Anna Zusatz V1-4(Pfl)

• makroskopisch, Organoleptische Prüfungen

  • Organoleptisch: Aussehen, Geruch, Geschmack

• Vorauswahl von 6 möglichen Drogen in der Drogenmischung basierend auf ihren Wirkungen und den organoleptischen Prüfungen

• Nasschemische Nachweise

  -> Histochemische Nachweise: Stärke, Schleim, Saponine, Gerbstoffe

• Erstellen von Extrakten der Probe und der Referenzdroge für das DC- Screening

• DC-Screening: Übersichts-DC mit Fließmittel aus dem Praktikumsskript -> Identitäs-DC mit Fließmitteln & Sprühreagenzien aus Literaturen

• Mikroskopische Untersuchung zur Bestätigung der Ergebnisse aus dem DC-Screening 

Ablauf nach Klausur SS25:

1. makroskopisch + organoleptisch

2. mikroskopisch

3. histochemische Nachweise

4. DC mit Vergleichssubstanz

histochemischer Nachweis:

• Probe + Wasser, dann Schütteln (OHNE stehenlassen)

  
  

  -> Saponine bilden durch schütteln Schaum (i.d.R.)

histochemischer Nachweis

• Probe + Wasser -> wird geschüttelt, anschließend stehen gelassen

• bei Schleimstoffen kommt es zum quellen = veränderung der Viskosität

histochemischer Nachweis

• mit Iod-Kaliumiodid Lösung (EuAB: Iod-Lösung R1)

• Positivkontrolle: Kartoffelstärke

  -> Stärke bildet mit Iod einen blauen Einschlusskomplex

• meisten Anthrachinone haben ein Anthracen-Grundgerüst, das mit einer/ mehreren Hydroxygruppen substituiert ist.

Vorkommen des Anthrachinon-Grundgerüsts:

• Sennesblätter/früchte;Cassia senna -> Sennoside

• Rhababer;Rheum officinale -> Rhein, Emodin

• Faulbaumrinde;Frangula alnus -> Frangulaemodin

• Aloe;Aloe barbadensis -> Aloin

Wirkung:

• laxierend (bei Obstipation)

Nachweise:

• (Eisen(III)chlorid -> farbige Komplexe)

• Gibbs-Reagenz -> orange

• Bornträger-Reaktion -> rote Färbung

Cannabis herba; Cannabis sativa L.; Cannabinaceae

Inhaltsstoffe:

• 120 Cannabinoide, davon pharm.

• relevant: Delta-9-Tetrahydrocannabinol und Cannabidiol

Wirkung: sedierend, analgetisch, antiemetisch, appetitanregend, antidepressiv, bronchodilatatorisch, spasmolytisch, muskelrelaxierend, antihypertonisch, euphorisierend, halluzinogen, auch Dysphorien und Aggression möglich

-> Weibliche Pflanzen produzieren Blüten => Reich an THC und CBD

• (Männliche Pflanzen produzieren Pollen und keine nennenswerten Blüten, Geringer Gehalt an THC und CBD) 

• In der Cannabiszucht legt man Wert auf die Züchtung weiblicher Pflanzen; Maximierung der Erträge

Haschisch = Harz aus Drüsenhaaren der weiblichen Cannabispflanze => Hoher THC-Gehalt

Marihuana = getrocknete Blütenblätter und Stängel der weiblichen Pflanze

Mikroskopisch:

• lange mehrzellige Drüsenhaare, Narbenast mit langen Papillen

Cocae folium; Erythroxylum coca; Erythroxylaceae (Rotholzgewächse)

Inhaltsstoffe:

• Cocain (Tropanalkaloid)

• Hygrin (Tropanalkaloid)-

• Cuskhygrin (Tropanalkaloid)

• Gerbstoffe

Indikation:

• Lokalanästhetikum

Wirkung:

• leicht stimulierend

• lokal betäubend

Wirkmechanismus:

• Na-Kanalblockade, Freisetzung von Noradrenalin und Dopamin im Frontalhirn und limbischen System

-> Echtblausalz koppelt mit Phenolen von THC und CBD an der orthi- oder para- Position zu Azofarbstoffen

• Aryldiazoniumsalz reagiert mit dem Phenol-Derivat über elektrophile aromatische Substitution

-> rötlich, violett, orange Färbung

• Coffein (Trimethylxanthin)

• in Guaranae semen

• ist ein Purinalkaloid

• Wirkungsmechanismus: Blockade von Adenosinrezeptoren, Anregung des Zentralnervensystems, Verstärkung der Herztätigkeit und Pulssteigerung, Verbesserung der Organdurchblutung, Bronchodilatation

Gerbstoffe = phenolische Verbindungen, die mit Eisen(III)-chlorid detektiert werden können

histochemischer Nachweis

• Nachweisreagenz: Eisen (III)-chlorid-Lösung R2 (färbt sich dunkelbraun?)

• Positivkontrolle: Faulbaumrinde

-> Cave: Nachweis kann auch Anthrachinone detektieren!

