Anna K 22/23

Die PCR ist ein Verfahren zur (vervielfältigung=) in-vitro Amplifikation von DNA Sequenzen.

Dafür werden folgende Komponenten benötigt:

1. DNA-Template: zu amplifizierende Sequenz (Template = Kontrollplasmid)

   • DNA, die als Matrize für die Amplifizierung dient

2. spezifisches Primerpaar: 2 Primer

   • Startpunkt der Polymerase + Begrenzung des Syntheseabschnitts

     -> Forward P. = Startpunkt der Taq-Polymerase am Antisense-Strang

     -> Reverse P. = Startpunkt für Taq-Polymerase am Sense-Strang

3. Taq-Polymerase:

   • hitzestabile DNA-Polymerase des Bakteriums (Thermus aquaticus)

   • zur Verknüpfung der dNTPs zu neuen DNA-Strängen

4. MgCl2 (Komplexbildung mit Nukleotiden als Substrat für Polymerase)

   • Cofaktor der Taq-Polymerase (Bilden mit dNTPs Komplexe

5. Pufferlösung

   • PCR-Puffer schafft geeignete Umgebungsbedingungen

6. dNTPs (Nukleotidmix)

   • Desoxyribonukleotidtriphosphat als Bausteine der DNA-Synthese

7. DMSO:

   • Erleichterung der Denaturierung der DNA und des Annealings (indem es die Stabilität der H-Brücken verringert)

1. Denaturierung -> 95°C

   • die doppelsträngige DNA wird aufgetrennt.

2. Annealing -> 50°C bzw. 58°C (T ist Primerabhängig)

   • Anlagerung der Primer an das Template

3. Elongation -> 72°C

   • Synthese des komplementären Strangs durch Taq-Polymerase

   • (Anlagerung der Polymerase und Verlängerung des Stranges)

Schritt 2 = Annealing: bei 50°C Anlagerung der Primer an das Template

-> Temperatur ist Primerabhängig, je nachdem welcher P. verwendet wird.

• von der Basensequenz und Länge des Primers (wie viele von welchen Basen kommen vor)

  -> bei Sequenzen mit viel Guanin und Cytosin ist die Temperatur aufgrund von H-Brücken höher.

Annealing: Primer binden an den jeweiligen Einzelstrang (5 °C unter der Siedetemperatur der Primer) =Hybridisierung der Primer an DNA (je ein Primer für jede Richtung)

• Im V 58°C

• entweder 50°C oder 58°C

-> Digoxygenin

• Naturstoffklasse: Cardenolide, Sesquiterpene

• Roter Fingerhut (Digitalis purpurea) u.a. Digitoxin, Plantaginaceae-> Herzglykosid

1. 4000 bp

2. 1000 bp und 3000 bp

3. 1250 bp 1000 bp und 1750 bp

b) 4000 bp

Candidatus Burkholderia crenata ist ein symbiotisches Bakterium. Es befindet sich in den Blattknoten von Ardisia crenata. Diese gehört zur Familie der Primulaceae. C. Burkholderia crenata produziert FR900359, was chemisch gesehen ein zyclisches Depsipeptid (Sekundärmetabolit) ist.

Das besondere ist die nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS) Biosynthese.

Besonderheit: 2 Thioesterase (TE)-Domänen im frs-Biosyntheseclusters (Bestandteil von FrsG und FrsA)

• die Zyklisierung des Peptids erfolgt durch Ausbildung einer intramolekularen Esterbindung mittels einer Thioesterase (TE) von FrsG. 

• die andere Thioesterase befindet sich im FrsA, das vom frsA-Gen codiert wird. Diese katalysiert die intermolekulare Veresterung (fügt Seitenkette an, diese ist wichtig für die FR900359 Funktion).

Besonderheitender Struktur:

• N-methylierte Amidbindungen

• Hydroxysäurebausteine-> Stabilisierung und Schutz gegen Peptidasen

• Eingefügte Seitenkette am β-Hydroxyleucin durch Esterreaktion entscheidend für Gq-Hemmung

• Die SDS-Page ist ein natives Analytik-Verfahren

  -> Falsch: denaturierendes Verfahren

  • nativ: in ihrer gefalteten Form aufgetrennt

• für den Erfolg der SDS-Page darf nicht gekocht werden

  -> falsch: bei nativ wird nicht gekocht

  • hier wird gekocht 95°C?

• DNA wandert vom Plus- zum Minuspol

  -> Falsch, genau umgekehrt

• bei der Bradford-Methode erfolgt die Auswertung anhand einer Geradengleichung.

