Praktikum

• Sterilisation = abtötung oder Entfernung aller lebensfähigen Organismen einschließlich deren Dauerformen

  • Keimabtötung:

    • chemisch -> Begasung

    • physikalisch -> elektronenmagnet. Strahlung: UV/Ionisierung oder hohe temperaturen

  • Keimabtrennung:

    • bsp. Sterilfiltration -> Trennung MO & Medium

• aseptisch = steril (von allen lebenden Organismen befreites Objekt)

• Desinfektion = Abtötung nur von pathogenen MO

• in natürlichen Habitaten existieren vielfältige Mikrobengemeinschaften

• Anreicherung: durch gezielte Umweltbedingungen (z. B. pH, Nährstoffe, Sauerstoffverfügbarkeit) Wachstum best. Arten begünstigen & wenn mgl. von Begleitflora hemmen

  -> Selektion durch spezielle Medien oder Zusätze wie Hemmstoffe (Antibiotika, Farbstoffe) möglich

• Isolierung: Vereinzelung auf festen Nährmedien (2-3x wiederholen)

  → Reinkulturen = Kolonien aus einer einzigen Zelle durch vegetative Vermehrung hervorgegangen

• Stärke = pfl. Biopolymer aus 2 versch. Arten von Polysacchariden:

  • Amylose: lineare Kette [20-30%]

    -> 200-600 Glucose-Monomere über α-1,4-glycosid. Bindungen zu unverzweigten, aber spiralig gewundenen Kette verknüpft

  • Amylopektin: verzweigt / Seitenketten [80-70%]

    -> 2.000-200.000 Glucose-Monomere bilden verzweigte Kette, Seitenketten dabei über α-1,6-glycosid. Bindungen angeknüpft

• [viele Bakterien nutzen Stärke aus Umgebung als Energie- & Kohlenstoffquelle; aber: hochmolekulare Stärke kann nicht direkt von MO aufgenommen werden -> Bakterien bilden spezif. extrazelluläre Enzyme, die in unmittelbare Umgebung sekretieren => bauen große Polymere zu kleineren Einheiten (Mono- & Oligomere) ab -> werden dann in Zelle transportiert]

• 4 Enzym-Gruppen für Stärkeabbau:

  • Glucoamylase (Exoenzym): spaltet jeweils ein endständiges Glucose-Monomers ab

  • β-Amylase: greift an Kettenende eines Stärkemoleküls an (Exoglucanase) & spaltet Disaccharid Maltose ab => Maltose & β-Grenzdextrine

  • α-Amylase: greift α-1,4-glycosid. Bindungen innerhalb Stärkemoleküls an (Endoglucanase) => teils verzweigte Ketten untersch. Größe (Dextrine) & Maltose

  • Amylo-1,6-glycosidase (Pullulanase): greift innerhalb an, baut aber Seitenketten von Amylopektin ab => unverzweigte Ketten (Amylose / vollst. Glucose-Monomere) -> mit Iod nachweisbar

• Nachweis: Amylase-Test: Nährboden mit Lugolscher Lösung bedecken -> positive Reaktion = Entfärbung => Stärke vollständig abgebaut

• Stärkeabbau:

  • Bacillus subtilis -> +

  • Bacillus megaterium -> -

• Casein = Milchprotein, bildet mit Calcium-Phosphat sog. Casein-Micellen

  • wesentl. Casein-Fraktionen:

    • α(s1)- & α(s2)-Caseine

    • β-Caseine & κ-Caseine

  • enthalten keine Disulfidbrücken & hohe Anzahl an Prolin-Resten verhindert Bildung dicht gepackter, geordneter Sekundärstrukturen

  • Stabilität gegenüber Hitzedenaturierung durch Fehlen von Tertiärstrukturen

• Micellen enthalten polare hydrophile & apolare hydrophobe Bereiche -> guter Emulgator => starke Assoziation der Caseine in Wasser -> dort: Bildung kolloidaler Partikel = Casein-Micellen

  • innen: hydrophoberen Caseine

  • Hülle: aus hydrophile Bereiche & v.a. κ-Casein (weist mehr geladene Regionen auf)

• Bakterien produzieren Proteasen (Caseinsaen) -> spalten  Casein in lösliche AS, welche verwertet werden können