Ginkgo folium; Ginkgo biloba; Ginkgoaceae (Ginkgogewächse)

Inhaltstoffe: 

• Ginkgolide (Diterpenlactone)

• Bilobalid (Sesquiterpenlactone)

• Proanthocyanidine

• Flavonole (Quercitin, Rutosid)

• Chlorogensäure

• Ginkgolsäure (neurotoxisch)

• Ginkgotoxin (B6- Antivitamin)

Reinsubstanz: 

• für Ginkgo: Ginkgotoxin, Chlorogensäure, Rutosid

Indikation: bei ersten Anzeichen der Alzheimer-Demenz, durchblutungsbedingten Hirnleistungsstörungen, Schwindel und Tinnitus

Wirkmechanismus:

• Steigerung der Durchblutung

• Ginkgolid B: PAF (Platelet-activating factor) Antagonist, Förderung der NO-Freisetzung (durch die Terpenlactone)

• Fragmente des Leitgewebes aus Blattstielen und Nervatur

• unregelmäßige Bruchstücke der Blattspreite (mit oberer Epidermis)

-> Naturstoffreagenz- Sprühreagenz: Diphenylboryloxyethylamin in Methanol + Macrogol

=> erweiterung des chromophoren Systems durch nucleophilen Angriff der Hydroxy-Gruppe am C3-Atom an das Bor-Atom des Diphenylboryloxyethylamins-> Reinsubstanzen: 

• Ginkgo: Ginkgotoxin, Chlorogensäure, Rutosid

• Cocae folium: Cocain (vorher hydrolysieren, um veresterung zu lösen, entsteht Carbonsäure)

=> Rutosid-Spot leuchtet erst blau (365nm). Nach Besprühen mit Diphenylboryloxyethylamin R & Macrogol 400R erscheint der Spot gelb

Guaranae semen; Paullinia cupana; Sapindaceae (Seifenbaumgewächse)

Inhaltstoffe:

• Purinalkaloide (Coffein, Theophyllin, Theobromin)

• Catechine (Flavonoid)

• Tannine (Flavonoid)

• Anthocyane (Flavonoid)

• Saponine

Indikation: Psychotonikum, Stimulans bei Müdigkeit, Antidiarrhoikum

Wirkung: stimulierend, Konz.-Fördernd

Wirkmechanismus: ADP-Antagonist und Hemmung von Phosphodiesterasen

Semen

• polyedrische Sklereiden mit Tüpfelkanälen (in Gruppen)

• (palisadenförmige Zelllage, mit Fragmenten der) Epidermis, die Zellen mit gebuchteten u. regelmäßig verdickten Wänden aufweisen

• Embryo-Fragmente aus dünnwandigen, länglichen Zellen

• zahlreiche Keimblätterfragmente aus rundlichen bis einförmigen, stärkehaltigen Zellen mit Interzellulären

-> Dragendorff-Reagenz

Reinsubstanz: 

• für Cocae folium: Cocain

Cocain in Cocae folium

• Tropanalkaloid-> Amphetamin-Effekt: mindert Hunger und Müdigkeit

  -> Indirektes Sympathomimetikum:

  • Hemmung der Wiederaufnahme von Dopamin, Noradrenalin, Serotonin

  • blockiert spannungsabhängige Na-Kanäle-> Lokalanästetikum

Cocain + Hygrin + Cuskhygrin sind alles Topanalkaloide => Gerbstoffe

• Ephedrin ist ein Phenylethylamin

• in Ephedrae herba

• aus Tyrosin und Phenylalanin abgeleitetes Alkaloid

• Wirkung: steigert Blutdruck, Vasokonstriktion, weniger Müdigkeit, steigert Aufmerksamkeit, Appetit nimmt ab

• Sprühreagenz ist Ninhydrin R

• Reinsubstanz: 2-Indanamid-> ist ein primäres aromatisches Amin, reagiert mit Ninhydrin zu Ruhemannspurpur

-> strukturell ähnlich mit Ephedrin, daher ähnliches Laufverhalten (laut EuAB als Referenz)

• lange, dickwandige und mit verengtem Lumen; Fragmente des Leitgewebes

• Fasern in Gruppen mit Ca-oxalatkristallen

• Sprossfragmente 

• Fragmente der Epidermis

Nicotianae folium; Nicotiana tabacum; Solanaceae (Nachtschattengewächs)

Inhaltsstoffe: 

• Nicotin, Nornicotin (beides Pyridinalkaloide)

• Allantoin

• Rutin

• Chlorogensäure

• Yohimbin

Indikation: Narkotikum -> Obsolet; Genussmittel

Wirkung: stimulierend, psychoaktiv

Papaveris fructus; Papaver somniferum; Papaveraceae (Mohngewächse)

Inhaltsstoffe:

• Opium-Alkaloide!

