Anna K SoSe 22

1.Verseifung der Triacylglycerine mit NaOH

• Ölprobe unter Rückfluss in 2N methanolischer NaOH kochen

2.Veresterung der freien FS mit BF3 und Methanol

• Zugabe einer BF3/Methanollösung

• BF3 wird als Katalysator verwendet

1. 3.Aussalzen der Fettsäuremethylester bzw. Ausschüttung mit Petrolether

   • Zugabe von Petrolether, 2 min kochen u. abkühlen

   • zugabe gesättigter Kochsalzlösung

   • Phasentrennung (über Nacht) abwarten

-> durch Salzzugabe werden die gelösten Fettsäuremethylester ausgesalzen un gehen in Petroletherphase über

4.Isolierung der Fettsäuremethylester

• trocknen mit Na-Sulfat, LM abrotieren

-> erhält Lösung der FS-methylester mit den unverseifbaren Anteilen (Sterole)

• Fette und Öle sind Triglyceride, daher große, nicht flüchtige Moleküle mit hohen Siedepunkten

  • sind thermisch instabil im GC-Gerät

-> Triglyceride können nicht direkt mit GC analysiert werden

• daher Umwandlung in FS-Methylester (FAMEs)

  • Fette/Öle verseift oder transverestert/ umgeestert, dabei entstehen FS-Methylester (FAMESs)

-> flüchtig genug für GC; thermisch stabil; repräsentieren FS-Zusammensetzung

Palmitinsäure:

• C16

Arachidonsäure:

• C20:4

• Delta 5,8,11,14

Linolsäure:

• C18:2

• Delta 9,12

Ölsäure:

• C18:1

• Delta 9

Myristinsäure:

• C14

Omega-3-FS: Linolen- und Arachidonsäure

= equivalent chain length

• Äquivalente Kettenlänge

-> basiert auf Retensionszeit in der GC

• Zur Identifizierung und Charakterisierung von FS/ FS-methylestern

• ermöglicht Vergleich mit linearen Alkanen, da sie Anzahl der C-Atome sowie Position und Anzahl der DB berücksichtigt

• Droge: Salicis cortex

• Stammpflanze: Salix purpurae; S. alba

• Familie: Salicaceae

• Hauptwirkstoff: Salicin (Salicylglucosid)

Weitere:

• Saligenin (Salicylalkohol)

• Salicortin (Salicinester)

• Tremulacin (Salicinester)

• Salicylalkoholderivate

• Catechingerbstoffe

• Kaffeesäurederivate

• Flavonoide

• Hauptwirkung: Analgetisch, Antiphyretische

• antiphlogistisch

• Salicylsäure hemmt reversibel die Cyclooxygenasen COX1- und COX2

• Blockieren die Prostaglandinsynthese

Proteinbestimmung nach:

1. Warburg und Christian

• ermittlung der Absorption A bei den Wellenlängen λ1 = 260 nm und λ2 = 280 nm

• Berechnung des Proteingehalts mit der Formel:

1. Bradford

• Prinzip: verschiebung des Absorptionsmaximums mit Coomassie Brilliant Blue G- 250 von 465 nm nach 595 nm durch Komplexbildung mit Protein

• Messung der Extinktionsänderung bei 595 nm

• Eichgerade mit BSA Standard

1. Biuret

• Farbkomplex mit Biuret- Farbstoff (Cu2+)

• ergibt Blau

• Kolorimetrische Bestimmung

Therapeutisch:

• Kreislaufstörung, Durchblutungsstörungen

• Parkinson

• Migräneanfälle

-> Mutterkorn: Claviceps purpurae

• Familie: Clavicipitaceae

• Cocain ist der Benzoesäureester von Ecgonin und kommt vor in der Droge Cocae folium; Erythroxylum coca, Familie Erythroxylaceae Cocain wird in der Pharmazie/Medizin gelegentlich noch eingesetzt als Lokalanästhetikum. Der Stoff kann mit der allgemeinen Nachweisreaktion auf Alkaloide mit Dragendorff-Reagenz nachgewiesen werden.