• Nachweis: „Nachweisreagenz“ ( in 1 N H2SO4 gesättigte Na2SO4-Lösung) zugeben -> Protease-positive Organismen = klare Zone => Caseinat zu AS abgebaut; Proteinase-neg. Organismen = flockige Präzipitat

• Stärkeabbau:

  • Bacillus subtilis -> +

  • Bacillus megaterium -> -

• Gr+, peritrich begeißelt, stäbchenförmig, saprophytisch, strikt aerob

• Bildung von Polyhydroxybutyrat (PHB) als Speicherstoff

• Stärkeverwertend

• Toleranz gegenüber hohen Kochsalzkonz.

• bildet Endosporen -> Hitzeresistenz

• im Boden, auf Pflenzenmaterial

• Gr+ Stäbchen, peritrich begeißelt (oder unbegeißelt), strikt anaerob

• Bildung von Granulose als Speicherstoff

• Stickstofffixierer (N2 -> NH3)

• bildet Endosporen -> Hitzeresistenz

• Gr-, stäbchenförmig (Ausnahmen durch Pleomorphie: ältere Kulturen -> eher kokkenförmig, auch kurze Zellketten), obligat aerob & nicht fermentierend

• einige Arten peritrich begeißelt oder sondern wasserlösliche Farbstoffe ab

• bilden austrocknungs- & UV-resistente Dauerstadien = Zysten

• hitzeempfindlich

• bilden auf kohlenhydrathaltigen Nährböden dicke Schleimhüllen (Schleimkapseln) aus Alginat -> Diffusionsbarriere & reduzieren Sauerstoffkonz.

• Stickstofffixierer auch trotz molekularem Sauerstoff durch sauerstoffempfindliches Enzym Nitrogenase

• Verwertung von Mannit als einziger C-Quelle

• Bestandteil unserer Mundflora

• Erreger von Karies

• immer nachweisbar (auch bei gründlicher Zahnhygiene)

• Nachweis auf MST-Agar

• fakultativ anaerob

• wachsen in Form von Haufenkokken

• ökolog.:

  • oppurtunistisch pathogen

  • apathogen -> Nahrungsmittelbereitung (S. carnosus)

• Habitat: Hautoberfläche von Warmblütern

• S. aureus:

  • auf oberen Nasenschleimhäuten (bei ca. 40% der menschl. Population)

  • besitzt Coagulase = Oberflächenprotein: spaltet Prothrombin des Blutplasmas -> überführt Thrombin in aktive Form -> spaltet Fibrinogen des Blutplasmas proteolytisch in Fibrin & ein kleines Peptid

• Nachweis auf Tellurit-Agar (Tellurit zu Tellur (metallisch) reduziert)

• Hämolyse = Auflösung der Erythrozyten (roten Blutkörperchen) mit nachfolgendem Abbau des Hämoglobins

• findet natürlicherweise im menschl. Körper statt, da Erythrozyten nach ca. 120 Tagen Lebensdauer abgebaut werden

  -> kann aber auch von MO verursacht werden:

  • Hämgruppe des Hämoglobins über oxidative Spaltung des Protoporphyrinrings abgebaut

  • hierbei: α-Methinbrücke entfernt -> Eisen(II), Kohlenmonoxid & Biliverdin (grünes Pigment) entstehen

  • Sauerstoff & NADPH benötigt

  • katalysiert von Enzym Häm-Oxygenase

  • Biliverdin anschl. zu Bilirubin (orangefarben) reduziert -> zu Urobilin (braun) abgebaut

• Nachweis auf Blutagarplatte

• 3 versch. Hämolysearten:

  • α-Hämolyse: unvollständig -> nur zu Biliverdin abgebaut => Vergrünung

    • keine Hämolysine gebildet -> noch intakte Erythrozyten

    • Streptococcus salivarius

  • β-Hämolyse: vollständig -> Hämoglobin vollst. abgebaut => Farblos

    • Hämolysin zerstört Erythrozyten

    • Staphylococcu aureus (sp.)