  • Typ 1: Morphinan-Typ: Morphin, Codein, Thebain

  • Typ 2: Benzylisochinolin-Typ: Papaverin, Noscapin, Narcin, Reticulin

Wirkung: sedativ, berauschend, narkotisierend, zentral antitussiv, spasmolytisch 

Yohimbehe cortex; Pausinystalia yohimbe; Rubiaceae

Inhaltstoffe: Alkaloide, darunter Yohimbin

Wirkung: stimulierend, kann Angst und Reizbarkeit verursachen, aphrodisierend

Alkaloide:

• sekundärstoff in Pflanzen

• oft heterocyclische Verbindungen mit Stickstoff

• meist basische Eigenschaften

verschiedene Gruppen:

• Troponalkaloide (Atropin, Cocain)

• Pyridinalkaloide (Nicotin)

• (Benzyl-)Isochinolinalkaloide (Papaverin, Morphin, Codein)

• Indolalkaloide (Ergotamin)

• Purinalkaloide (Coffein)

De novo Purinbiosynthese:

• gesamte Synthese bis zum Purinnucleotid >11 Reaktionsschritte

• GTP und ATP werden verbraucht

• mit weiteren Schritten zu Nukleotiden (Xanthosin, Adenosin, Guanosin

• Geschwindigkeitsbestimmender Schritt: die Bildung von 5-Phosphoribosyl (= Ribose-5-Phosphat)

  • durch Übertragung der Aminogruppe von Glutamin auf PRPP

  • Schritt 1

Ausgangspunkt:

• alpha-D-Ribose-5-Phosphat (Ribose-5-Phosphat)

  • Produkt aus Pentosephosphatweg

  • wird in kat.- Reaktion mit ATP umgesetzt

Verlauf:

• Ribose-5-Phosphat wird mit PRPP-Synthetase zu PRPP

  • PRPP = 5-Phosphoribosyl-alpha-Pyrophosphat

  • mit ATP in katalytischer Reaktion

• … mit Amidophosphoribosyl-1-amin + Enzym: Amidophosphoribosyl-Transferase (=Glutamin-PRPP-Amido-Transferase) zu 5-Phosphoribosyl-1-amin

-> Reaktionen 1-5: Bildung: Imidazolring

-> “ 6-10: Aufbau Pyrimidinring

• Produkt: Inosin-5`-monophosphat (= Inosinmonophosphat) = IMP

- Bausteine von Basen und Nucleotiden:

1. DNA- und RNA- Basen: Adenin, Guanin 

2. Energieträger: ATP, GTP 

3. Bestandteile von Coenzymen: NAD+, NADP+, FAD+ 

4. Intrazelluläre Signalmoleküle: cAMP, cGMP 

-> bei Überproduktion von Purinen: Gefahr von Lesch-Nyhan-Syndrom oder Gicht (Überschuss an Harnsäure im Blut)

Vorkommen

• Kaffee, Kakaobohnen, Teeblätter, Guaranabeeren, Kolanüssen

Wirkmechanismus:

• Blockade von Adenosinrezeptoren als Antagonist

• Hemmung von Phosphodiesterase

• Erhöhung der cAMP-Konzentration, daher verlängerte Ausschüttung von Adrenalin und Noradrenalin

• Stimulierung des zentralen Nervensystems

Wirkung:

• erhöhung der Konzentration + Aufmerksamkeit

Pharm.Verwendung:

• als adjuvantes Analgetikum in Kombi mit ASS/ Praracetamol

• Stimuliert das Atemzentrum (bei Atemdepression bei Frühgeborenen)

• Migräne, Spannungskopfschmerz (in Kombi mit Analgetika wird Wirkung verstärkt)

• Hypotonie

• Schläfrigkeit, Erschöpfung

Ephedrae herba; Ephedra sinica, E. distachya; Ephedraceae (Meerträubelgewächse)

Inhaltsstoffe:

• Alkaloide (Ephedrin, Pseudoephedrin, Norpseudoephedrin)

Indikation:

• Bronchospasmen

Wirkung:

• sympathomimetisch, bronchodilatierend durch Agonisierung von beta-2- Rezeptoren, zentral stimulierend

=> Jod-HCl-Reagenz

Iod/HCl Reagenz:

Genaue Reaktion:

• 1. Säure-Base-Reaktion: Coffein besitzt basische N. Werden durch HCl protoniert- Coffein trägt eine positive Ladung

• 2. Redoxreaktion: Iod (I2) + Iodid (I-) zu Triiodid (I3-)- Triiodid ist stabiler, farbtragender Komplex

• 3. Ionische WW: protoniertes Coffein (positiv geladen) bildet mit Triiodid (negativ) ein braunes Salz=> sichtbare Braunfärbung auf der DC-Platte an der Stelle der Coffeinzone 

Aussehen des Produkts:

• Coffein: rotbraun

• Theophyllin: violett

• Theobromin: braunrot-> Blauschwarzer ND

1. Coffein

• unpolarste, da alle N methyliert sind (keine NH-Gruppen). Somit keine H-Brücken mit stationärer Phase- höchster Rf-Wert, durch geringste Polarität

2. Theobromin

• enthält (2) NH-Gruppen -> kann H-Brücken eingehen, dadurch erhöhte Polarität- pKs ca. 9,9 -> schwächer sauer als Theophyllin

3. Theophyllin

• enthält ebenfalls NH-Gruppen- stärker sauer als Theobromin, pKs 8,8 -> dadurch noch polarer

Trennung von Theobromin und Theophyllin:

• NH3 als basischer Modifier!