  -> Richtig

• bei Warburg und Christian wird die Absorption bei zwei Wellenlängen im sichtbaren Bereich gemessen

  -> Falsch, im UV-Bereich

  • sichtbarer ist 400-780 nm

  • hier: 260nm und 280nm

• Bromphenolblau färbt die DNA-Banden an

  -> Falsch, markiert Laufmittelfront

  • ist ein Lauffarbstoff, der zur Sichtbarmachung der Probenmigration während der Elektrophorese dient, färbt aber nicht die DNA Banden.

  • Anfärben der Probe mit Bromphenolblau zur Verfolgung der Laufweite

• Glycerol ermöglicht das Einpipettieren in die Probentaschen

  -> Richtig, es erleichtert das befüllen der Taschen, durch erhöhung der Dichte

• Ethidiumbromid interkaliert in den DNA-Strang

  -> Richtig

1. Speicherlipide

• Triglyceride

1. Membranlipide bzw. Strukturlipide

• Phospholipide und Glykoside

Unterschied Fette vs fette Öle (physikalisch):

-> Fette sind bei Raumtemperatur fest, besitzen einen höheren Anteil von gesättigten FS

-> Öle sind bei Raumtemperatur flüssig, besitzen höheren Anteil von ungesättigten FS

• die physikochemischen Eigenschaften werden durch die Kettenlänge und Anzahl der DB bestimmt.

• Neutralfette (=Triacylglyceride) sind Fette, bei denen alle OH-Gruppen mit FS verestert sind.

1. DNA-Basen

   • Guanin und Adenin, Xanthin

1. Singanlübertragende Stoffe

   • cAMP und cGMP

1. Coenzyme

   • NAD, NADP und FAD

     
     

2. Energieüberträger

   • ATP und GTP

1. (Purin-)alkaloide

   • Coffein, Theophyllin

Allopurinol:

• Indikation: Gicht, Hyperurikämie

• Wirkungsweise: hemmt Xanthinoxidase (Enzym), reduziert Harnsäurebildung

• NW: Hautausschlag, Übelkeit, Kopfschmerzen

Mercaptopurin:

• akute/chronische myeloische Leukämie

• Indikation: akute lymphatische Leukämie (ALL)

• Wirkungsweise: Purinanalogon, hemmt DNA- und RNA-Synthese sich schnell teilender Zellen, Stört so den Purin-Stoffwechsel => Zytostatikum- hemmt Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPRTase)

• NW: Knochenmarksdepression, Leberfunktionsstörungen, Übelkeit/ Erbrechen  

Alliin -> Allylsulfensäure + [Brenztraubensäure + NH3] bzw. Aminoacrylsäure

2 Allylsulfensäuren -> Allicin

-> durch Enzym: Alliinase

-> Reaktion: beta-Eliminirungs-Desaminierung

-> Alliin befindet sich im Cytoplasma. Alliinase in der Vakuole

Allinase -> Lyase

-> Enzym: Alliinase

-> Reaktion: beta-Eliminierungs-Desaminierung

-> Alliin befindet sich im Cytoplasma. Alliinase in der Vakuole

1. Salicin wird zunächst durch die beta-Glucosidase von Bakterien in der Darmflora zu Saligenin umgewandelt.

2. Diese wird durch Oxidation in Salicylsäure umgewandelt => ist die aktive Form.

• Salicin ist das Prodrug von Salicylsäure

• metabolisiert durch beta-Glucosidase und Leberenzyme

-> Salicylsäure hemmt reversibel die Cyclooxygenase (COX), dadurch wird die Prostaglandin-bildung unterbrochen +Thromboxane-> Entzündungsreaktion bleibt aus.

-> Proazulene = Verbindungen (natürlich vorkommende Sesquiterpene?), die unter Wärmeeinfluss zu Azulenen dehydratisiert bzw. decarboxyliert werden

• daher ist Matricin ein Proazulen

• Azulen -> Chamazulen (blau)

-> Asteraceae

• Matricaria recutita (echte Kamille = Matricariae flos);

  • Matricin

• Chamaemelum nobile (Chamomillae romanae flos = römische K.)

• Achillea millefolium (Schafgarbenkraut = Millefolii herba)

  • Achillicin

• Haschisch = Harz aus Drüsenhaaren der weiblichen Cannabispflanze (aus Blütenständen)=> Hoher THC-Gehalt

• Marihuana = getrocknete Blütenblätter und Stängel der weiblichen Pflanze

b)

• Cannabis herba; Cannabis sativa L.; Cannabinaceae

• Hopfenzapfen = Humulus lupulus

Nein,

• Dragendorff´s Reagenz zur Detektion von tertiären-Aminen und Alkaloiden

• Cannabinoide haben keinen Stickstoff, sind keine Alkaloide

-> mit Echtblausalz

• rötlich, violett, orange

• bakterielle Aufnahme von freier DNA (meist Plasmid) aus der Umgebung auf..

