Anna Zusatz Gen (V12-19)

Ethidiumbromid

• Phenanthridin-Farbstoff

  -> Nachweis: Nukleinsäure, RNA, DNA

  -> Stark mutagen, kanzerogen, CMR

  
  

  => Interkalierende Substanz = lagert sich zwischen Basen der Nukleinsäuren

• Alternative: Midori-Green

= Digoxygenin-dUTP

-> alkalilabile Esterbindung des Digoxygenins (DIG) an dUTP

• thermostabile Polymerase integriert DIG-dUTP, während sie einen bestimmten Bereich der Template-DNA ampliziert.

1. Denaturierung:

   • bei 95°C wird die doppelsträngige DNA aufgetrennt

2. Annealing:

   • bei 50°C Anlagerung der Primer an das Template

3. Elongation:

   • bei 72°C Synthese des komplementären Strangs durch Taq-Polymerase

-> durch QIAquick Gelextraction Kit (Fertigpackung mit folgendem Inhalt):

• QG-Puffer (Lösungspuffer)

• PE-Puffer (Waschpuffer)

• QIAquick Spin Columns

Ablauf:

• Sonde aus dem Gel extrahieren mittels QIAquick Gelextraction Kits (Säulenchromatographie)

• Bande der über PCR hergestellte markierte Sonde aus dem Gel ausschneiden mit Puffer versetzen und im Wasserbad (50 ºC) auflösen

• Isopropanol hinzugeben, vortexen und auf das Säulchen geben=> Isolierung besonders kleiner Fragmente

• Zentrifugieren

• Mit Puffer waschen und zentrifugieren

=> Waschschritt, bei dem Gelrückstände und Verunreinigungen entfernt werden- Eppendorf-Hütchenwechseln und mit Wasser eluieren

• bis zur Verwendung bei -20 °C einfrieren

=> Methode zur Auftrennung von Nukleinsäurefragmenten anhand des Molekularsiebeffekts nach ihrer Größe

• Auftrennung der durch PCR und Restriktionsverdau erhaltenen Nukleinsäuren

Prinzip:

• Auftrennung von Nukleinsäuren nach Molekularsiebeffekt durch Anlegen einer Spannung

• Es gilt:

  → kleine Fragmente legen eine größere Strecke zurück→ die Fragmente laufen auf Grund der angelegten Spannung

  → DNA-Fragmente besitzen eine negative Ladung (Phosphatgruppen) und laufen von negativen Kathode zur positiven Anode

1. Agarose-Gel herstellen

2. Probenauftragung (λ-Größenstandards, vier Restriktionsansätze, PCR-Ansätze aus V 12A)

3. Auftrennung der durch PCR und Restriktionsverdau erhaltenen Nukleinsäuren durch Gelelektrophorese (125V;1h)

4. Kontrolle unter UV-Licht (Amplifikation des Ampicillinresistenzgens erfolgt?)

5. Southern Blotting über Nacht

Versuchsschritte:

• Restriktionsansätze

• Gelelektrophorese

• Southern Transfer

• Hybridisierung

Blotting = Übertragung, Transfer-> Nachweis durch spezifisch markierte DNA-Sonde

• Southern-Blotting: DNA-Fragmente werden nach einer Gelelektrophorese auf eine Membran (hier: Nylonmembran) übertragen und dort durch spezifische markierte DNA-Sonde nachgewiesen

  -> Methode des Kappilarblotting, daher Übertragung der Proben vom Agarose-Gel auf die Membran durch Kapillarkräfte (Flüssigkeitsdiffusion)

Ablauf:

• 1. Verdau der DNA mit Restriktionsenzymen

• 2. Auftrennung der Fragmente mittels Agarosegel-Elektroporese

• 3. Denaturierung der DNA mit NaOH Transfer der DNA-Fragmente auf die Nitrocellulose-Membran

• 4. Inkubation mit einer Digoxigenin-markierten DNA-Sonde

• 5. Waschen

• 6. Blockieren

• 7. Inkubation mit Anti-Digoxigenin AK markiert mit POD und anschließendes Waschen

• 8. Inkubation mit Substrat

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Laut Prof: letzter Schritt

• der an die Digoxigeninmarkierte Sonde bindende Anti-Digoxigenin AK, dadurch das er an Enzym (HRP) gekoppelt ist, das zugegebene Substrat umsetzt.

  • HRP = Meerretichperoxidase

    -> ist ein Enzym, katalysiert die Oxidation von chromogenen oder chemilumineszierenden Substraten

=> und es dadurch nur an dieser Stelle zur Anfärbung der Membran kommt.

Primer = kurze, einzelsträngige DNA- Oligonukleotide (i.d.R. etwa 18-25 bp lang), die komplementär zu Sequenzen am Ende und Anfang der DNA sind.

• Wirken als Startpunkte für die DNA-Polymerase, um Synthese neuer DNA- Stränge zu initiieren.