• deprotonierung von Theophyllin des NH-aciden Protons

• Polarität dadurch höher als Theobromin-> Auftrennung möglich=> NH3 sorgt bei DC für bessere Trennung (hier bei Sub. Theobromin und -phyllin), indem störende WW mit Kieselgel unterbindet. Besserer Trennung

= Stoffklasse, die sich von den Purinen ableitet

-> Purinalkaloide in Pflanzen = Methyl- Xanthine

• Bildung aus Inosinmonophosphat im Sekundärstoffwechsel mit Xanthosinmonophosphat als Intermediat zwischen Primär- und Sekundärstoffwechsel der Purine

• Fraßschutz der Pflanzen- Schutz vor Bakterien, Viren, Pilzen- pharmakologisch aktive Stoffe mit Wirkung auf Herz-Kreislaufsystem- Niere, Nervensystem

- wichtigste Vertreter: Coffein, Theobromin, Theophyllin

= Wiederverwertung freier Purinbasen und Nucleoside aus dem Zellabbau- energiesparender Weg (wesentlich weniger als die De-novo-Synthese), da kein kompletter Neubau nötig- besonders wichtig in Geweben die viele Nukleotide benötigen wie z.B. Nervenzellen

-> Ausfall des Salvage-Patways kann zu schweren Erkrankungen führen: Lesch-Nyhan-Syndrom

Vorkommen:- Guarana, Kakao, Mateblätter, Teeblätter

Wirkmechanismus:

• Antagonist an Adenosinrezeptoren

• Bronchodilatation, Bronchospasmolyse

• Hemmung der Phosphodiesterase

• Blutdruckabfall, Vasodilatation

• Kontraktion, der glatten Muskulatur durch erhöhte Ca-Freisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum- geteigerte Diurese

• erhöhter Zilienschlag des Flimmerepithels

Anwendung:

-> bei Obstruktiven Atemwegserkrankungen und bei Atemnotzuständen

• Asthma bronchiale: Bronchodilatator erweitert die Bronchien

• unterstützend bei chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD)

• Apnoe-Syndrom bei Neugeborenen (allternative zu Coffein) -> Anregung des Atemzentrums

• heterobicyclische, aromatische organische Verbindungen mit 4 Stickstoffatomen.

  = N-haltige heterozyklische Verbindungen- kondensiertes Ringsystem aus Pyrimidin und Imidazol

  
  

  =>Purin-Grundstruktur besteht aus:

  • Pyrimidinring (6-gliedrig, enthält 2 N)

  • einem Imidazolring (5- gliedrig, enthält 2 N)

  • diese beiden kondensiert ergbit Purin

zu finden in Genussmitteln (Kaffee, Tee, Kakao)

• Koffein (Tee, Kaffee)

• Theobromin (Kakao)

• Theophyllin (Tee)

Allopurinol:

-> Indikation: Gicht, Hyperurikämie

-> Wirkungsweise: hemmt Xanthinoxidase (Enzym), reduziert Harnsäurebildung

-> NW: Hautausschlag, Übelkeit, Kopfschmerzen

6-Mercaptopurin:

-> Indikation: akute lymphatische Leukämie (ALL)

-> Wirkungsweise: Purinanalogon, hemmt DNA- und RNA-Synthese sich schnell teilender Zellen, Stört so den Purin-Stoffwechsel => Zytostatikum- hemmt Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPRTase)

-> NW: Knochenmarksdepression, Leberfunktionsstörungen, Übelkeit/ Erbrechen  

Cola semen; Cola nitida, C. acuminata; Malvaceae

Inhaltstoffe:

- Coffein, Theobromin, Theophyllin- Catechingerbstoffe- Stärke, Polysaccharide- äth. Öl

Verwendung:

• Stimulans (ZNS-Anregend)

Coffeae semen; Coffea arabica L., C. robusta; Rubiaceae

Inhaltsstoffe:

• Purinalkaloide (Coffein, Theophyllin, Theobromin); Methylxanthine -> zentral Anregend (Coffein)

• Chlorogensäure -> Antioxidativ

• Atractyligenin (Diterpen) und seine Glykoside

• Gerbstoffe -> adstringierend

• Diterpenalkohol; fette Öle; Bitterstoffe; Aromastoffe

Anwendung:

• Genussmittel, Stimulans gegen Müdigkeit + Schläfrigkeit

Cacao semen; Theobroma cacao L.; Malvaceae

Inhaltsstoffe:

• Methylxanthine (Coffein, Theobromin (überwiegend), Theophyllin)

• Catechingerbstoffe (Epicatechin, -Derivate) -> Polyphenol- Kakaobutter (50%)

• Mineralstoffe, Spuren von Zucker

Mate folium; Ilex paraguariensis; Aquifoliaceae (Stachelpalmengewächs)

Inhaltstoffe:

• Purine (Coffein, Theobromin)

