Anna K SoSe23

Carvon (aus Carvi aetheroleum)

b)

• Stammpflanze: Carum Carvi

• Familie: Apiaceae

c) Enantiomerentrennung: chrirale Säule bei GC, HPLC

• Kernstück: Cyclodextrin

• chirale Phase ist entweder stationär oder im Falle der Flüssigkeitschromatographie der Eluent

• Prüfung auf chirale Reinheit. Die Carvon-Enantiomere können nur durch chirale GC getrennt werden

  -> durch chirale Phase unterschiedliche Retentionszeiten

-> Nachweis von Alkaloiden und tertiären Aminen

• setzt sich zusammen aus Bismutoxidnitrat, Säure + Kaliumiodid (z.B. Essigsäure)

• K-Tetraiodobismut-Komplex

Es entsteht:

• Kalium-Tetraiodobismutat-Komplex- dieser bindet mit dem protonierten basischen Amin ein schwerlösliches Ionenpaar-> Farbprodukt: gelb bis rotbraun

• Im Praktikum: bei Alkaloiden-bildung eines schwerlöslichen, orangefarbenen Komplexes zwischen protonierten basischen N (Zielverbindung) und Tetraiodobismutat-Anion (BiI4-)

Beide UV Messung, DAD mehr als eine Wellenlänge Ergebnisse in 3D

• UV/Vis, Diode array D. (DAD)-> Besonderheit an DAD: 3D-Auswertung

UV/Vis:

• erste Wahl bei biogenen Arzneistoffen sofern Chromophor vorhanden

• Robust, zuverlässig, wartungsarm, hohe Empfindlichkeit

• vielseitig einsetzbar

-> einzellwellenlänge, misst nur ein (oder wenige) definierte Wellenlängen gleichzeitig. Einzelner Photodetektor für ausgewählte Wellenlänge.

DAD (Weiterentwicklung) = Dioden array Detector:

• Mehrkanalphotometet -> Messung mehrerer Wellenlängen gleichzeitig- gesamtes Absorptionsspektrum des Analyten messbar durch polychromatischer Lichtquelle

  -> Array von Dioden empfängt das gesamte Spektrum. Volles UV/Vis-Spektrum

• schnelle Aussage über Identität und Reinheit

• z.T. kann auf Referenzsubstanzen verzichtet werden: -> Identifizierung mit Spektrenbibliothek 

• Auswertung als 3D-Plot

Coffein (Purinalkaloid)

a) 4 Signale

b) 10 H-Atome

Wirkmechanismus:

• Allicin als Sulfoxid reagiert mit SH-Gruppen (Cysetinresten) von Enzymen und hemmt diese dadurch

-> z.B. HMG-CoA- Reduktase.

-> Knoblauchzwiebel, Droge Alli sativi Bulbus, Stammpflanze Allium sativum L. und Familie Amaryllidaceae. Das Enzym Alliinase befindet sich in der Vakuole und wird bei der Zerstörung freigesetzt. Der aktive Hauptwirkstoff ist Allicin. Bei wässriger Hydrolyse entstehen Ajoene, S-Allylcystein bzw. Vinyldithiine und Diallylsulfid bzw. Allylsulfide. Daraus ergeben sich folgende Wirkungen: Hemmung der Cholesterinbiosynthese (lipidsenkend), Hemmung der Thrombozytenaggregation und Blutdrucksenkend -> geruchsaktiver Stoff.

-> Wirkungen: bakteriostatisch, virustatisch, fungizid

-> Indikation: Atheroskleroseprophylaxe. Allicin: Fibrinolytisch, Thrombozytenaggregationshemmend

a) Salicylalkohol, Saligenin

b)

Salicin ist das Prodrug!

• wird durch beta-Glucosidase der Darmbakterien aufgespalten zu Salicylalkohol (Abspaltung con Glykon).

• Geht in die Leber. Wird durch Leberzellen oxidiert und es entsteht Salicylsäure.