  • γ-Hämolyse: keine Veränderung

    • Staphylococcus epidermidis

• Darmbakterium

• als Indikator nutzbar

• Nachweis auf EMB-Agar (Eosin-Methylenblau) -> selektiv für Gr- Bakterien: haben höhere Toleranz gegenüber EMB-Komplexe als Gr+

  -> differenziert E. coli durch metallischen Glanz

• MO (v. a. Sporen von Pilzen & Bakterien) ubiquitär in Luft

• sichtbar auf offenen Nährplatten („Fangplattenmethode“)

• Bakterien mit gelben bis roten Kolonien besitzen intrazelluläre Farbstoffe

  • z.B. Carotinoide (Tetraterpenoide) -> Schutz vor UV & tox. Sauerstoffspezies

    
    

Was ist vorwiegend Vorhanden auf Luftplatten?

• Bakterien der Gattungen Micrococcus, Corynebacterium, Nocardia

• Vertreter der Sporenbildner: Bacillus & Streptomyces

• „Schimmelpilze“ (Ascomyceten wie Penicillium, Aspergillus & Hefen oder Mucorales, z.B. Rhizopus, Mucor) -> Sporen aus Boden mit Staub & Luft überall hin verbreitet

• ca. 1000x Vergrößerung & Auflösung ca. 0,2 μm

• Beobachtung lebender MO (bei EM nicht mögl.)

• Auflösungsvermögen (d):

  d = λ / A(0) + A(k)

  • λ = Wellenlänge des Lichtes

  • A(0) = numerische Apertur des Objektivs (Luft: ~1; Immersionsöl: ~1,5)

  • A(k) = numerische Apertur der Beleuchtung (Kondensor)

[versch. Typen von Lichtmikroskop & lichtmikroskop. Techniken

• Hellfeldmikroskop

• Phasenkontrastmikroskop

• Fluoreszenzmikroskop

• Dunkelfeldmikroskop

• Interferenzmikroskop]

• Hefe; Eukaryont

• rund bis oval

• ⌀ 1-10 μm

• aerob oder anaerob (Gärung)

• Sprossung

• Beweglichkeit: -

• Gr– Bakterium

• ovale, an verzweigten Stielen sitzende, unbewegliche Zellen

  oder: bewegliche, ungestielte ovale Schwärmerzellen

• Exosporen

• anaerob oder mikroaerob

• hetero- oder autotroph (PS)

• Beweglichkeit: +/-

• Gr+

• Kokken

• bildet Tetraden bzw. Pakete oder Trauben

• aerob

• Beweglichkeit: -

• Gr+

• stäbchenförmig

• peritrich begeißelt

• aerob

• Endosporen

• Beweglichkeit: +

• Gr–

• rund bis oval

• unverzweigt filamentös

• peritrich begeißelt

• aerob, autotroph (PS)

• Heterocysten mit Nitrogenase: differenz. Zellen für CO2-Fixierung & N2-Fixierung

• Beweglichkeit: + (ohne Flagellen)

• Gr–

• Spirillen

• motil

• aerob oder anaerob -> Gärung

• hetero- oder autotroph (PS)

• variabler, anpassungsfähiger Stoffwechsel

• Beweglichkeit: +

• Antibiotika hoch wirksam -> hemmen / kontrollieren Wachstum von MO

• β-Lactamantibiotika, v.a. Penicilline -> binden statt D-Ala irreversibel an Glykopeptidtransferase -> greifen sehr spezif. in Transpeptidierung & damit in Quervernetzung des Mureinsacculus ein

• Bakterien besitzen natürliche oder durch Gentransfer erworbene Resistenzen gegen Antibiotika -> Prüfung der Empfindlichkeit

• Verfahren der Resistenzbestimmung:

  • Strich-, Loch- & Zylindertest

  • Antibiotika-Blättchentest (schnell, genau, bequem & preiswert)

• Blättchentest (Kirby-Bauer-Technik):

  • auf Agarplatten Testbakterien sehr dicht animpfen -> darauf mit versch. Antibiotika versehene Blättchen legen -> Platten bebrüten: Bakterien wachsen

  • um Blättchen mit wachstumshemmenden Antibiotika -> kein Bakterienrasen => klarer Hemmhof

  • Hemmhof-⌀ bestimmen: Diffusion des Antibiotikums im Agar + Empfindlichkeit des betreffenden Bakteriums