• Fette (FS-Zusammensetzung)

• Terpene (ätherisches Öl)

• Steroide

• Alkaloide

- Identitäts- und Reinheitsprüfung für ätherische Öle => chromatographisches Profil

- Bestimmung von Fettsäuren in fetten Ölen => Fettsäure-Zusammensetzung

- Bestimmung von Sterolen in fetten Ölen

- Lösungsmittelrückstände

HPLC:

-> Adsorptionschromatographie (Auftrennung nach Polarität)

-> Stationäre Phase:

• Fest

• RP-Kieselgel C8 -> Unpolar

-> mobile Phase:

• flüssig

• Methanol/Wasser -> Polar

-> Detektor: DAD (270nm)

• UV-Vis-Detektor- Substanzen mit Chromophor, DAD (Diode Array Detector) als Weiterentwicklung erzeugt 3D-Ergebnis

• HPLC-Detektoren: UV/Vis bzw. DAD (Diodenarray), MS, RI (Brechungsindexd.) sind die 3 wichtigsten

GC:

-> Trennprinzip: wenn stationäre Phase …

• fest: Trennung = GSC, daher Adsorptionsvorgänge   

  -> Praktikum! 

• flüssig: Trennung = GLC, daher Verteilungsvorgänge

-> Mobile Phase: gasförmig (Trägergas N2)

• Trennung durch Dampfdruck (Siedetemperatur) und Polarität

-> Detektion:

• FID (Flammenionisationsdetektor)

• es gibt noch: MS, ECD (Elektroneneinfangd.), NPD (Stickstoff-Phosphor-D)

Ginkgotoxin (Pyridinderivat: 4-O-Methyl-Derivat von Pyridoxin)

• aus Samen (kaum in Blättern); Ginkgo biloba; Ginkgoaceae

• B6 Antivitamin

• Verzehr nicht erhitzter Samen kann zu Bewustlosigkeit und Lähmung führen

• Hemmt Stoffwechselwege die Vit. B6- abhängig sind.

  -> Hemmung der GABA-Produktion

  -> Hemmung der Glutamatdecarboxylase-Aktivität

  • sind 2 der wichtigsten Neurotransmitter.

Zur Kompetentmachung von E.coli-XL1-blue für die Transformation von pUC19 wird im Praktikum CaCl2 verwendet. Die angezüchteten Bakterien werden in der log (exponentielle) -Phase entnommen und ausplattiert. Zu beachten ist auch die Generationszeit von 20 min. Für den Erfolg der Transformation entscheidend ist außerdem, dass die gepickten Klone nach dem Bebrüten der Platte Ampicillin-haltigen (Antibiotikum) im LB-Medium behandelt werden. Alternativ kann als physikalische Transformationsmethode die Elektroporation mit kurzer elektrischer Spannung =Elektroporation verwendet werden.

Ja, nicht gehemmt und größere Enzymaktivität als bei Tyrosin, da hier direkt das Diphenol in (Di)-Keton umgewandelt wird.

homologe Primer: sind komplementär zu einer bestimmten Target-Sequenz (in verschiedenen Spezies)

• für hoch spezifische PCR + für ein spez. Gen

-> … sind exakt komplementät zur Ziel-DNA und ermöglichen eine spez. Amplifikation dieses Bereichs.

Heterologe/ Degenerierte Primer:

• um homologe oder parologe Gene zu amplifizieren (-> universele Primer)

• Gemisch aus ähnlichen Primer-Sequenzen die in einen degenerierten Code zusammengefasst werden

• zur Amplifikation unbekannter Gene aus ähnlicher Genfamilie

-> … enthalten Mischbasen oder Varianten, um Mutationen/ Polymorphismen in der Zielregion zu berücksichtigen. Sie binden an ähnliche aber nicht identische Sequenzen, was bei der Amplifikation von variabler DNA-Heterogenität hilfreich ist.