-> COX-Hemmer => Antiphlogistisch, Analgetisch

• hemmt reversibel die Funktion von Cyclooxygenase

• Hemmt Synthese von Prostaglandinen (entzündungshemmend)

c) Weidenrinde

Salicis cortex; Salix purpurae / S. fragilis; Salicaceae

Plasmide müssen strukturelle Voraussetzungen für die Klonierung aufweisen:

• ori = Origin of replcation, Replikationsursprung

  • autonome Replikation

• mindestens ein Selektionsmarker

  • (z.B. Antibiotikaresistenzgen)

• Polylinker, multiple cloning site (MCS)

  • mehrere, verschiedene Restriktionsschnittstellen, die sich überlappen.

• multi-copy Plasmide

  • effiziente Amplifikation

• geringe Molekülmasse

  • effiziente Transformation)

1) beta- Bisabolol

• Sesquiterpen

  • monocyclisches Sesquiterpen-Alkohol

2) Apigenin

• Flavon

3) Herniarin

• Cumarin

a)

Blattknoten von Ardisia crenata. Durch das symbiotische Bakterium “Candidatus burkholderia crenata”

• Gewinnung aus Extraktion der Ardisia crenata Blätter

• Rekombinant hergestellt mit E.coli

-> wird im Org. synthetisiert: Biosynthesecluster frs kodiert für eine nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS)

-> RF900359 reift in in die Signaltransduktion von Zellen ein, indem es Galphaq hemmt (GDT-GTP-Austausch) 

Besondere Strukturmerkmale:

• ist ein cyclisches Depsipeptid aus 8 Bausteinen:

  • 7 nicht-proteinogene AS + 1 proteinogenes AS

• verknüpft über Peptid- und Esterbindungen:

  • 2 benachbarte Esterbindungen

• besteht aus modi. AS + Carbonsäuren

• neben trans- auch cis-Konfigurierte Peptidbindung + Esterbindungen

• N-methylierte Amidbindung

• Hydroxysäurebausteine: stabilisierung und schutz geg. Peptidasen

-> Eingefügte Seitenkette am β-Hydroxyleucin durch Esterreaktion entscheidend für Gq-Hemmung

b)

Hemmt Gq-Proteine-> greift in die Signaltransduktion ein, hemmt Galphaq (GDP-GTP-Austausch)

• bindet an die “G alpha q”-UE des Gq-Proteins => Konformationsänderung

• keine Dissoziation von GDP

• Signalweiterleitung unterbrochen

c)

• Frassschutz

• bei Menschen bei Atemwegserkrankungen -> Relaxation der glatten Muskel

Ansamycin = Streptomyces collinus (Bakterium) = Ansatrinenin

a) Ansamycin aus Streptomyces collinus, Pseudonocardiaceae

b)

• Ansatrienin (Ansamycine), Ansamycotrienin (ist das selbe)

• Naphthomycin

c) ab hier laut Marcus nicht stimmig

-> Benzochinon Ringsystem, 3-Amino-5-hydroxybenzoesäure -> Claisen Kondensation

• weil es ein Doppelringsystem ist, ist es auch ein 1,4-Naphthochinon

• repetitive CLAISEN-Kondensationen mit Verlängerungseinheiten - Polyketidsynthese 

• Marcus: Napthalin, Benzochinon, Hydrochinon, Napthochinon

d)

1. BCIP ist das Substrat der alkalischen Phosphatase

   -> Richtig

2. Bei der SDS-Page kann zur Denaturierung der DNA auf der Membran SDS und Hitze genutzt werden.

   -> Falsch, SDS ist zur Trennung von Proteinen

3. die entgültige Hybridisierung wird bei mind. 80°C durchgeführt.

   -> Falsch, meistens bei 37-68°C

4. das Behandeln mit Vorhybridisierungslösung dient der Absättigung von ungesättigten Bindungsstellen.

   -> Richtig

5. das Backen dient der Denaturierung der DNA

   -> Falsch, Backen dient der Fixierung auf Membran

6. die SDS-Page ist das gewählte Verfahren zur Analyse von Plasmiden.

   -> Falsch, SDS-Page dient der Trennung von Proteinen

Cosmide sind Hybride aus Plasmiden und gamma-Phagen. Sie dienen zur Klonierung von Genen mit einer Länge von bis zu 40.000 bp. Als Selektionsmarker wird Antibiotikaresistenzgen genutzt. 