= Polymerasekettenreaktion

• eine molekularbiologische Methode zur in-vitro Amplifikation von DNA

• Ziel:

  • Vervielfältigung eines spezifischen/definierten DNA Segments/ Abschnitts.

• In vitro!

• Voraussetzung:

  • Kenntnis von Teilen der Ziel- DNA-Sequenz.

PCR-Gerät: Thermocycler

Material:

• DNA-Template: zu amplifizierende Sequenz- (Template/Kontrollplasmid) – DNA, die als Matrize für die Amplifizierung dient

• 2 Primer: Startpunkt der Polymerase und Begrenzung des Syntheseabschnitts

  • Forward Primer – Startpunkt für die Taq-Polymerase am Antisense-Strang

  • Reverse Primer – Startpunkt für Taq-Polymerase am Sense-Strang

• dNTPs: Desoxyribonukleotidtriphosphate als Bausteine der DNA-Synthese

• Taq-Polymerase: hitzestabile DNA-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus- zur Verknüpfung der dNTPs zu neuen DNA-Strängen

• MgCl2: Cofaktor der Taq-Polymerase (Bilden mit dNTPs Komplexe)

• Pufferlösung: schafft geeignete Umgebungsbedingungen

• DMSO: Erleichterung der Denaturierung der DNA und des Annealings (indem es die Stabilität der H-Brücken verringert)

macht die Lauffront bei der Gelelektrophorese sichtbar

Ablauf:

• Synthetisierung von zwei DNA-Oligonukleotiden (15–20 Basen lang).

• Diese Primer binden an die komplementären Stränge der Ziel-DNA.

• Forward Primer: bindet an den 3'-Ende des Antisense-Zielstrangs.

• Reverse Primer: bindet an den 3'-Ende des Sense-Zielstrangs.

• Definieren den exakten Bereich, der vervielfältigt (amplifiziert) werden soll

in 3 Phasen: (Zur Amplifikation der Thioesterase Domäne)

• Denaturierung:

  • DNA-Doppelstrang wird durch Hitze (95 °C) in zwei Einzelstränge getrennt

  • durch Aufbrechen der H-Brücken zwischen den Basenpaaren

• Annealing:

  • Primer binden an den jeweiligen Einzelstrang (5 °C unter der Siedetemperatur der Primer) =Hybridisierung der Primer an DNA (je ein Primer für jede Richtung)

  • Im V 58°C

  • 50/58°C

• Elongation:

  • Einzelstränge werden mit Taq- Polymerase zu Doppelsträngen ergänzt, erhöhte Temperatur (72 °C) => Temperaturoptimum der Polymerase

  • = Polymerisation, DNA-Synthese vom 5`zum 3`-Ende des jeweiligen Stranges

  
  

  
  

  => 35x Wiederholung des Zyklus

Sonde = einsträngiger DNA- oder RNA-Abschnitt (oder Oligonukleotid), der komplementär zu einer nachzuweisenden Zielsequenz ist.

• Sonden sind i.d.R. markiert (Fluoreszenz, radioaktiv, etc.), um diese sichtbar zu machen.

• Mit Hilfe von Sonden kann das Vorhandensein von bestimmten DNA- Sequenzen nachgewiesen werden.

• Im Praktikum verwendete Sonde ist komplementär zum Ampicillin-Resistenzgen (=beta-Lactamasegen aus E.coli) auf dem Plasmid ptac-TK.

= kleine, ringförmige DNA, die extrachromosomal (=unabhängig vom Chromosom der Bakterien vorkommt).

• Tragen oft zusätzliche Gene, die für bestimmte Eigenschaften codieren wodurch sich ein Selektionsvorteil ergibt, z.B. Antibiotikaresistenz

• Plasmid muss bei Zellteilung auf beide Tochterzellen übertragen werden, was durch ein ORI (Origin of replication) ermöglicht wird. Dieses gewährleistet autonome Replikation

• In der Gentechnik werden Plasmide als Vektoren (Transportvehikel), für neu einzubringendes genetisches Material und dessen Klonierung verwendet.

• stringente und relaxierte Replikation:

  → stringent: Plasmidreplikation an die des Bakteriengenoms geknüpft(single-copy/low-copy)

  → relaxiert: Plasmidreplikation nicht an Replikation desBakteriengenoms geknüpft (multi-copy)

Minimale Komponenten eines Plasmids:

1. Promotor: kontrolliert die Transkription, Bindungsstellen für RNA-Polymerase und Transkriptionsfaktoren

1. MCS (Multiple cloning site): => Polylinker

   • enthält Schnittstellen für das Einfügen des Ziel-Gens

   • mehrere verschiedene, die sich teilweise überlappend

2. Origin of replication:

   • Replikationsursprung

3. Selektionsgen:

   • Antibiotika-Resistenz

   • (z.B. amp-Gen kodiert beta-Lactamase)

= Restriktionsenzyme

Restriktionsendonukleasen erkennen spezifische DNA-Sequenzen und schneiden sie geziehlt.

• finden sich hauptsächlich in Prokaryonten aber auch in Eukaryonten.