  • (kontaktlose Aufnahme von DNA in eine kompetente Zelle/ ein kompetentes Bakterium)

• Konjugation

→ Das genetische Material einer Spenderzelle wird mit einer Kontaktstelle (Pilus) auf eine Empfängerzelle übertragen

• Transduktion/Transfektion

→ Das genetische Material eines Bakteriums wird über Bakteriophagen (Viren, die Bakterien infizieren) aufgenommen und auf ein anderes Bakterium übertragen

• ori = Origin of replcation, Replikationsursprung

  • autonome Replikation

• mindestens ein Selektionsmarker

  • (z.B. Antibiotikaresistenzgen)

• Polylinker, multiple cloning site

  • mehrere, verschiedene Restriktionsschnittstellen, die sich überlappen.

• multi-copy Plasmide

  • effiziente Amplifikation

• geringe Molekülmasse

  • effiziente Transformation)

• Aussagen über die Effizienz der Transformation

1. Kompetenzgrad

   • beschreibt die Kompetenz d. Bakterien, z.B. bei CaCl2- Methode zeitabhängig

   • optimale Inkubationszeit nach CaCl2-Behandlung

1. DNA-Struktur

   • Transformationsrate steigt, je kompakter die DNA vorliegt.

   • supercoloid-DNA zeigt höhere Anzahl an Transformationen, als open-circular DNA und lineare-DNA

2. eingesetzte DNA-Menge

   • es es gibt ein Optimum, ein weiterer Zusatz von DNA bewirkt keine erhöhung der Transformationsrate

3. Plasmidgröße

   • Transformationsrate sinkt, je größer das Plasmid

4. Temperatur

1) 0,62 kb und 6,38 kb

2) 0,57 kb , 0,62 kb und 5,81 kb

3) 0,04 kb und 6,96 kb

• Sticky Ends

  • überhängende Enden (kohäsive, klebrige)

• Blunt Ends

  • glatte Enden

Restriktionsenzyme schneiden DNA oder RNA sequenzspezifisch, indem sie an einer Phosphodiester-Bindung spalten und dabei entweder glatte Enden (engl. blunt ends) oder überhängende Enden (kohäsive, klebrige, engl. sticky ends) produzieren

= Restriktionsendonukleasen- finden sich hauptsächlich in Prokaryonten aber auch in Eukaryonten.

• dienen norm. der Abwehr von Fremd-DNA

Mechanismus:

• Bindung an Erkennungssequenz und Kontrolle, ob Organismus-spezifisches Methylierungsmustervorhanden

• Bei Fehlen → Schneiden der DNA

Vier verschiedene Typen:

Typ I:

-schneiden unvorhersehbar weit weg von der Erkennungsstelle, Nuklease- und Methyltransferase-Aktivität

- benötigt ATP, S-Adenosylmethionin und Mg2+ als Cofaktoren

Typ II: schneiden an der palindromischen Erkennungssequenz

- kein ATP-Verbrauch, nur Mg2+ als Cofaktor, keine Methyltransferaseaktivität-> 

- „sticky“ (klebrig, Nukleotide eines Stranges hängen über) oder „blunt“-ends (stumpf)

- wird in der Molekularbiologie verwendet

Typ III: schneiden 20-25 Basenpaare von der Erkennungssequenz entfern

t- ATP-abhängig

Typ IV: schneidet nur modifizierte DNA ( methyliert, hydroxyliert, glucosylhydroxyethyliert)

Unterscheidung von rekombinanten zu nicht-rekombinanten Plasmiden.

• Auf dem Klonierungsvektor befindet sich das lacZ-Gen, welches für die beta-Galactosidase transkribiert.