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Forward Primer:

• Startpunkt für die Taq-Polymerase am Antisense-Strang

Reverse Primer:

• Startpunkt für Taq-Polymerase am Sense-Strang

• Abspaltung der Phosphatgruppe vom Substrat

-> Umwandlung in ein lichtemittierendes oder farbiges Produkt

-> Visualisierung der Hybridisierungssignale auf der Membran

Meins:

1. Katalysiert die Umsetzung von farblosen BCIP (5-Brom-4-Chlor-3-Indoxylphosphat) zu Indoxyl-Intermediat.

2. Indoxyl-Intermediat oxidiert zu 5,5`-Dibrom-4,4`-Dichlorindigo => blau, unlöslich

3. gelbes NBT (Nitroblautetrazoliumchlorid) reduziert zu Diformazan => blau, unlöslich

=> 2 und 3 ist Redoxreaktion, die zum Dunkelblauen Farbstoff führt und die Stelle der AK-Bindung als Bande erkennen lässt.

-> alkalische Phosphatase ist eine Hydrolase.

! Letzte Aussage ist Richtig: In der Agarose-Gelelektroporese laufen DNA-Fragmente als Doppelstrang!!!

• Geraniol, Carvacrol, gamma-Terpinen, Linalool

• Thymi herba; Thymus vulgaris (echter T.); Lamiaceae

b)

• GC und dann Bestimmung des Gehalts nach der 100% Mehode (Normalisierung)

  • chromatographisches Profil mit Gehaltsbereich 100% Methode (Normalisierung)

Lückentext: Terpensynthese

In Pflanzen erfolgt die Terpensynthese über den MVA (Mevalonat) -Weg, in Bakterien dahingegen über den MEP (Methylerythritolphosphat) -Weg. Beide Wege liefern das Produkt DMAPP (Dimethylallyldiphosphat) und IPP (Isopentenyldiphosphat mit folgender Struktur (Strukturformel zeichnen). Mit seinem Strukurisomer reagiert es in einer Claisen-Kondensationsreakzion zu Geranylpyrophosphat.

-> gerne NH3:

• sorgt bei DC für bessere Trennung (z.B. Sub. Theobromin und -phyllin), indem störende WW mit Kieselgel unterbindet. Besserer Trennung

• bei Säuren saurer Modifier Essigsäure

• protoniert -> geringe Wechselwirkung mit polarer, stationärer Phase durch Vermeidung von Salzbildung ->

• Erhöhung des Rf-Wertes -> Tailing vermieden bessere Trennung

als Modifier verdrängt die Base damit der Fleck wegen der Lösung nicht verschmiert.

basisches Fließmittel erleichtert die Trennung und Identifizierung von Purinen durch:

1. erhöhung der Löslichkeit

2. Reduktion von Intermolekularen WW

3. Bessere chromatographische Trennung aufgrund pH-abhängiger Eigenschaften

4. Stabilisierung für eine genaue Detektion

HPLC -> Kalibrierung

DC -> Vergleich

b) HPLC

• DC Auswertung nach Augenmaß -> Gehalt kann sehr grob abgeschätzt werden

  -> Vorteil der DC: schnell

  -> Aber Subjektive und auch dadurch ungenauere Methode

  • Für genau Quantifizierungen nicht zu empfehlen

  
  

• HPLC als Methode der Wahl, da mit internem Standard (Picein) viel genauer.

  -> Liefert einen Wert, unabhängig von subjektiver Farbeinschätzung 

  • es besteht eine höhere Linearität zwischen der Analytkonzentration und Detektorsignalantwort

  • es können viele verschiedene Detektoren verwendet werden -> bessere Analysenmöglichkeiten

Alkaloide

Theophyllin gehört zu den Purin-Alkaloiden. Stoffe, die auch gegen Migräne eingesetzt werden können, gehören zu den Ergot-Alkaloiden. Wärend von den Opioid-Alkaloiden Morphin am stärksten analgetisch wirksam ist, ist Codein eher antitussiv.

-> Oberbegriff: Purinalkaloide (Theophyllin gehört zu den Xanthinen.)

• Alliinase -> Lyase

b) genuin = rein/ unverfälscht

• Nein, Alliin wird durch Alliinase zu Allicin.

Phenolase wird auch chloroplastische Polyphenoloxidase (früher: Catecholoxidase) genannt. Sie gehört zur Enzymhauptklasse der Oxidoreduktase. Sie ist ein bifunktionäres Enzym und kann je nach Substrat zwei Reaktionen katalysieren. Entweder von einem Monophenol zu einem Catechol o-Diphenol oder einem Catechol o-Diphenol zu einem o-Chinon Benzochinon. Dazu ist Sauerstoff Cofaktor und bindet im aktiven Zentrum an Kupfer. Gehemmt werdden kann das Enzym durch Ascorbinsäure Cyanid. Je nachdem wie sich die Strukturen zusammenlagern mit unterschiedlichen molaren Massen heißen sie Melanine Humologe.