• dienen norm. der Abwehr von Fremd-DNA

Mechanismus:

• Bindung an Erkennungssequenz und Kontrolle, ob Organismus-spezifisches Methylierungsmuster vorhanden▪

• Bei Fehlen → Schneiden der DNA

• Enzyme die DNA spezifisch schneiden (Restriktionsendonucleasen)

• erkennen spezifische DNA-Sequenzen, schneiden dort oder "in der Nähe"

• Erkennungssequenz i.d.R. palindromartige Struktur

• Verwendung in der Gentechnik

Typ I: ATP-abhängig, Schnitt variabel weit entfernt von Erkennungssequenz, Methylgruppentransfer

Typ II: erkennen bestimmte DNA- Sequenzen (Palindrome) und schneiden die DNA an dieser Stelle.

• Schnitt exakt an palindromischer Erkennungssequenz, keine ATP-Zufuhr, keine Methyltransferase-Aktivität

• nur Mg2+ als Cofaktor

Typ III: wie Typ I aber definierter Schnitt bei 20-25 bp von Erkennungssequenz entfernt.

Typ IV: schneidet nur modifizierte DNA ( methyliert, hydroxyliert, glucosylhydroxyethyliert)

Proben werden zentrifugiert und bei 37°C 1,5h inkubiert, dann bei -20°C eingefroren

• während der Hybridisierung bindet Digoxygenin-markierte Sonde an die komplementäre Stränge vom Ampicillin-Resistenzgen

• Spezifischer Antikörper gegen DIG wird in Lösung an die Markierungsgruppe der Sonde gekoppelt

• Antikörper ist seinerseits an Enzym "alkalische Phosphatase" gekoppelt

• Alkalische Phosphatase katalysiert den ersten Schritt  einer farbige Redox-Reaktion nach Zugabe des Substrates

  → Detektion

• es können nur Fragmenre detektiert werden, die das amp-Gen aufweisen. Farbreaktion nur an Stellen, an denen Hybridisierung erfolgt ist- die Waschschritte sorgen dafür, dass unspezifisch gebundene AK entfernt werden.

• die Membran wird mit Vorhybridisierungslösung angefeuchtet, um einen Kunststoffstab gewickelt und in die entsprechende Hybridisierungsröhre gesteckt

• die Hybridisierungsröhre wird dann mit 20 ml Vorhybridisierungslösung befüllt

• die verschlossene Röhre mit der darin befindlichen Membran wird im Wasserbad bei 37 °C mindestens 1 h inkubiert

  
  

  -> Vorhybridisierung = ohne Sonde

  -> zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen auf den nicht- benutzten Bereichen der Membran.

=> Membran mit DNA-Sonde inkubieren. Komplementäre DNA-Stränge lagern sich an homologe Bereiche an.

laut Prof: richtige Reihenfolge

1. Denaturierung von Sonde und markiertem Größenstandard

2. Zugabe zur Hybridisierungslösung

3. und Inkubation bei 37°C => Anlagerung der Sonde an Zielsequenz (muss nicht immer Amp sein)

4. waschen bei erhöhter Temperatur 56°C => zur Entfernung nicht gebundener Sonde

-> der markierte Größenstandard lagert sich nur an den auf das Gel aufgetragenen und auf die Membran transferierten Lambdastandard, nicht bauf die Amp Sonde!

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Ablauf:

• neue Sonde: Amp-Sonde mit Digoxygenin-Resten markiertem Gamma-Größenstandard versetzen 

• Denaturierung durch Hitze (10 min bei 95 °C)

• Amp-Sonde mit Digoxygenin-Resten markiertem Gamma- Größenstandard zur Hybridisierungslosung pipettieren

• die Inkubation erfolgt bei 37°C über Nacht bei gleichem Versuchsaufbau wie bei der Vorhybridisierung

=> dunkelblau gefärbte Banden an den AK-Bindungsstellen

• Es wird die Umsetzung des Substrats 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP) durch Alkalische Phosphatase zu einem oxidierbaren Indoxyl- Intermediat katalysiert.

• Diese kann in einer Redoxreaktion mit Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) zu 5,5‘-Dibrom-4,4‘-dichlorindigo und dem Diformazan umgesetzt werden

  
  

  =>Beides sind unlösliche dunkelblaue Farbstoffe, die sich an der Stelle der Antikörperbindung als Bande erkennen lassen.