• Chlorogensäure -> antioxidativ

• Flavonoide (Isoquercetrin, Rutin, Kämpferglykoside) -> zellschützend

• Catechingerbstoffe -> adstringierend

• Triterpensaponine -> leicht schäumend- Ascorbinsäure

Anwendung:

• Stimulans bei körperlicher + geistiger Erschöpfung-

• bei Blasen- und Nierentees- Genussmittel

= Farbreaktion- Reagenz besteht aus: Bismut(III)-oxidnitrat (=Bismutsubnitrat), Weinsäure, Kaliumiodid

Es entsteht:

• Kalium-Tetraiodobismutat-Komplex

• dieser bindet mit dem protonierten basischen Amin ein schwerlösliches Ionenpaar

  -> Farbprodukt:

  • unlösliche Ionenpaarverbindung

  • gelb bis rotbraun

Im Praktikum:

• bei Alkaloiden

• bildung eines schwerlöslichen, orangefarbenen Komplexes zwischen protonierten basischen N (Zielverbindung) und Tetraiodobismutat-Anion (BiI4-)

- Reaktionstyp: chemische Nachweisreaktion für primäre/ sekundäre Aminogruppen      

• Nachweisreaktion für freie primäre Amine

• Prinzip: Ninhydrin reagiert mit freien alpha-Aminogruppen (z.B. AS) unter Decarboxylierung und oxydativer Deaminierung

-> farbiges Produkt entsteht:

• 1.Ruhemanns-Purpur (intensiv violett/blau) bei primären Aminogruppen

  • Nebenprodukte: CO2 und Aldehyd

• 2. Gelb- orange bei sekundären Aminen!

Warum nicht bei Purinen: - Purine (Coffein, Theobromin, Theophyllin) enthalten KEINE freien Aminogruppen, nur verbrückte N im Ring (=aromatisch gebundene N)- keine reaktiven NH2-Gruppe (für Ninhydrin-Reaktion erforderlich)-> Keine Farbreaktion mit Ninhydrin möglichVerbesserung:- Nutzung von Murexid (bildet farbige Komplexe mit Purinalkaloiden

 Allii sativi bulbus (Knoblauchzehe); Allium sativum; Amaryllidaceae

Inhaltsstoffe:

• schwefelhaltige Verbindungen: Alliin, Allylsulfensäure, Allicin

  • Alliin: S-Allyl-L-Cysteinsulfoxid

  • Allicin: Thiosulfinat

  -> Allicin entsteht enzymatisch aus aus Alliin

  -> Allicin ist instabil – entsteht nur durch Zerkleinerung oder Verletzung der Zellen, da dabei das Enzym Alliinase freigesetzt wird.

  
  

Abbauprodukte des Allicins:

• Ajoen, Vinyldithiine=S-Allylcystein, Allylsulfide, Diallylsulfide

• Mineralstoffe, Vitamine, Flavonoide, AS

• Alliin ist instabil, wird durch Alliinase im wässrigen in Allicin umgesetzt (= Wirkform)

  -> Allicin ist im sauren vorübergehend stabil

• Allicin entsteht enzymatisch aus Alliin

  -> Allicin ist instabil – entsteht nur durch Zerkleinerung oder Verletzung der Zellen, da dabei das Enzym Alliinase freigesetzt wird.

-> Enzym: Alliinase

-> Reaktion: beta-Eliminierungs-Desaminierung

• Alliinase (S-Alkyl-L-Cystein-Sulfoxidlyase) -> in Vakuole

• wird bei beschädigung der Pflanze freigesetzt (z.B. zerschneiden)

• Alliin im Cytoplasma

  -> durch Alliinase (=Lyase), wird Alliin erst in (Acrylsulfensäure oder) Brenztraubensäure mit Ammoniak und Allylsulfensäure umgesetzt

  -> 3 Allylsulfensäuremoleküle kondensieren in nicht-enzymatischer Reaktion zu Allicin.

• Umwandlung dient Fraßschutz und Mikroorganismen.

• Alliin ist instabil, wird durch Alliinase im wässrigen in Allicin umgesetzt (= Wirkform)

• Allicin ist im sauren vorübergehend stabil

-> Alliin ist nicht UV-aktiv, Allicin absorbiert auf gewünschter Wellenlänge (250 nm)

-> Allicin hat durch 2 Allylgruppen + Sulfoxid ein Chromophor (daher DAD- Detektor an HPLC möglich)

- als Referenz wird Alanin (in Methanol) verwendet

- Fließmittel: Essigsäure (Modifier), Propanol/ Wasser/ Ethanol (apolar)- Kieselgelplatte (polar)-> wanderung durch Kapillarkräfte- Detektion: UV + Nachweisreagenz

mit HPLC!

• Interner Standard: Scopoletin (!Ohne h!)

-> hat ähnliche aber etwas kürzerer Retentionszeit als Aliin

->Interner Standard (ISTD) Allicin ist sehr instabil und kann nicht als Interner Standard für eine quantitative HPLC-Bestimmung verwendet werden.

