Differenzierungszustand. → experimentell erfassbar durch Marker + Live-Imaging.

3. Mikro-Umgebung → Unterschiedliche Signale durch Position, Nachbarn, Nährstoffe etc. → beeinflusst Signalantwort lokal (z. B. DNA-Schäden).

• Reparaturkinetik beeinflusst p53-Pulswahrscheinlichkeit nicht

  -> Zellen mit schneller/schlechter Reparatur zeigen gleiche Pulswahrscheinlichkeit bei gleichem Schaden

  → Methode: Einzelzell-Live-Imaging → Zellen mit langsamer oder schneller Reparatur pulsen gleichermaßen

• Zellzyklusphase hat keinen prägenden Einfluss auf p53-Aktivierung

  → Methode: DAPI-Färbung zur Phasenbestimmung (G1/S/G2) & Vergleich pulsender vs. nicht-pulsender Zellen

• Variationen im Zustand des p53-Netzwerk erklären unterschiedl. Zellantworten

  → Methode: Mathematisches Modell mit identischem DSB-Zeitverlauf, aber unterschiedlichen p53-Systemzuständen (z. B. Feedbackstärke, Proteinniveaus)

  → Methode: experimentelle Testung durch smFISH (Wip1-mRNA), Wip1-Induktion & Knockdown

  • smFISH zeigt stark variable Wip1-mRNA-Mengen zwischen Zellen

  • Induktion von Wip1 reduziert Pulswahrscheinlichkeit, ohne die Amplitude zu verändern.

  • Wip1-Knockdown (siRNA) führt zu mehr p53-Pulsen pro Zelle.

→ Wip1 reguliert die Schwelle für Puls-Auslösung, nicht die Pulsform (ab der p53-Pulse ausgelöst werden), wodurch Zellen mit gleicher DNA-Schädigung unterschiedlich reagieren können. → höhere Wip1-Werte → höhere Aktivierungsschwelle (aber keine veränderte Pulsstärke)

• p53 zeigt auch ohne DNA-Schaden spontane Pulse

  → Methode: Live-Imaging in unstimulierten Zellen → Pulse treten auch ohne exogenen Stress auf → Hinweis auf intrinsische „Erregbarkeit“ des Netzwerks

• p53-Pulse sind an Zellzyklus gekoppelt

  → Methode: In-silico-Synchronisation (Timelapse + PI-Färbung) → Pulse treten bevorzugt am G1/S-Übergang auf → Gilt für 1. & 2. Pulse im Zellzyklus (Histogramm zeigt Häufung)

• Zellzyklus-Taktung ist Voraussetzung für spontane Pulse

  → Methode: Cdk1-Inhibitor RO3306 → G2-Arrest → Folge: drastisch reduzierte Pulsfrequenz → Zellzyklusfortschritt nötig für spontane p53-Aktivierung

• Spontane p53-Pulse benötigen ATM-Aktivität

  → Methode: siRNA-Knockdown von ATM & ATR → Nur ATM-Knockdown reduziert Pulsfrequenz → Interpretation: spontane Pulse resultieren aus physiologischen DSBs, erkannt via ATM

• Spontane Pulse führen nicht zu funktioneller p53 aktivierung/Anwort (sondern nur DNA schäden) (spontane Pulse führen nicht zur starken p21 Induktion & damit nicht zur p53 aktivierung)

  → Methode: Live-Imaging von p53-Venus & p21-mCherry → spontanes Pulsieren bei "No Stress" bleibt funktional stumm → Nachhaltiger Schaden → ATM aktiviert → p53 stabil & modifiziert

• Dauer & Stärke des Inputs entscheiden über Output

  → Methode: Wortmannin (ATM-Inhibition) zeigt: kurzer Input → Pulse, aber kein p21-Ausdruck

• p53-Modifikationen sind notwendig für p21-Aktivierung

  → Methode: Western Blot zeigt: Wortmannin hemmt Phosphorylierung → keine Acetylierung → Acetylierung an K373/K382 & Demethylierung erhöhen p21-Expression → HDAC-Inhibitor (↑ Acetylierung) & SET8-Knockdown (↓ Methylierung) → beide führen zu ↑ p21 → Posttranslationale Modifikationen wirken als „Output-Filter“

-> von Notebook LM:

• Spontane p53-Pulse: p53 zeigt spontane Pulse unter nicht-gestressten Bedingungen.

• Korrelation mit Zellzyklus: p53-Pulse korrelieren mit dem Zellzyklus, wobei die Anzahl der Pulse während des Zellzyklusarrests abnimmt.