  • aber: auch durch techn. Variablen (z.B. Größe des Impfinokulums, Bebrütungszeit & -temperatur, Mediumzusammensetzung, pH-Wert, Gasatmosphäre, Stabilität des Antibiotikums) -> Testbedingungen standardisieren & konstant halten

• Zylindertest:

  • Glaszylinder ca. 1mm in Mitte der Agarplatte eindrücken -> Bakterien von außen nach innen strichförmig animpfen -> 100 μl Penicillin G in Glaszylinder

• Penicillin (β-Lactam): hemmt Zellwandsynthese

• Kanamycin (Aminoglykosid): hemmt bakt. Proteinbiosynthese (bindet an 30S ribosomale Untereinheit)

• Pseudomonas putida -> Gr- : äußere Membran -> Antibiotika kommen nur schwer in Zelle => kleinerer Hemmhof (P) [15 mm]

  + Resistenz oder eingeschr. Permeabilität gegenüber K => kein / sehr kleiner Hemmhof

• Micrococcus luteus -> Gr+ : keine äußere Membran -> Antibiotika können leicht in Zelle eindringen => größerer Hemmhof (P) [30 mm]

  + keine natürl. Aminoglykosid-Resistenz => Hemmhof [20 mm]

* wahrscheinlich erworbene Resisitenz

• Gr-, Oxidase-negativ

• peritrich begeißelte (bewegliche) Stäbchen

• bilden keine Sporen

• fakultativ aerob -> respiratorisch (= Atmung) oder fermentativ

• Gärungsprodukte:

  • Säuren (Succinat, Lactat, Acetat, Formiat) & Gase (CO2, H2)

  • oder: überwiegend neutrale Verbindungen (Ethanol, Butandiol, u.a.)

  -> Einteilung in 2 Gruppen:

  • „gemischte Säuregärung“ betreibende

  • neutrale Endprodukte bildende

• Gattungen: Escherichia & Enterobacter

• E. coli: überlebt eine zeitlang außerhalb des Darmes & leicht nachweisbar

  -> geeigneter Zeiger fäkaler Verunreinigungen

• Enterobacter aerogenes: weit verbreitetes Bodenbakterium; E. coli sehr ähnlich

• Differenzierung anhand untersch. Stoffwechselprodukte

• Differenziert Gr+ & Gr-

• 3%ige KOH-Lösung + Zellmaterie vermischen

• Gr- : löst DNA (freigesetzt) -> schleimiger Faden

• Gr+ : nicht

• Differenziert Oxidase-c+ & Oxidase-c–

• Zellmasse kurz in TMPD-Lösung (N,N,N,N,-Tetramethyl-1,4-phenylen-diamin-dihydrochlorid) tippen -> fleckenförmig auf Filterpapier verteilen

• Oxidase-c+ : oxidiert Reagent -> Violettfärbung

• Differenziert Katalase+ & Katalase–

• 7,5%ige H2O2-Lösung auf Einzelkolonie tropfen

• Katalase+ : -> Bildung von O2-Blasen (Schaum)

• Differenziert & Identifiziert E. coli & E. aerogenes

• I: Indol-Test

  • Indolbildung: Tryptophan -> Indol + Pyruvat + Ammoniak

    [-> = Tryptophanase]

  • Nachweis: Kovacs-Reagenz => Rotfärbung in unpolaren Phase (Amylalkohol)

  • E. coli besitzt Enzym Tryptophan

• M: Methylrot-Test

  • Methylrot = Indikator: bei pH ≤ 4,4 => Rotfärbung

  • Nachweis: stärkere Säureproduktion von E. coli (gemischte Säuregärung)

• V: Voges-Proskauer-Test

  • Voges-Proskauer-Reaktion weist Acetoin indirekt nachweisen

  • Acetoin -> Diacetyl => reagiert mit Naphthol in alkal. Lösung zu rotem Farbstoff

    [-> = Oxidation an Luft]

  • E. aerogenes bildet pH-neutrale Stoffwechselendprodukte (2,3-Butandiol & Acetoin)

• C: Citrat-Verwertung

  • Citrat kann von Bakterien, die Enzym Citratlyase besitzen (z.B. E. aerogenes), verwertet werden -> sichtbares Wachstum