-> Antibiotikaresistenzgen ist meist Ampicillinresistenz

Richig/Falsch: Phenolase

1. Die Phenolase-Aktivität bei Tyrosin ist größer als bei Brenzkatechin.

-> Falsch

2. Bei der Reaktion von Tyrosin zu DOPA ist Sauerstoff das Cosubstrat.

-> Richtig

3. Bei der Kettenreaktion von Tyrosin zu DOPA-Chinon ist die

Hydroxylierungsreaktion der geschwindigkeitsbestimmende Schritt/ die erste Reaktion.

-> Richtig

4. Die Kalibrierung der Elektrode ist abhängig von der Zeit.

-> Richtig?

5. Bei der Umsetzung von Tyrosin erwartet man eine höhere relative Enzymaktivität.

-> Falsch

6. Über die spezifische Aktivität kann auf die Enzym-Konzentration geschlossen werden.

-> Richtig

a) Lysozym

-> Zellwand-Lyse (v. Bakterienzellen)

b) SDS

-> auflösung der Cytoplasmamembran

-> Denaturierung von Proteinen, nicht von DNA!

c) Chloroform/Phenol

-> Ausfällung von Proteinen + -Bestandteilen

d) Isopropanol

-> Präzipitation der DNA (Fällen)

• Isolierung besonders kleiner Fragmente

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-> durch QIAquick Gelextraction Kit (Fertigpackung mit folgendem Inhalt):

• QG-Puffer (Lösungspuffer)

• PE-Puffer (Waschpuffer)

• QIAquick Spin Columns

-> Sonde aus dem Gel extrahieren mittels QIAquick Gelextraction Kits (Säulenchromatographie)

• Bande der über PCR hergestellte markierte Sonde aus dem Gel ausschneiden mit Puffer versetzen und im Wasserbad (50 ºC) auflösen

• Isopropanol hinzugeben, vortexen und auf das Säulchen geben=> Isolierung besonders kleiner Fragmente

• Zentrifugieren

• Mit Puffer waschen und zentrifugieren

  => Waschschritt, bei dem Gelrückstände und Verunreinigungen entfernt werden

• Eppendorf-Hütchenwechseln und mit Wasser eluieren

• bis zur Verwendung bei -20 °C einfrieren

HPLC und DC

− Auswertung nach Augenmaß -> Gehalt kann sehr grob abgeschätzt werden

-> Vorteil der DC: schnell-> Subjektive und auch dadurch ungenauere Methode

• Für genau Quantifizierungen nicht zu empfehlen

-> HPLC als Methode der Wahl,

• da mit interner-Standard + Kalibriergerade viel genauer. Liefert einen Wert, unabhängig von subjektiver Farbeinschätzung 

• große Trennschärfe, hohe Bodenzahl

• präziser Dioden-Array-Detektor

Thymi herba (Thymiankraut)

• Thymus vulgaris / T. zygris

• Lamiaceae

b)

• Thymol und Carvacrol

  • sind die Hauptterpene

a) Aliinase

-> Lyase

b) Catecholoxidase

-> Oxidoreduktase

c) Restriktionsenzyme

-> Hydrolase

d) Taq-Polymerase

-> Transferase (Polymerasen sind Transferasen)

Nicotin:

Nicotianae folium

• Nicotiana tabacum

• Solanaceae

Scopoletin:

• als interner-Standard für Allicin (mit RP-HPLC)

• verwendung von Scopolethin als interner Standard (ähnliche, etwas kürzere Retentionszeit)

->Interner Standard (ISTD) Allicin ist sehr instabil und kann nicht als Interner Standard für eine quantitative HPLC- Bestimmung verwendet werden.

• Auswertung:- Peak 1: Scopoletin- Peak 2: Allicin

- Vorteile Scopoletin (ISTD):

• hat eine ähnliche Retentionszeit wie Allicin

• bei gleicher Wellenlänge wie Allicin detektiert-> wird jeder zu prüfenden Lösung in gleicher Menge zugegeben (daher INTERNER Standard)

  -> Unterschiedliche UV-Absorption von Scopoletin und Allicin wird durch Korrekturfaktor berücksichtigt

Allii sativi bulbus (Knoblauchzehe)

• Allium sativum

• Amaryllidaceae

a)

Trenn- und Sammelgel unterscheiden sich in:

• Variation der Acrylamidkonz. 