• Filtern spontaner Pulse: Spontane p53-Pulse aktivieren p21-Expression nicht. Posttranslationale Modifikationen (wie p53-Acetylierung) agieren als Filter: p53-Acetylierung erfordert kontinuierliche Kinase-Input.

→ Transiente Inputs (z. B. spontane, zellzyklusgetriebene Pulse):

• p53 wird nicht stabil modifiziert  

• keine p21-Induktion → funktionell stumm  

• kein dauerhafter Zellzyklusstopp

→ Nachhaltige Inputs (z. B. DNA-Schaden):

• führen zu posttranslational modifiziertem p53 (z. B. Acetylierung, Phosphorylierung)  

• „aktives“ p53 → aktiviert Zielgene wie p21  

• p21 steigt kontinuierlich

→ Modifikationen wirken als Signalfilter

• Nur modifiziertes p53 aktiviert Transkription → Unterscheidung zwischen kurz & lang

  
  

-> Signallverarbeitung: Proliferierende Zellen zeigen transiente Signalgebung, während geschädigte Zellen anhaltende Signalgebung aufweisen, die zu einer erhöhten p53-Acetylierung und damit zur p21-Induktion führt.

• ATM und Chk2:ATM ist für die initiale, aber nicht für die anhaltende p53-Reaktion erforderlich.

• Chk2 ist eine Checkpoint-Kinase, die für die regelmäßigen p53-Pulse unerlässlich ist.

• Chk2-Aktivität wird durch ATM initiiert, aber danach unabhängig aufrechterhalten.

• In Abwesenheit von Chk2 sind die verbleibenden p53-Pulse weniger regelmäßig.

• Chk2 ist ständig aktiv nach DNA-Schäden, und seine Aktivität korreliert mit der Anzahl der p53-Pulse.

• Chk2 reguliert p53 molekular, indem es MdmX phosphoryliert, was zu dessen Destabilisierung führt.

• Kinasen und p53-Pulsing: Andere PI3K-ähnliche Kinasen sind für anhaltende p53-Pulse entbehrlich, im Gegensatz zu ATM für die initiale Aktivierung.

• Einzelzell-Verfolgung: CRISPR/Cas9-Technologie ermöglicht die Visualisierung endogener Proteine (p53-YFP, p21-RFP, Cbx5-CFP) in ungestörten Zellen.

• p21-Antwort ist Heterogen: Die p21-Antwort in einzelnen Zellen ist heterogen, mit

  1. unmittelbaren &

  2. verzögerten Reaktionen.

• Zellzyklus-Abhängigkeit der p21-Dynamik:Zellen mit verzögerter p21-Dynamik landen in der G2-Phase und wurden ursprünglich in der S-Phase geschädigt.

• Die Dynamik der p21-Akkumulation ist zellzyklusreguliert, wobei S-Phasen-spezifischer p21-Abbau (vermittelt durch PCNA/CRL4Cdt2) eine Schlüsselrolle spielt.

• Akkumulation von nicht-abbaubarem p21 während der S-Phase führt zu genomischer Instabilität.

• p53-Dynamik und Zielgenexpression (smFISH):Single-Molecule FISH (smFISH) erlaubt die Quantifizierung der Genexpression in einzelnen Zellen.

• p53 aktiviert viele Zielgene, die an Zellzyklus-Arrest, DNA-Reparatur, Apoptose, Metabolismus usw. beteiligt sind (z.B. MDM2, CDKN1A, BAX, PPM1D, DDB2, SESN1).

• Zielgene werden p53-abhängig exprimiert und zeigen im Basalzustand eine heterogene Expression.

• Nach IR zeigen Zielgene spezifische Antworten.

• Transkriptionsmodi:Die Heterogenität der Genexpression kann durch kontinuierliche oder probabilistische Genexpression (Transkriptions-Bursts) erklärt werden.

• p53 erhöht die Burstrate (burst frequency) an den Promotern der Zielgene, während die RNA-Abbauraten weitgehend konstant bleiben.

• Die Promotoraktivität gruppiert sich entlang dreier Archetypen: transient, pulsierend und anhaltend.

• p53-Modifikationen und Promotor-Archetypen:Anhaltende p53-Akkumulation führt zu anhaltender Promotoraktivität.

• p53 wird zunehmend acetyliert, wenn der Abbau verhindert wird.

• p53-Methylierung trägt dazu bei, die Expression einiger Zielgene zu begrenzen (z.B. durch Smyd2 und Set8).

• Die beobachteten Effekte hängen von der p53-Dynamik ab.