Vorteile Scopoletin (ISTD):

• hat eine ähnliche Retentionszeit wie Allicin

• bei gleicher Wellenlänge wie Allicin detektiert-> wird jeder zu prüfenden Lösung in gleicher Menge zugegeben (daher INTERNER Standard)-> Unterschiedliche UV-Absorption von Scopoletin und Allicin wird durch Korrekturfaktor berücksichtigt

• Säule: RP-HPLC (C-18-Modifikation durch Spherisorb s ODS 2) -> Unpolar

• Elutionsmittel: Polar + Phosphorsäure (Modifier)

  • Isokratischer Gradient

• Detektion UV/Vis

-> Vor Messung muss Säule gespült werden (MeOH)

• Erst danach ISTD-Lösung (interner Standard) durch luftblasenfreie Injektorzugabe Retentionszeit vermessen

  • Warum: zur Bestimmung der Retentionszeit als Orientierung!!!

• zum Schluss Analysenlösungen: Identifizierung des Scopolethin und Allicin-Peaks! Zweifachbestimmung

• Auswertung:- Peak 1: Scopoletin- Peak 2: Allicin

- Doppelpeak bei Scopolethin durch zersetzung (über Nacht) bei möglicherweise nicht ausreichender Kühlung.

Anforderungen des EuAB:

• zahlreiche Parenchymfragmente

• Gruppen von Spiral- oder Ringgefäßen, begleitet von dünnwandigen Parenchymzellen

• Alliin ist instabil, wird durch Alliinase im wässrigen in Allicin umgesetzt (= Wirkform)

  -> Allicin ist im sauren vorübergehend stabil

• Alliin ist nicht UV-aktiv, Allicin absorbiert auf gewünschter Wellenlänge (250 nm)-> Allicin hat durch 2 Allylgruppen + Sulfoxid ein Chromophor (daher DAD- Detektor an HPLC möglich)

• Homogenität der jeweiligen Proben

• gleiche Bedingungen bei Extraktion und HPLC-Analyse    

  -> gleiches Extraktionsmittel + Volumen     

  -> gleiches Elutionsmittel (gleichem pH-Wert)

• Ergebnisse (Masse des Allicins) auf die Einwaage des Präparats beziehen!

• bei Gehaltsbestimmung werden frischer Knoblauch, -Pulver und Dragees untersucht.

-> INTERNER Standard Scopoletin

1. GC (gaschromatographie): 

• Bestimmung der flüchtigen Inhaltsstoffe (Hauptzerfallsprodukte: isomere Vinyldithiine)

2. Titration: 

• bestimmung des bei Allinase-Reaktion intermediär entstehenden NH3 bzw. Pyruvat (Acidimetrie, Redoximetrie) 

3. UV/Vis bzw. DAD-Spektroskopie:

• mit Referenzlösungen lineare Regression erstellen

• mit Absorption der Probe Gehalt berechnen (Lambert-Beer´sches-Gesetz)

Indikation:- Atheroskleroseprophylaxe-> Allicin: Fibrinolytisch, Thrombozytenaggregationshemmend

- Anticarcinogen → Dosisabhängig, induziert den Zelltod und hemmt die Zellproliferation- Senkt LDL- Cholesterin: Unterstützt Abtransport + Reagiert mit Proteinen im aktiven Zentrum der Enzyme der Cholesterin Biosynthese- Blutverdünnend und blutdrucksenkend

Hauptwirkung:

• Fibrinolytische Wirkung durch Alliin (und Allicin)

• Senkung des Cholesterinspiegels

• Senkung des Thromboxanspiegels

• antibakterielle Eigenschaften.

Indikation:

• Zur Behandlung von Hyperlipidämie und zur Vorbeugung von Gefäßerkrankungen gemäß der Positivliste der Kommission E.

Wirkmechanismus:

Wirkmechanismus laut Prof

• Allicin als Sulfoxid reagiert mit SH-Gruppen (Cysetinresten) von Enzymen und hemmt diese dadurch

-> z.B. HMG-CoA- Reduktase

• Lipidsenker=> Hauptsächlich durch Allicin und Ajoene wird das Schlüsselenzym HMG-CoAReduktase, das für die Cholesterin-Biosynthese wichtig ist, blockiert. Dadurch wird die Bildung von Cholesterin gehemmt.

-> Schwefelverbindungen (Sulfoxide): reversible Interaktionen mit Thiol-Gruppen körpereigener Enzyme.

-> bestimmte Enzyme durch die S-Thiolierung inaktiviert: Hemmwirkung auf Schlüsselenzyme der Cholesterinbiosynthese (HMG-CoA-Reduktase, Squalen-Monooxygenase, Acetyl-CoA-Synthase)

NW: Geruchsveränderung (Mund, Körper)

-> Alliin  ist geruchslos und inaktive Form, daher Vorstufe des aktiven Allicins. Geruchsaktiv sind nur die spontan umgewandelten Verbindungen

-> Allicin reagiert weiter zu stark riechenden und flüchtigen Schwefelverbindungen (Ajoen, Allylsulfiden, Vinyldithiine)

-> Ninhydrin-Reagenz!