• Transformation→ Die Bakterienzelle nimmt freie DNA (meist Plasmide) aus der Umgebung auf

• Konjugation→ Das genetische Material einer Spenderzelle wird mit einer Kontaktstelle (Pilus) auf eine Empfängerzelle übertragen

• Transduktion/Transfektion→ Das genetische Material eines Bakteriums wird über Bakteriophagen (Viren, die Bakterien infizieren) aufgenommen und auf ein anderes Bakterium übertragen

• Kompetenz ist die Fähigkeit von Bakterien, DNA aus der Umgebung aufzunehmen

• Gram-positive Bakterien erlangen in einer bestimmten Phase des Lebenszyklus ihre Kompetenz

• Gram-negative Bakterien müssen die Kompetenz erlangen

  → Inkubation in CaCl2 in Kombination mit einem Hitzeschock

  → oder durch Elektroporation

• = lacZalpha-Komplementation

• Dient Kontrolle/ Identifizierung (gentechnischer Prozesse bei Herstellung) rekombinanter Bakterien

• Geeignete Plasmide/Vektoren tragen an der Insertionsstelle das Gen für die β-Galactosidase (lacZ)

• Werden diese Plasmide in kompetente Zellen von E. coli mit einer Deletion im lacZ-Gen transformiert, wird ß- Galactosidase codiert

• Dieser Vorgang wird als lacZ- Komplementation genannt

• Insertion der Fremd-DNA muss innerhalb der multiplen Klonierungsstelle des lacZ-Gens vom Plasmid erfolgen

  → Basis für die Methode

Ablauf:

• den Agarplatten wird ein chromogenes Substrat X-Gal zugegeben

• ß-Galactosidase hydrolysiert X-Gal zu einer Verbindung, welche weiter zu einem unlöslichen Indigofarbstoff dimerisiert

nicht rekombinante Zellen (E. coli + Plasmid)

→ blaue Kolonien codierende Sequenz für das Enzym bleibt ununterbrochen

• Bakterien, die nicht-rekombinante Vektoren tragen, β-Galactosidase ist funktionsfähig und setzt X-Gal (gelb) in ein Indigo-Derivat (blau) und Galactose um

rekombinante Zellen (E. coli + Fremd-DNA + Plasmid)

→ weiße Kolonien (Leseraster verschiebt sich durch Insertion der Fremd-DNA, codierende Sequenz für das Enzym wird unterbrochen da keine α-Komplementation)

• Bakterien, die erfolgreich rekombinierte Vektoren enthalten

• In der Gentechnik werden Plasmide als Vektoren für neu einzubringendes genetisches Material und dessen Klonierung verwendet.

• Klonierungsvektoren werden aus synthetischen Sequenzen und Teilen natürlich vorkommender Plasmide zusammengesetzt

Eigenschaften:

• replizieren autonom (origin of replication) => Replikationsursprung

• Selektionsmarker (z.B. Antibiotikaresistenzen)

• multiple cloning site (Polylinker): mehrere, verschiedene, sich teilweise überlappende Restriktionsschnittstellen

• multi-copy Plasmide (effiziente Amplifikation)

• geringe Molekülmasse (effiziente Transformation)

= Plasmid (Plasmid from the University of California)

• ist ein Multi-copy-Plasmid

• mit Selektionsmarker: Ampicillinresistenz

• Teile des lac Operons von E.coli

• multiple cloning site beim lacZ-Gen

• lag-Phase→ Bakterien passen sich an die Umgebung und die Wachstumsbedingungen an, noch kein Wachstum

• log-Phase→ exponentielle Vermehrung, maximale Teilungsrate

• stationäre Phase→ Nährstoffe werden sukzessiv verbraucht, Stoffwechselendprodukte der Bakterien an die Umgebung abgegeben, Vermehrung und Absterben liegen im Gleichgewicht

• Absterbephase→ Nährstoffe sind aufgebraucht und die Bakterien sterben ab

→ Die Behandlung mit CaCl2 sollte in der exponentiellen Phase (log-Phase) erfolgen, da hier optimale Bedingungen für das Bakterienwachstum vorliegen und die nachfolgenden Schritte Stress für die Bakterien darstellen.

• ZKBS steht für Zentrale Kommission für die Biologische Sicherheit

• Ist ein ehrenamtliches tätiges Expertengremium, berät Entscheidungsverantwortliche in Politik und Verwaltung

Aufgaben:

• Risikobewertung von Organismen und Sicherheitseinstufung von gentechnischen Arbeiten

• Beteiligung an gentechnischen Überwachungs- und Genehmigungsverfahren

• Stellungnahme zu Anträgen und Freisetzung oder Inverkehrbringen von gentechnisch veränderten Organismen (GVO)

• Beratung von Entscheidungsträgern in Politik und Verwaltung

Die Methode der Elektroporation:

• Die Zellmembran wird destabilisiert und somit die Permeabilität erhöht durch Behandlung mit einem elektrischen Puls (Hochspannungsimpulse)

• es entstehen Poren in Zellmembran, DNA kann so in Zell

• Die Impulse werden durch einen Kondensator erzeugt

• Gerät: Elektropotator

• Poren sind nur vorübergehend vorhanden (die Zellen regenerieren sich)

• Diffusion <-> Elekrophoretische Migration

• Ergebnis hängt stark von der Zellsuspension ab

Vorteile:

• Ausgezeichnet mit einer hohen Effizienz

• Geeignet für verschiedene Zelltypen (z. B. auch für eukaryotische Zellen)