    + pH-Wert-Anstieg => Farbe des pH-Indikator Bromthymolblau im Medium: grün -> dunkelblau

• Wachstum Bakterienkultur = Vermehrung von Bakterienzellen durch Zellteilung (= Zunahme Bakterienanzahl)

• in Flüssigkultur: Zunahme der Zellzahl -> erhöhte Trübung des Kulturmediums

• Bestimmung der Trübung über quantitative Messung der Absorption einfallenden, monochromatischen Lichts (optische Dichte, OD) -> indirekte Bestimmung des Bakterienwachstums

• Einfachheit & Schnelligkeit der Trübungsmessung erlaubt Verfolgen des zeitl. Verlaufs des Wachstums (Wachstumskurve) einer Bakterienkultur

• meisten Bakterien vermehren durch Zweiteilung -> unter gleichbleibenden Bedingungen: bakt. Populationen verdoppeln sich in regelmäß. Zeitabständen

• => Zellzahl nimmt während jedes Zeitabschnittes um konst. Faktor zu = exponentielles Wachstum

  • enthält Einheitsvolumen einer wachsenden statischen Kultur N[0] Zellen, so beträgt Zellzahl N nach n Teilungen N[0] · 2^n

  • Generationszeit = Zeitintervall für Verdopplung der Zellzahl

  • Verdopplungszeit = Zeitintervall für Verdopplung der Zellmasse

  • wenn Zellzahl & Zellmasse in gleichem Maß zunehmen  

    -> Generationszeit (g) ≙ Verdopplungszeit (tD)

• momentaner Zuwachs an Biomasse (x) zum Zeitpunkt (t):

Im Versuch mit E. coli:

• Wachstumskurve von E. coli bei versch. Temperaturen:

  • x-Achse: Zeit [min]

  • y-Achse: Optische Dichte (OD 600)

• spezif. Wachstumsrate μ:

• mittlere Masseverdopplungszeit t[D]:

=> 37 °C ist natürliches Habitat -> beste Wachstumsrate

1. Exponentielle Wachstumsphase

   • rasche Zellzahl-Zunahme in nicht-kontinuierlichen ("batch") Kultur

     -> weiteres Wachstum limitierende Bedingungen: abnehmende Substratkonz., Sauerstoffmangel, pH-Änderungen, hemmende Stoffwechselprodukte

     => 1,5. Phase retardierten Wachstums

2. Stationäre Phase

• Bakterienzellwand enthält Peptidoglykan (Murein) als Stützskelett

• Murein = Heteropolymer aus:

  • N-Acetylglucosamin (GlcNAc)

  • N-Acetylmuraminsäure (MurNAc)

  • Verknüpft über β-1,4-glykosidische Bindungen

• Zerstörung des Mureins → Verlust der Zellwandfestigkeit → Lyse in hypotonem Medium

• Wirkung von Lysozym:

  • Lysozym hydrolysiert β-1,4-glykosidische Bindung zw. C-1 von MurNAc & C-4 von GlcNAc

  • zerlegt Muropolysaccharidkette zu Disaccharid GlcNAc-MurNAc

    → kann Bakterienellwand abbauen

  • Voraussetzung: Bindung muss zugänglich sein (abhängig vom Zellwandaufbau)

• Gr + Bakterien:

  • keine äußere Membran → Murein leicht zugänglich / angreifbar für Lysozym

• Gr – Bakterien:

  • besitzen äußere Membran mit stabilisierendem Ca^2+ → Murein geschützt vor Lysozym-Angriff

    => erst durch EDTA-Behandlung (entfernt Ca^2+) wird Murein für Lysozym zugänglich

• Eigenschaften von Lysozym:

  • kleines Enzym, ellipsoide Form, Molmasse: 14,6 kDa

  • besteht aus 129 AS; 4 Disulfidbrücken stabilisieren Struktur

  • Vorkommen (natürlich):

    • Tränenflüssigkeit, Speichel, Nasenschleim, Milch, Eiklar

    • Pilze, Pflanzensäfte, einige Bakterien (E. coli, Streptomyces), Bakteriophagen (T7-Lysozym)

  • Lysozym aus Hühnerei: eines der am besten untersuchten Enzyme