• der pH-Bedingungen innerhalb des Gels

-> Vorteile: höhere Bandenschärfe, bessere Trennung der Proteine verkürzte Laufzeit

Acrylamid-Lösung:enthält Acrylamid und Bisacrylamid

• Trenngelpuffer: 0,4 % SDS; 1,5 M Tris/HCl

  • hat kleinere Poren, Trennung der Proteine erfolgt nach ihrer Größe (da Acrylamidkonz. größer)

  • pH 8,8

• Sammelgelpuffer: 0,4 % SDS; 0,5 M Tris/HCl

  • hat größere Poren, konzentriert Proteine in einem dünnen Band, bevor sie ins Trenngel übergeht

  • pH 6,8

-> pH-Wert ist der entscheidende Faktor!

b)

• DNA denaturiert:

  • Laugen/ Säuren

  • erhitzen (+Harnstoff)

    
    

• Proteine denaturieren:

  • beta-Mercaptoethanol

  • SDS (Na-Dodecylsulfat) mit Hitze

ß-Mercaptoethanol:

• reduziert die evt. vorliegende Disulfiedbrücken zwischen Cystein

• Novoseven auf 2 Banden unterschiedlichen Höhen

SDS:

• bricht alle Sekundär-, Tertiär-, und Quartärstruckturen auf und schließt Protein in eine SDS- Mizelle ein

  
  

Hitze:

• unterstützt den Prozess der Denaturierung

1. Plasmid Fragment   

2. Gen-(sonde)   

3. DigoxygeninRest an Sonde gebunden (Marker)   

4. Enzym alkalische Phophatase "AP" + AK

5. chromogenes Substratgemisch (durch Enzym spaltend) NBT/BCIP - blauer Farbstoff

-> laut Prof: Enzym: HRP Meerretichperoxidase

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Laut Prof:

• der an die Digoxigeninmarkierte Sonde bindende Anti-Digoxigenin AK, dadurch das er an Enzym (HRP) gekoppelt ist, das zugegebene Substrat umsetzt.

  • HRP = Meerretichperoxidase

    -> ist ein Enzym, katalysiert die Oxidation von chromogenen oder chemilumineszierenden Substraten

=> und es dadurch nur an dieser Stelle zur Anfärbung der Membran kommt.

1. Warburg-Christian:

   • Absorption einer Proteinlösung, Messung bei den 2 UV-Wellenlängen 260 nm und 280 nm

   • beruht auf dem Gehalt an aromatischen AS in Proteinen

   • ungenaue Methode!

   • Formel:

1. Bradford

   • Kolorimetrisch; Verschiebung Absorptionsmaximum Coomassie Brilliant Blue G-250 von 465 nm nach 595 nm durch Komplexbildung mit Protein.

   • durch internen Standard (BSA= Rinderserumalbumin) und Verdünnungsreihe/ Kalibriergerade

2. Lowry/ Potty:

   • 1.Biuret-Reaktion zum Biuret-Komplex (Cu2+ und N der Peptidbindungen) - blau

   • 2. Folin-Ciocalteaus-Reagenz bildet Polysäuren nach Reaktion mit reduzierenden Aminosäuren (Cys, Tyr) - ebenfalls blau

   • Zwei Lõsungen im UV vermessen:

     -> 1. Nur mit Folin-Ciocalteau -> auch Nicht-Proteine

     -> 2. Mit beiden -> Protein + Nicht-Proteine

     => 2 - 1 = nur Proteine (bereinigt)

   • Die Bestimmung nach Lowry setzt sich zusammen aus der Messung von Proteinen durch die Bioret-Reaktion

     Und zweitens der Messung nach Folin-Ciocalteu, Bestimmung der reduzierenden Verbindungen (Antioxidative-Kapazität). Häufig in Zusammenhang mit Proteinen, zur Bestimmung von Tyrosin und Tryptophan.