• Kann für eukaryotische als auch prokaryotische Zellen verwendet werden

Arten der Transformation

1. CaCl2/Hitzeschock-Methode

• Inkubation in CaCl2 70mM und 20mM CaCl2 bei 0°C für 30min => erezugt Poren in der Zellmembran

• Anschließend kann die DNA mit Hilfe eines Hitzeschocks "Heat shock" in die Zelle eintreten (42°C /90s)

• Einfachste und gebräuchlichste Methode (aber mit vergleichsweise geringer Transformationseffizienz)

2. Elektroporation

3. Mikroinjektion

• Direkte Injektion von DNA in die Zelle mit einer Glaskanüle

• Anwendung v.a. bei tierischen Zellen und Protoplasten

4. Sonoporation

• Niederfrequente Ultraschallbestrahlung erzeugt Blasen

• Blasen kollabieren und erzeugen temporäre Poren in der Membran→ Erhöhung der Permeabilität

Supercoiled-DNA:

• stark verdrillt, weist zusätzliche Windungen auf → kompakt: Nadelöhr-Faden-Effekt

• Offen zirkuläre und lineare DNA reduziert den Transformationserfolg

die Transformationseffizienz (TE) gibt die Anzahl der erfolgreich transformierten Bakterienkolonien pro 1 μg eingesetzter Plasmid-DNA nach Transformation an

• unter optimalen Bedingungen werden 106-107 Kolonien/μg Plasmid-DNA erwartet

Supercoiled ist kompakter, läuft daher schneller

nur transformierte Zellen mit beta-Lactamase-Gen überleben

es neutralisiert negative Ladungen, erleichtert die DNA-Aufnahme

damit Zellen das Resistenzgen exprimieren können, bevor sie dem Antibiotikum ausgesetzt werden

Coomassie Brilliant Blue G-250

-> bildet mit Proteinen Komplexe, es kommt zur verschiebung des Absorptionsmaximums (465 nm nach 595 nm)

-> Bradford-Bestimmung von Proteingehalt.

Proteine werden behandelt mit:

• ß-Mercaptoethanol und Natrium-Dodecylsulfat (SDS) mit Hitze

ß-Mercaptoethanol:

• reduziert die evt. vorliegende Disulfiedbrücken zwischen Cystein

• Novoseven auf 2 Banden unterschiedlichen Höhen

SDS:

• bricht alle Sekundär-, Tertiär-, und Quartärstruckturen auf und schließt Protein in eine SDS- Mizelle ein

Hitze:

• unterstützt den Prozess der Denaturierung

• Anwendung: in Kombination mit anderen Enzymen zur Produktion von Naturstoffen in Mikroorganismen

• Katalysiert die Reaktion von Acyl-CoA (z. B. Acetyl-CoA) mit Malonyl- ACP zu einem 3-Ketoacyl-ACP

• Zelllysat: kein isoliertes Enzym, sondern ein Rohextrakt mit rekombinant überexprimiertem Enzym

• Molare Masse: 45 kDa

• Wirkung: spaltet ß-1,4-glykosidische Bindung zwischen N-Acetylglucosamin (NAG) und N-Acetylmuraminsäure (NAM) in Zellwänden von Bakterien

  => Zellwand wird zerstört

• Anwendung: Lyse von Bakterienzellen

• Vorkommen in vielen körpereigenen Sekreten (Tränenflüssigkeit, Liquor, Speichel, Serum, Muttermilch etc.)

• Molare Masse: 14,3 kDa

Native: 

• Trennung der Proteine in ihrer gefalteten Form

• physiologische Eigenschaften der Proteine bleiben erhalten

• Trennung nach Ladung, Größe und Form der Proteine 

• Untersuchung der Komplexbildung und der Konformation von Proteinen

Denaturierend: 

• Denaturierung der Proteine durch SDS

• Trennung nur nach Molekülgröße

• Bestimmung der Molekularmasse

• Bakterien: E.coli

• Hefezellen: Saccharomyces cerevisiae

• Säugetierzellen: Rattus-Gattung

• Insekten: Spodoptera frugiperda

• Pflanzen: Nicotiana tabacum

= gentechnisch hergestellter Blutgerinnungsfaktor VIIa

• Anwendung: vor chirurgischen Eingriffen, bei Blutungen, Hämophilie

Prinzip:

• Verschiebung Absorptionsmaximum Coomassie Brilliant Blue G-250 von 465 nm nach 595 nm durch Komplexbildung mit Protein

  
  

• Messen der Extintionsänderung bei 595 nm

• Eichgerade nötig, hier mit BSA als Standard

• Bradford-Lösung: Farbstoff Coomassie Brilliant Blue G-250

• Farbstoff bindet an kationische und nichtpolare hydrophobe Seitenketten der Proteine

• Farbstoff wird in seiner anionischen Form stabilisiert→ Änderung des Absorptionsmaximums von 465 nm auf 595 nm

Durchführung:

• Verdünnungsreihe mit BSA (= Rinderserumalbumin) herstellen (50 μl)