• spez. Nachweismethode für AS

  -> hier durch prim.-Aminogruppen

• besprühen + 110°C in TK

• Auswertung bei Tageslicht!

-> färbt dunkelrot (Ruhemanns Violett)

• Referenz Alanin, da ähnliche Polarität wie Aliin (=ähnlicher Rf-Wert)

  -> Aliin instabil, daher als Referenz ungeeignet

• durch Knoblauch können 5 Spots entstehen (Alanin mittig), durch vielzahl von AS in Droge

• Alliin erscheint als violetter oder braunroter Spot

Ergebnis:

• Bei DC wird Alliin nachgewiesen. Nur möglich, wenn die Droge so behandelt wurde, dass dieenzymatische Spaltung zu Allicin verhindert wird (z. B. durch Erhitzen, Alkohol, schnelle Verarbeitung).

• Allicin selbst wird nicht nachgewiesen, da es instabil und nicht Ninhydrin-reaktiv ist.

• IUPAC: (9Z,12Z,15Z)- Octadeca- 9,12,15- triensäure

• Trivial-Nomenklatur: (welche sich an der IUPAC-Nomenklatur orientiert) α-Linolensäure

-> Omega-3-Fettsäure (w-3-Fettsäure)

-> Δ-9Fettsäure

= Equivalent Chain Lenght (äquivalente Kettenlänge)

-> ermöglicht Vergleich mit linearen Alkanen, da sie Anzahl der C-Atome sowie Position und Anzahl der DB berücksichtigen

• basierend auf der Retentionszeit i.d. GC

• zur Identifikation und Charakterisierung von FS und FS-Methylestern

• je länger die FS, desto höher der Siedepunkt, desto länger die RZ.

• je ungesättigter die FS, desto länger die RZ.

-> DB sind polarisierbar und interagieren mit den Cyanopropyl-Gruppen auf der Oberfläche der stationären Phase

• Stationäre Phase: Cyanopropyl-modifizierte Säule

  • ungesättigte FS-Methylester gehen erst bei höheren T in gasphase, daher längere RZ, als gleich lange gesättigte.

  • gehen WW mit Cyanopropyl-modifizierter Säule ein

• Trennung nach flüchtigkeit der FS-Methylester- Temperaturgradient! Im Laufe des Programms der GC wird die T stetig erhöht

  • längere FS-Methylester gehen erst bei erhöhter T in die Gasphase über -> haben daher längere Retentionszeit als kürzere FS-Methylester

• beim Menschen/Tier & Pilzen: im Cytosol am FS-Komplex-

• bei Pflanzen: bis C18 in Plastiden

Prinzip:

• Aufbau von FS aus Acetyl-CoA

• Acetyl-CoA wird aus dem Mitochondrium über Citrat-Shuttle ins Cytosol transportiert

Synthese:

• Enzym: Fettsäuresynthase (Multienzymkomplex) mithilfe eines Acyl-Carrier-Proteins (ACP)

• über Multienzymkomplex, welcher im Zentrum ein Acyl-Träger-Protein (ACP) trägt

• um ACP befinden sich die katalysierenden Domänen

  -> Geschwindigkeitsbestimmender Schritt: Carboxylierung von Acetyl-CoA zu Malonyl-CoA

  -> Schlüsselenzym: biotinhaltige Acetyl-CoA-Carboxylase

->An der Fettsäuresynthase kann maximal die Palmitinsäure (C16) gebildet werden

• Längerkettige Fettsäuren entstehen an der cytosolischen Membranseite des ERs, wobei Malonyl-CoA sukzessiv C2-Einheiten liefert

• Bildung von z.B. Stearinsäure (C18) und Arachidonsäure (C20)

-> Bildung von ungesättigten Fettsäuren

• durch selektive Dehydrierung gesättigter Acyl-CoA an der cytosolischen Membranseite des ERs

• Enzyme: Komplex aus Cytochrom-b5-Reduktase, Cytochrom b5, Desaturase

Essentielle Fettsäuren:

• können nicht gebildet werden, da bestimmte Desaturasen fehlen

• Im menschlichen Körper fehlen die Desaturasen, die nach dem 9. C-Atom Doppelbindungen einfügen

zur Quantifizierung

• die Summenfläche aller nachweisbaren Komponenten wird auf 100% nomiert und die relativen Anteile jeder Substanz daran angegeben.

• ist besonders nützlich für Vergleichsanalysen (z.B. FS-Profile von Ölen)

  
  

  -> Nicht geeignet: für absolute Mengenbestimmungen => dafür benötigt man einen internen-Standard oder Kalibrierung 

• Gasförmig

• thermisch stabil (bis 350°C unzersetzt)

• vollständig verdampfbar bzw. flüchtig nach Derivatisierung

• Molekulargewicht <500g/l

-> Nachteil: nur wenige Sub. für GC geeignet (10-20%)

Ja, Fette und Öle können mit GC untersucht werden ABER nicht direkt in ihrer ursprungs-Form.

Warum?

• Fette und Öle sind meist Triglyceride= große, nichtflüchtige Moleküle mit hoher Siedetemperatur und thermisch instabil (im GC-Gerät)

• daher können Triglyceride nicht direkt gaschromatographisch analysiert werden.