1. geringe Molekülmasse

   • effiziente Transformation

2. Ori = origin of replication

   • Replikationsursprung

   • repliziert autonom

3. MCS (multiple cloning site), Polylinker

   • mehrere verschiedene Restriktionsschnitstellen, die sich überlappen

4. multi-copy-Plasmid

   • effiziente Amplifikation

5. mind. ein Selektionsmarker

   • Antibiotikaresistenzgen (Amp)

• nur DNA!

• daher nur die genomische DNA und die Plasmid DNA.

• Sticky Ends

• Blunt Ends

Vier verschiedene Typen:

• Typ I:

  • schneiden unvorhersehbar weit weg von der Erkennungsstelle, Nuklease- und Methyltransferase-Aktivität

  • benötigt ATP, S-Adenosylmethionin und Mg2+ als Cofaktoren

• Typ II:

  • schneiden an der palindromischen Erkennungssequenz

  • kein ATP-Verbrauch, nur Mg2+ als Cofaktor, keine Methyltransferaseaktivität

    -> - „sticky“ (klebrig, Nukleotide eines Stranges hängen über)

    -> oder „blunt“-ends (stumpf)

  • wird in der Molekularbiologie verwendet

• Typ III:

  • schneiden 20-25 Basenpaare von der Erkennungssequenz entfernt

  • ATP-abhängig

• Typ IV:

  • schneidet nur modifizierte DNA ( methyliert, hydroxyliert, glucosylhydroxyethyliert)

=> Schneiden immer nur DNA!

• Rhein; Rheum palmatum; Polygonaceae

Abb.2 ist Rutin

Abb. 3 ist Quercitrin

b)

• Rhein: Hydroxyanthrachinon

• Rutin und Quercetrin: Flavonolglykoside

a)

• cyclische Oligosaccharide (Stärke, Maisstärke)

• 1,4-glykosidisch- verknüpfte Glucosemoleküle

b)

• zur Enantiomerentrennung

  -> Cyclodextrin bildet das Kernstück der chiralen Kapillarsäule

  -> WW über H-Brückenbindungen und Dipol-WW

• Carvon oder auch von Steroiden

Ergolin-Grundgerüst:

b)

• Cabergolin -> Dopamin-Rezeptor Agonist zur Behandlung von Morbus Parkinson

• Dihydroergotamin -> Therapie von Migräneanfällen (nicht mehr zulässig)

• Bromocriptin -> bei Akromegalie (Hemmung der Wachstums-Ausschüttung)

a)

• Voraussetzung ist das lacZ-Gen (Teil des bakteriellen Lactose-Stoffwechsels.

• codiert Enzym: beta-Galactosidase

  -> Enzym spaltet normalerweise X-Gal (farbloses Substrat), dabei entsteht blauer Farbstoff (5-Brom-4-chlor-indoxyl)

• Blau = Enzym ist aktiv.

b)

nicht-rekombinante Zellen (E. coli + Plasmid)

→ blaue Kolonien: codierende Sequenz für das Enzym bleibt ununterbrochen

• Bakterien, die nicht-rekombinante Vektoren tragen, β-Galactosidase ist funktionsfähig und setzt X-Gal (gelb) in ein Indigo-Derivat (blau) und Galactose um

rekombinante Zellen (E. coli + Fremd-DNA + Plasmid)

→ weiße Kolonien (Leseraster verschiebt sich durch Insertion der Fremd-DNA codierende Sequenz für das Enzym wird unterbrochen da keine α-Komplementation)

• Bakterien, die erfolgreich rekombinierte Vektoren enthalten

1. Plasmide sind üblicherweise bei Prokaryoten vorhanden aber auch vereinzelt bei Eukaryonten.

2. Die Konfiguration des Promotors kann über die Funktionalität eines Gens entscheiden.

3. E.Coli kann zur Überexpression bestimmter Proteine verwendet werden.

-> alles richtig