• 950 μL Bradfordreagenz hinzugeben und 5 min stehen lassen

• Vermessen und Eichgerade aus den Ergebnissen erstellen

• Absorptionswerte werden gegen die BSA-Eichkonzentrationen aufgetragen

-> ermittlung der Absorption A bei den Wellenlängen 260nm und 280nm

Ziel:

• quantifizierung der rekombinant hergestellten Proteine- Vorbereitung auf die SDS-Page:

  -> ermittlung der benötigten Auftragsmenge

  -> Ziel: gleichmäßige Bandenintensitäten (nicht zu wenig Protein und keine überladenden Banden)

Durchführung:

• Herstellung von Probelösungen unterschiedlicher Verdünnung

• Messung der Absorption bei zwei Wellenlängen

  -> λ1 = 260 nm: Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren

  -> λ2 = 280 nm: Absorptionsmaximum von aromatischen Aminosäuren (Trp, Tyr, Phe)

Berechnung des Proteingehalts gemäß folgender Formel:

c(Protein) [μg/μl] = 1,55 × A2801cm – 0,76 × A2601cm

-> laut Ph.Eur. DNA-rekombinationstechnisch hergestellte Produkte

= Rekombinante Arzneimittel sind biotechnologisch hergestellte Proteine, die durch gentechnisch veränderte Organismen (z. B. E. coli, CHO-Zellen) produziert werden.

• Dabei wird das künstlich eingebrachte Gen im Wirtsorganismus exprimiert

  → therapeutisches Protein entsteht.- basiert auf genetischer Modifikation

Voraussetzung: bekannte für Produkt codierende DNA

• Transformation Plasmids oder Virus als Vektor in geeigneten Mikroorganismen => Wirts-Vektor-System

• Expression des Proteins

• Produktgewinnung durch Extraktion und Reinigung

Problem E. coli:

• nicht geeignet für Expression eukaryotischer Gene=> keine posttranslationalen Modifikationen, Produktion Endotoxine

= Rinderserumalbumin

Anwendung:

• in der Forschung als Standard (Eichkurven etc.)

• Blockierlösung bei ELISA oder Western-Blot

Albumin im Körper von Leber produziert

=> Aufrechterhaltung Flüssigkeitshaushalt und pH-Wert

• Transport wasserunlöslicher Substanzen

• Molare Masse: 66,5 kDa

= Na-Dodecylsulfat

• Anionisches Detergenz

• Lipophile Reste lagern sich an Peptidbindungen an

• Linearisierung der Proteine durch Abstoßungskräfte => denaturierende Gelelektrophorese

• SDS überdeckt Eigenladung der Proteine, Proteine einheitlich negativ geladen=> Wanderung zur Anode=> konstantes Masse-Ladungsverhältnis der Proteine, dadurch Trennung nur nach Molekulargewicht

= Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

• denaturierend

• diskontinuierlich => unterschiedliche Acrylamidkonzentrationen und pH Bedingungen= diskontinuierlich (neu)

Prinzip:

• Basiert auf den Einsatz eines diskontinuierlichen Puffersystems mit zwei unterschiedlichen Puffern und Gelschichten

• Diskontinuität bezieht sich auf:

  ->Gelstruktur, pH-Wert der Puffer, Ionenstärke der Puffer, Art der Ionen im Gel und im Elektrodenpuffer.

Vorteile:

• höhere Bandenschärfe

• bessere Trennung der Proteine

• verkürzte Laufzeit

  
  

  -> Verhindert das Aggregieren und Präzipitieren von Proteinen beim Eintritt in die Gelmatrix.

  -> Verlässlichkeit: Durch die Konzentration der Proteine im Sammelgel wird die Qualität der Auftrennung im Trenngel verbessert.

Sammelgel: 

• pH 6,8- besteht aus 0,4% SDS und 0,5M Tris/HCl- hat größere Porengröße

-> konzentriert Proteine in einem dünnen Band bevor sie ins Trenngel übergehen

Trenngel: 

• pH 8,8- besteht aus 0,4% SDS und 1,5M Tris/HCl

-> hat kleinere Porengröße, Trennung der Proteine erfolgt nach ihrer Größe (weil Acrylamidkonzentration größer)

= Streptokinase

Wirkung:

• aktiviert Plasminogen zu Plasmin => löst Fibrin auf => Blutgerinnsel zerstört

Anwendung:

• Reinigung blutverschmutztes Material, Behandlung schwerer Thrombose, Herzinfakt

• Molare Masse: 50,140 kDa

• Bradford besser

  -> hohe Sensitivität

  -> erhält genauere Werte durch Eichgerade

  -> nicht so störanfällig wie Warburg-Christian

• Prokaryotischer Organismus

• Andere Regulationsmechanismen der Expression als bei Eukaryoten

• keine posttranslationalen Modifikationen

• komplexere Transkription bei Eukaryoten

• Prozessierung bei Eukaryoten

= gentechnisch hergestelltes Humaninsulin

Anwendung:

• Blutzuckerspiegel senken bei Diabetes Typ 1

• Molare Masse: 5,808 kDa;

besteht aus:

• zwei Untereinheiten (A- und B-Kette)

• die über zwei Disulfidbrücken verbunden sind

  => werden durch Reduktionspuffer (Dithiothreitol) reduziert

  => zwei Banden bei ca. 2,4 kDa (A-Kette) und 3,4 kDa (B-Kette) erwartet

Bild 1) (Bild 2 nur als Ergänzung)

FR900359-Struktur

• Grün: PharmakophorBesondere Strukturelemente:

• Gelb: 2 benachbarte Esterbindungen

• Rot: cis-konfigurierte Peptidbindungen

-> ungewöhnliche Struktur für einen Pflanzenmetaboliten 

• wird im Org synthetisiert durch nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS)

Bild 1) (Bild 2 nur als Ergänzung)

=> FR900359

• cyclisches Depsipeptid, aus 8 Bausteinen:

  • 7 nicht-proteinogenen und 1 proteinogenen Aminosäure

• Verknüpft über Peptid- und Esterbindung

• besteht aus modifizierten AS und Carbonsäuren

• besitzt neben trans- auch cis- Peptidbindungen sowie Esterbindungen

Besonderheiten:

• N-methylierte Amidbindungen

• Hydroxysäurebausteine-> Stabilisierung und Schutz gegen Peptidasen

• Eingefügte Seitenkette am β-Hydroxyleucin durch Esterreaktion entscheidend für Gq-Hemmung

PCR-Produkt vom Kontrollplasmid und Template sind gleichweit gelaufen

-> Hinweis auf Identität

• Zwischen 564 bp und 831 bp

Kalibriergerade:

• Auftragung der Laufstrecke der DNA-ladder gegen log(M)

• Anhand der Gleichung kann auf M(Template) geschlossen werden

= Ethidiumbromid

Funktionsweise:

• Ethidiumbromid (EtBr) ist ein Farbstoff, der DNA sichtbar macht.

• Es interkaliert zwischen die Basenpaare der DNA-Doppelhelix.

• Dadurch wird die DNA unter UV-Licht sichtbar, da Ethidiumbromid bei 254 und 366nm um das 50-100fache fluoresziert.

Verwendung in der Gelelektrophorese:

• Ethidiumbromid wird dem Agarosegel oder der Laufpufferlösung hinzugefügt.

• Nach der Elektrophorese leuchtet die DNA auf, wenn sie mit UV-Licht bestrahlt wird.

Sicherheitsaspekt:

• Vorsicht: Ethidiumbromid ist stark krebserregend.

• Bei der Handhabung sind Schutzhandschuhe und Schutzbrille notwendig.

Alternativen:

• Heute werden oft sicherere Farbstoffe wie Midori Green verwendet, die weniger toxisch sind.

Trennprinzip:

• Wanderung der negativ geladenen DNA zur positiven Anode im elektrischen Feld bei 90V

• Trennung erfolgt in Abhängigkeit der Größe der DNA-Fragmente (Molekularsiebeffekt)

→kleine Fragmente wandern schneller durch das Gel

• Größenstandard dient als Vergleich

• Anfärben der Probe mit Bromphenolblau zur Verfolgung der Laufweite

• UV- Detektion mit interkalierender Midori-Green-Lösung

=> wird im Org. synthetisiert durch nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS)

-> Synthese erfolgt durch die nicht-ribosomale Peptidsynthetase (Multienzymmaschinerie)

• Gene der Peptidsynthetase sind auf einem extrachromosomalen Plasmid lokalisiert

  -> FrsD - FrsG: Bildung eines TE-gebundenen Heptapeptids (FR-Core (2))

  -> TE von FrsG katalysiert Abkopplung und intramolekulare Zyklisierung

  -> TE von FrsA: Übertragung von N-Propylhydroxyleucin = intermolekulare Veresterung

Besonderheit: 2 Thioesterase (TE)-Domänen im frs-Biosyntheseclusters (Bestandteil von FrsG und FrsA)

• die Zyklisierung des Peptids erfolgt durch Ausbildung einer intramolekularen Esterbindung mittels einer Thioesterase (TE) von FrsG. 

• die andere Thioesterase befindet sich im FrsA, das vom frsA-Gen codiert wird. Diese katalysiert die intermolekulare Veresterung (fügt Seitenkette an, diese ist wichtig für die FR900359 Funktion).