• Nach erfolgter Transkription und Translation des Gens, entsteht die beta-Galactosidase die den Indikator X-Gal zu einem blauen Derivat spaltet. => Bakterien ohne rekombinantes Plasmid

• Durch die Insertion des Frendgens in den Plasmid verliert das LacZ-Gen seine Funktion, wodurch keine beta-Galactosidase gebildet wird, die Bakterien mit rekombinanten Plasmid bleiben weiß.

lacZalpha-Komplementation

• Dient Kontrolle/ Identifizierung (gentechnischer Prozesse bei Herstellung) rekombinanter Bakterien

• Geeignete Plasmide/Vektoren tragen an der Insertionsstelle das Gen für die β-Galactosidase (lacZ)

• Werden diese Plasmide in kompetente Zellen von E. coli mit einer Deletion im lacZ-Gen transformiert, wird ß- Galactosidase codiert

• Dieser Vorgang wird als lacZ- Komplementation genannt

• Insertion der Fremd-DNA muss innerhalb der multiplen Klonierungsstelle des lacZ-Gens vom Plasmid erfolgen → Basis für die Methode

-> den Agarplatten wird ein chromogenes Substrat X-Gal zugegeben

-> ß-Galactosidase hydrolysiert X-Gal zu einer Verbindung, welche weiter zu einem unlöslichen Indigofarbstoff dimerisiert

nicht rekombinante Zellen (E. coli + Plasmid)

• blaue Kolonien codierende Sequenz für das Enzym bleibt ununterbrochen

• Bakterien, die nicht-rekombinante Vektoren tragen, β-Galactosidase ist funktionsfähig und setzt X-Gal (gelb) in ein Indigo-Derivat (blau) und Galactose um

rekombinante Zellen (E. coli + Fremd-DNA + Plasmid)

• weiße Kolonien (Leseraster verschiebt sich durch Insertion der Fremd-DNA, codierende Sequenz für das Enzym wird unterbrochen da keine α-Komplementation)

• Bakterien, die erfolgreich rekombinierte Vektoren enthalten

Laut Prof:

• der an die Digoxigeninmarkierte Sonde bindende Anti-Digoxigenin AK, dadurch das er an Enzym (HRP) gekoppelt ist, das zugegebene Substrat umsetzt.

  • HRP = Meerretichperoxidase

    -> ist ein Enzym, katalysiert die Oxidation von chromogenen oder chemilumineszierenden Substraten

=> und es dadurch nur an dieser Stelle zur Anfärbung der Membran kommt.

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Letzter Schritt müsste Detektion sein: (evt. auch der Hybridisierungdgang)

• während der Hybridisierung bindet Digoxygenin-markierte Sonde an die komplementäre Stränge vom Ampicillin-Resistenzgen

  • (Gensonde bindet an Plasmidfragment (Ampicillinresistenzgen))

  • (an Gensonde hängt schon das Digoxygenin (AG) dran)

• Spezifischer Antikörper gegen DIG wird in Lösung an die Markierungsgruppe der Sonde gekoppelt

• Antikörper ist seinerseits an Enzym "alkalische Phosphatase" gekoppelt

• Alkalische Phosphatase katalysiert den ersten Schritt  einer farbige Redox-Reaktion nach Zugabe des Substrates → Detektion

  → es können nur Fragmenre detektiert werden, die das amp-Gen aufweisen. Farbreaktion nur an Stellen, an denen Hybridisierung erfolgt ist

Southern-Blot:

• 1. Verdau der DNA mit Restriktionsenzymen

• 2. Auftrennung der Fragmente mittels Agarosegel-Elektroporese

• 3. Denaturierung der DNA mit NaOH Transfer der DNA-Fragmente auf die Nitrocellulose-Membran

• 4. Inkubation mit einer Digoxigenin-markierten DNA-Sonde

• 5. Waschen

• 6. Blockieren

• 7. Inkubation mit Anti-Digoxigenin AK markiert mit POD und anschließendes Waschen

• 8. Inkubation mit Substrat

• Restriktionsenzyme sind Lyasen

-> Falsch: Restriktionsenzyme sind Hydrolasen, keine Lyasen (diese hinterlassen DB). Sie schneiden die DNA an spezifischen Erkennungssequenzen.

• Restriktionsenzyme können nur im Polylinker von Plasmiden schneiden.

-> Falsch: Restriktionsenzyme können jede Erkennungssequenz schneiden, unabhäng davon, ob sie sich im Polylinker eines Plasmids oder woanders befindet.

• Restriktionsenzyme sind hitzeempfindlich

-> Wahr: die meisten Restriktionsenzyme stammen aus Bakterien und denaturieren bei hohen Temperaturen, da sie nicht aus Hitzestabilen Bakterien stammen, sondern aus normalen Bakterien.

-> außer die Taq- Polymerase

• taq-Polymerase ist ein Restriktionenzym.

-> Falsch: Taq-Polymerase ist eine thermostabile DNA- Polymerase, die in der PCR verwendet wird. Sie sind keine Restriktionsenzyme.

• genomische DNA besitzt keine Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme.

-> Falsch: genomische DNA kann Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme enthalten, da diese auf spezifische Basensequenzen basieren, die überall in der DNA vorkommen können.