Lösung:

• Umwandlung von FS-Methylester (FAMEs)

• vor der GC werden Fette/Öle verseift oder transveretsert, dabei entstehen Fettsäuremethylester (FAMEs)

Voraussetzung für GC:

• sind nun flüchtig genug für GC

• thermisch stabil, repräsentiert die FS-Zusammensetzung

Kurzübersicht zur GC- geeigneten Probenvorbereitung:

1. Fett/Öl + Methanol + Katalysator (KOH, H2SO4)

2. Umwandlung in FAMEs

3. Analyse per GC (z.B. FID)

Leinsamen = Lini semen; Linum usitatissimun; Linaceae

• gewonnen durch durch Pressen (Mahlen), Ausbeute 20-30%- flüssig, klar, gelb bis bräunlich-gelb

Beinhaltet:

• mehrfach ungesättigte FS, v.a. kurzkettige Omega-3-FS

• MUFS -> essentielle alpha-Linolensäure (ALA) (Omega-3-FS) bis zu 65%

• MUFS -> essentielle Linolsäure (Omega-6-FS): 11-24%

• Ölsäure: 11-35% EUFS

• Palmitin- und Stearinsäure: bis zu 10% -> GFS

• Tagesbedarf Erwachsen: 2g ALA (1 TL Leinöl)

Zea mays, Poaceae

• pfl. Öl aus fetthaltigem Keim des Maiskorns 

• gewonnen durch Pressen (kalt und heiß) oder durch Extraktion

• flüssig, geschmack- und geruchslos

• besteht aus >50% mehrfach ungesättigten FS (Linolsäure)+ >20% einfach ungesättigten FS (positiver Effekt (Cholesterinspiegel)

-> Vit E des Keimöls fördernder Effekt auf der Haut, Herstellung von Kosmetika

Pharmazeutisch:

• Öle für Injektionszwecke oder Augentropfen, HS für Arzneiformen

• Ölhaltige Extrakte

• Mildes Laxans

Physiologisch:

• FS dienen dem Körper als Energiequelle und Energiespeicher

• sind ein Bestandteil von Phospholipiden, welche die Zellmembran bilden

• sind zum Schutz und zur Isolierung da (Fettgewebe)

• dienen der Hormonproduktion als Vorläufer für einige Hormone (bspw. Steroidhormone)

• unterstützen die Signalübertragung als Vorläufer für Signalmoleküle

• wichtig für die Aufnahme fettlöslicher Vitamine "EDEKA" 

• essentielle: alpha-Linolensäure

• nicht-essentielle: Ölsäure

chemisch:

• Ester aus dreiwertigen Alkohol Glycerol und langkettigen Fettsäuren (FS)bzw. Triester von langkettigen Carbonsäuren (=Fettsäuren) mit Glycerol

• wasserunlöslich (lipophil)

Neutralfette(=Triacylglyceride):

• sind Fette, bei denen alle OH-Gruppen mit FS verestert sind

Unterschied Fette vs fette Öle (physikalisch):

• Fette sind bei Raumtemperatur fest

  -> besitzen einen höheren Anteil von gesättigten FS

• Öle sind bei Raumtemperatur flüssig

  -> besitzen höheren Anteil von ungesättigten FS

-> die physikochemischen Eigenschaften werden durch die Kettenlänge und Anzahl der DB bestimmt.

FAMEs = FS-Methylester

• entstehen durch Umesterung der FS und sind die Zielsubstanz für die GC

-> Unverseifbare Anteile:

• sind die Begleitstoffe, die nicht an der Umesterung teilnehmen 

  • z.B. Sterole

- evt. Vit. E, Squalen, Pigmente-> sie bleiben im Petrolether-Extrakt erhalten, da sie lipophil sind.

Wichtig weil:

• unverseifbaren Anteile stören in der GC meist NICHT, da sie nicht flüchtig sind und nicht eluieren.

• sie bleiben zurück oder erscheinen nur als kleine, späte Peaks

Fazit:

• FS-Methylester sind mit GC analysierbar

• nicht analysierbare unverseifbare Stoffe, wie Sterole, die mit extrahiert wurden, sind für die Analyse nicht relevant bzw. nur sekundär interessant.

1. Verseifung der Triacylglycerine mit NaOH- Ölprobe unter Rückfluss mit NaOH kochen

2. Veresterung der freien FS mit BF3 und Methanol- zugabe von BF3/Methanollösung- BF3 = Katalysator

3. Ausschüttung mit Petrolether durch Aussalzen der FS-Methylester

• Petrolether zugegeben, kurz aufkochen + abkühlen.

• Kochsalz wird zugegeben

• über Nacht Phasentrennungabwarten-> durch Salzzugabe werden die gelösten Fettsäuremethylester ausgesalzen + gehen in Petroletherphase über 

4. Isolierung der FS-Methylester- mit Na-Sulfat

• trocknen

• abrotieren

-> erhält Lösung der FS-Methylester mit den unverseifbaren Anteilen (Sterolen)