- Gene der Peptidsynthetase sind auf einem extrachromosomalen Plasmid lokalisiert

• FrsD - FrsG: Bildung eines TE-gebundenen Heptapeptids (FR-Core (2))

• TE von FrsG katalysiert Abkopplung und intramolekulare Zyklisierung

• TE von FrsA: Übertragung von N-Propylhydroxyleucin = intermolekulare Veresterung

-> FR wirkt als GDP-dissotiations Inhibitor (Gq-Inhibitor)

• bindet an die G alpha q- Untereinheit des G alpha beta gamma- Heterotrimers

• Austausch von GDP zu GTP verhindert (pseudo-irreversible Bindung)

• Dissoziation der alpha- Untereinheit von der beta gamma- Untereinheit verhindert

  => keine Signalübertragung

  -> greift in die Signaltransduktion ein, indem es Galphaq hemmt (GDT-GTP-Austausch)

• Ca.B. ist abhängig von den Pflanzenmetaboliten

→ Kultivierung alleine nicht möglich

• Gewinnung aus Extraktion der Ardisia crenata Blätter

• Rekombinante Herstellung mittels E.coli

• Totalsynthese bis jetzt hohe Kosten und geringe Ausbeute → nicht effizient

Prozesse, die Gq-vermittelt sind wie: beim Menschen noch in Forschung

• Starke Hemmwirkung mit hoher Selektivität für Gq-Protein → viele Signalwege von pathologischen Prozessen über Gq-Rezeptoren

• Entzündungsprozesse im Auge (Uveitis, Uveales Melanom)

• Kardiovaskuläre Erkrankungen (Blutdrucksenkend)-> systolischer arterieller Blutdruck in der Aorta

• Atemwegserkrankungen (Asthma) -> vasorelaxierende Wirkung 

• Krebstherapie: Hemmung des Zellwachstums (G1-Kontrollpunkt), Induktion der Differenzierung, Hemmung der Melanomzellmigration

Forschung:

• verwendung des Gq-Inhibitors FR900359 zur Untersuchung der Rolle von Gq-Signalwegen in braunen und beigen Fettzellen

• greift in die Signaltransduktion ein, hemmt Gaphaq (GDT-GTP-Austausch)

  
  

• Stellt die gewünschten Temperaturen für die drei Phasen der PCR ein

• Ermöglicht eine genaue und schnelle Einstellung der Ansätze (5 °C/s)

Porengröße des Gels:

• Das Agarosegel wirkt wie ein Sieb.

• = Molekularsiebeffekt- Kleinere DNA-Fragmente passen leichter durch die Poren und können sich daher schneller hindurchzwängen.

• Größere Fragmente haben es schwieriger, durch die Poren zu wandern, da sie öfter an der Matrix „hängen bleiben“ oder sich hindurch „winden“ müssen.

• Ladung und Masse:

  • Alle DNA-Fragmente haben eine gleichmäßige negative Ladung pro Masse (aufgrund der Phosphatgruppen im DNA-Rückgrat).

  • Daher hängt ihre Wanderungsgeschwindigkeit nicht von der Ladung, sondern hauptsächlichvon der Größe und Form ab.

• Zweck: Trennung und Analyse von DNA, RNA oder hochmolekularen Proteinen.

• Funktioniert durch elektrische Spannung: DNA-Fragmente wandern durch das Gel.

  • Kleinere Fragmente bewegen sich schneller durch die Poren des Gels.

  • Größere Fragmente bewegen sich langsamer und bleiben näher am Startpunkt

Ein Agarosegel besteht aus Agarose, einem natürlichen Polysaccharid, das aus Algen gewonnen wird.

• Es bildet eine poröse Matrix, die wie ein dreidimensionales Netz wirkt.

• Wird zur Trennung von DNA-Fragmenten nach Größe verwendet.

• Ermitteln der Größe der amplifizierten Sequenz

• Erwartete Länge: 750 bp

• Größenstandard wird zur Erstellung einer Kalibriergeraden genutzt

• Vorsicht: Bildung von Bläschen

• Bakterium "Candidatus Burkholderia crenata" in A. crenata befindet sich in den Blattknoten (Nodulae) und produziert FR900359

Endosymbiont "Candidatus Burkholderia crenata" in den Blattknötchen von A.crenata trägt das frs Biosynthesecluster auf einem extrachromosomalen Plasmid

• Biosynthesecluster frs kodiert für eine nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS)

  -> wirs im Org. synthetisiert durch nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS)

  -> RF900359 reift in in die Signaltransduktion von Zellen ein, indem es Galphaq hemmt (GDT-GTP-Austausch) 

Endosymbiose:

-> Symbiose = enge Form von Vergesellschaftung zwischen 2 Organismenarten für beide Partner von Nutzen und i.d.R. eine dauerhafte Lebensgemeinschaft

• Vorteil für A. crenata: Schutz vor Fraßfeinden, Selektionsvorteil

• Vorteil für Candidatus burkholderia crenata: Fortpflanzung durch Samen von A. crenata, geschützter Lebensraum, Nährstoffversorgung

• Standardmäßig genutztes Enzym für die PCR

• Ursprünglich aus Bakterium Thermus aquaticus isoliert

• Vorkommen: in heißen Quellen im Yellowstone-Nationalpark

• Sehr thermostabil, wird durch die hohen Temperaturen bei der Denaturierung nicht inaktiviert-> Optimale Aktivität bei 72 °C, bei 95 °C aber nur wenige Minuten stabil