• Restriktionsenzyme schneiden die WBB (H-Brückenbindungen) zwischen den Basenpaare.

-> Falsch: Restriktionsenzyme schneiden zwischen den Basenpaaren entlang der Phosphordiesterbindungen und trennen somit die DNA-Stränge.

Leinöl mit der Stammpflanze Linum usitatissimum L. und der Familie Linaceae wird vor allem bei Obstipation (Verdauungsbeschwerden) eingesetzt. Da es ungesättigte FS enthält, ist es daher leicht oxidierbar und wird schnell ranzig.

-> enthält v.a. die essentiellen FS Linolensäure und Linolsäure

Thymi Herba (Thymiankraut)

• Stammpfl.: Thymus vulgaris, T. zygris

• Familie: Lamiaceae

• Wirkungen:

  • expektorierend, antibakteriel, durchblutungsfördenrd

• Inhaltsstoffe: - Thymianöl, Lamiaceen-Gerbstoffe, Flavonoide, Triterpene

  -> 2 wichtigsten: Thymol und Carvacrol

-> DC und HPLC

DC:

• Auswertung nach Augenmaß -> Gehalt kann sehr grob abgeschätzt werden

• -> Subjektive und auch dadurch ungenauere Methode

• Vorteile:auch günstig, schnell, sehr geringe Menge an Untersuchungslösung, keine spezifischen Anforderungen

  -> Für genau Quantifizierungen nicht zu empfehlen, nur Abschätzung möglich

• Abhängig von Temperatur, Luftfeuchtigkeit und nur geringe Trennschärfe.

HPLC:

• HPLC als Methode der Wahl, da mit interner Standard ((Picein) viel genauer.

• bestimmung mit Hilfe einer Kalibriergeraden

• hohe Trennleistung + hohe Auflösung

• Liefert einen Wert, unabhängig von subjektiver Farbeinschätzung 

1. Bakterium Escherichia Coli

   • -> Insulin Produktion (herstellung rekombinanter Proteine)  

   • Klonierung von Genen

   • Vorteil: schnell wachsend, gut genetisch manipulierbar

2. Hefe Saccharomyces cerevisiae 

   • -> Insulin Produktion  (Produktion rekombinanter Proteine)

   • Expression eukaryotischer Gene, bei denen posttranslationale Modifikaitonen wichtig sind 

   • Vortiel: Eukaryot kann Proteine korrekt modifizieren

3. Chinese-Hamster-Ovary CHO-Zellen ->spez. Antikörper Produktion 

4. B-Lymphozyten aus Milz immunisierter Mäuse  ->spez. Antikörper Prodution

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neu:

• Bakterien: E.coli

• Hefezellen: Saccharomyces cerevisiae

• Säugetierzellen: Rattus-Gattung

• Insekten: Spodoptera frugiperda

• Pflanzen: Nicotiana tabacum

• Bei dem Stoff muss es sich um eine brennbare, organische Verbindung handeln + thermisch stabil/ Hitzestabil

• Das Signal des FID beruht auf der Ionenbildung bei der Verbrennung von Substanzen, die C-C und C-H Bindungen besitzen; universell

b)

• Faktoren, die die Signalgröße beeinflussen:

  • Trägergas

  • Säulentemperatur

  • Länge der Säule: je länger, desto bessere Trennung

  • Anzahl der theoretischen Böden

  • Konzentration und Volumen der Probe

• Mevalonat- Weg (MVA- Weg)

  • Ort: der Mevalonat-Weg findet im Cytosol von eukaryotischen Zellen statt

  • Vorstufen: Acetyl-CoA und Mevalonat

• MEP-Weg (Methylerythritolphosphat-Weg) = DOXP-Weg

  • Ort: in Plastiden (z.B. Chloroplasten) von Pflanzen und in Prokaryoten (Bakterien)

  • Vorstufen: Pyruvat, G3P (Glycerinaldehyd-3-phosphat)

    • über mehrere enzymatische Schritte entstehen die Schlüsselmoleküle IPP und DMAPP

Lückentext: Terpensynthese

In Pflanzen erfolgt die Terpensynthese über den MVA (Mevalonat) -Weg, in Bakterien dahingegen über den MEP (Methylerythritolphosphat) -Weg. Beide Wege liefern das Produkt DMAPP (Dimethylallyldiphosphat) und IPP (Isopentenyldiphosphat mit folgender Struktur (Strukturformel zeichnen). Mit seinem Strukurisomer reagiert es in einer Claisen-Kondensationsreakzion zu Geranylpyrophosphat.