     Die Kombination der beiden Reaktionen sorgt für eine Absenkung der Nachweisgrenze und eine sehr präzise Proteinbestimmung.

     ->  Es wird hierbei die Nachweisgrenze gesengt. Nichts voneinander abgezogen, ist nur eine Proteinbestimmung, mit herabgesetzter Nachweisgrenze

   
   

1. Biuret

   • mit Cu2+ Komplexbildung mit Peptidbindung

   • in alkalischer Lösung bilden 4 Peptidbindungen mit zweiwertigen Kupferionen einen blauvioletten Farbkomplex der photometrisch bei 546 nm gemessen werden kann.

   
   

1. Cosmide werden als Klonierungsvehikel verwendet

   -> Richtig

2. Cosmide sind zirkulär

   -> Richtig

3. Cosmide können von E.coli repliziert werden

   -> Richtig

4. Cosmide enthalten Phagen-DNA

   -> Richtig

Sennes:

a) Sennesfrüchte stammen nur von einer Pflanze

-> Richtig

b) Anthrachinon entsteht im Polyketidstoffwechsel

-> Richtig

c) Sennoside sind Dianthronglykoside

-> Richtig

d) Aloin ist ein O-Glykosid

-> Richtig

Der wirksame Inhaltsstoff von Kümmel, lat. Carum Carvi (Stammpflanze), Apiaceae (Familie) ist Carvon mit der Strukturformel C10H14O. Die Enantiomere der Verbindung sind durch eine chirale GC trennbar.

-> R-Carvon in Minze

Die DNA- Fragmente wandern wegen der negativen Ladung des Phosphatesters vom (-) zum (+)- Pol. Die Wanderung der DNA- Fragmente ist in einem bestimmten Bereich proportional zum Logarithmus der (Fragment-)Größe. Am weitesten wandern die kleinen (Supercoil) DNA- Fragmente, da diese durch das Gel wenig Widerstand bekommen

Adenosinmonophosphat

• -> bei DNA: Desoxyadenosinmonophosphat

• a) Phosphatrest- Ribose (Zucker)- Nukleinbase Adenin

• b) RNA (Ribonukleinsäure)

• -> Fette :

  • Aggregatzustand: Fest oder Halbfest bei Raumtemperatur (ca. 20°C)

  • Fettsäuren: Enthalten überwiegend gesättigte FS oder solche mit wenigen DB. Führt zu einer engen, stabilen Packung der Moleküle, was den Schmelzpunkt erhöht.

  -> Öle:

  • Aggregatzustand: Flüssig bei Raumtemperatur

  • Fettsäuren: enthalten überwiegend ungesättigte FS, mit einer oder mehreren DB. Führt zu “Knickbildungen” in den Molekülen, die eine dichte Packung verhindern und den Schmelzpunkt senken.

-> Neutralfette (=Triacylglyceride) sind Fette, bei denen alle OH-Gruppen mit FS verestert sind.

Unterschied Fette vs fette Öle (physikalisch):

• Fette sind bei Raumtemperatur fest

  • besitzen einen höheren Anteil von gesättigten FS

  
  

• Öle sind bei Raumtemperatur flüssig

  • besitzen höheren Anteil von ungesättigten FS

  
  

• die physikochemischen Eigenschaften werden durch die Kettenlänge und Anzahl der DB bestimmt.

b)

• alpha-Linolensäure (Omega3)

• = Octadeca- 9,12,15- triensäure

• Phosphatgruppe wird auf die Hydroxygruppe der AS Tyrosin übertragen.

• Umsetzung von Tyrosin erwartet man keine höhere rel,-Enzymaktivität

• Benzkatechin wird schneller als Tyrosin umgesetzt. Benzkatechin liegt bereits als Diphenol vor  --> Tyrosin muss erst von Creolase in ein Diphenol umgesetzt werden

Ja, nicht gehemmt und größere Enzymaktivität als beim Tyrosin, da hier direkt das Diphenol in Keton umgewandelt wird

Nein, man möchte Brenzkatechin und nicht Thyrosin.