Angewannte Biologie

ermöglichen geziehlte Untersuchungen, Veränderungen und Vervielfältigung von DNA

Enzyme, die DNA an spezifischen Sequenzen schneiden

Funktionsweise:

1. erkennen bestimmte Basensequenzen (meist palindromisch)

2. Zerschneiden die DNA an diesen Stellen

3. Es können entweder glatte Enden oder sticky-ends entstehen

-> dient zur Vorbereitung für den Einbau in Vektoren

Transportmittel für DNA, mit dem fremde Gene in eine Zielzelle eingeschleust werden

Arten von Vektoren:

1. Plasmide

2. Viren

3. künstliche Vektoren

1. kleines ringförmiges, doppelsträngiges DNA-Molekühl in Bakterien das als Vektor genutzt wird

2. unabhängig von Bakterienchromosom und selbstständig replizierbar

3. Besitzt Replikationsursprung (Startpunkt der DNA-Vervielfältigung)

4. Besitzt Markergene/Antibiotikaresistenzgene

5. Besitzt Restriktionsschnittstellen (kann sich auch innerhalb eines Antibiotikaresistenzgens befinden)

Einschläusen von Fremd-DNA in Bakterienzellen um diese zu vervielfältigen:

1. DNA-Extraktion

2. Schneiden von Plasmid und Fremd-DNA durch Restriktionsenzyme

   -> es entstehen komplimentäre sticky-ends

3. Transfer des Fremdgens in den Plasmid und Verknüpfung der zufor geschnittenen Sequenzen durch DNA-Ligase

   -> es entstehen zwei arten von Plasmiden

   1. nicht-rekombinanter Plasmidring ohne Fremd-DNA mit zwei intakten Antibiotikaresistenzgenen

   2. rekombinanter Plasmidring mit Fremd-DNA innerhalb einer der Markergene, nur ein intaktes Antibiotikaresistenzgen

4. Aufnahme in Wirtszellen/Zielzellen (Bakterium)

   -> nicht alle Zellen nehmen erfolgreich einen Plasmidring auf

   1. nicht-transformierte Zelle: Zelle die keinen Plasmidring aufgenommen har

      -> keine Antibiotikaresistenz

   2. transformierte nicht-transgene Zelle: Zelle die einen Plasmidring ohne Fremd-DNA aufgenommen hat

      -> zwei Antibiotikaresistenzen

   3. transgene Zelle: Zelle die einen Plasmidring mit Fremd-DNA aufgenommen hat

      -> eine Antibiotikaresistenz

5. Erste Selektion auf einem Nährboden mit Antibiotikum 1

   -> nurZellen mit Plasmid überleben

6. Zweite Selektion durch überstempeln auf einen Nährboden mit Antibiotikum 2

   -> nur transformierte nicht-transgene Zellen überleben

Polymerase-Ketten-Reaktion: Verfahren zur gezielten Vervielfältigung eines bestimmten DNA-Abschnitts in vitro (im Reagenzglas)

Läuft in thermischen Zyklen ab:

1. Denaturiergung (94-96°C)

   -> DNA-Doppelstrang wird durch Hitze getrennt

2. Primeranlagerung (50-65°C)

   -> kurze DNA-Primer lagern sich komplimentär an

3. Elongation (72°C)

   -> hitzeresistente Taq-Polymerase bindet an Primer und es werden komplimentäre Nukleotide ergenzt

-> nach jedem Zyklus wird die DNA einmal verdoppelt

Verfahren zur Trennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Länge mit hilfe eines elektrischen Felds

Grundprinzip: DNA istdurch Phosphatgruppe negativ geladen und wandert im elektrischen Feld zur Anode

Ablauf:

1. DNA wird in Geltaschen pipettiert und es wird ein elektrisches Feld angelegt

2. Die DNA wandert durch das Gel welches als Molekularsieb dient in Richtung des Pluspols

3. umso kleiner die DNA Fragmente sind umso schneller und weiter können sie durch das Gel wandern

4. Es entsteht ein sichtbares Bandenmuster

1. Ein DNA Abschnitt wird durch PCR vervielfältigt

2. Mit dem Prinzip der Gelelektriphorese wird ein DNA-Profil in Form eines Bandenmusters erstellt

3. Anzahl STRs (Short Tandem Repeats) variiert von Person zu Person

4. Desto kleiner die Unterschiede, desto höher ist der Verwandschaftsgrad der untersuchten Personen

In der Medizin:

1. Herstellung von Medikamenten (z.B Insulin)

   -> große Mengen möglich

   -> keine Nutzung von Tieren nötig

2. Gentherapie: Ersetzen oder Ergänzen von defekten Genen

   -> Genetische Krankheiten können behandelt werden

3. Impfstoffproduktion

In der Landwirtschaft:

1. Schädlingsresistenz

   -> weniger Pestizide notwendig

2. Ertragssteigerung

   -> bessere Anpassung an Klima

3. Nährstoffanreicherung

4. Längere Haltbarkeit

1. in der Medizin

   • mögliche Immunreaktionen

   • unklare Langzeitwirkungen beinGentherapie

2. Ökologische Risiken

   • Auskreuzung in Wildpopulationen (Übertragung von veränderten Genen auf wildlebende Populationen und unkontrollierte Ausbreitung)

   • Verlust von Biodiversität

3. Resistenzentwicklung

   • Schädlinge entwickeln Resistenzen gegen genetisch Veränderte Pflanzen

4. Ethik

   • Eingriff in natürliche Evolution

5. Sozialökonomische Risiken

   • Abhängigkeit von Saatgutkonzernen

   • Patentproblematiken

   • Ungleicher Zugang zu Technologie

1. Bakterien-DNA

2. Palindromische Wiederholungen (palindromic repeats)

3. Spacer (Viren-DNA Fragment)

4. CRISPER-DNA (“Bibiliothek”)

5. Transkription

6. prä-CRISPER-RNA

7. Guide-RNA

8. Spacer

9. Tracer

10. Cas9 (Enzym)

11. CRISPER-Cas-Komplex

12. Virus

13. Virus-DNA

14. Zerschneidung der Virus-DNA (Doppelstragbruch)

15. durchtrennte Virus-DNA

1. Herstellung der guide-RNA

   -> künstliche herstellung von RNA-Sequenzen die komplimentär zur Ziel-DNA sind

2. Bildung des CRISPER/Cas-Komplexes

   -> guide-RNA bindet an Cas9-Protein

3. Erkennung der Ziel-DNA

   -> guide-RNa bindet an komplimentäre DNA-Sequenz

4. Doppelstrangbruch in der DNA

   -> Cas9 schneidet beide DNA-Stränge exakt an der Zielstelle und es entsteht ein kontrollierter Bruch

5. Reperatur durch die Zelle

   -> Die Zelle versuchf den Schaden zu reparieren:

   • direkte Verknüpfung der DNA-Enden

     -> meist fehlerhaft

     -> Gen wird funktionsunfähig

     -> Nutzung zur Genausschaltung (z.B. Krankheitsgene)

   • Reperatur mit bereitgestellter DNA-Vorlage

     -> gezielte Veränderung möglich

Behandlung genetische bedingter Erkrankungen durch Veränderung des Erbguts indem defekte Gene ersetzt repariert oder ausgeschaltet werden

Veränderung von Körperzellen eines Patienten

1. Funktionsfähiges Gen wird isoliert und über einen Vektor in die Zielzelle transferriert

2. Defektes Gen wird kompensiert

3. Krankheitssymptome können gelindert oder geheilt werden

-> geziehlte Behandlung möglich ohne Veränderung der Keimbahn

-> ethnisch eher akzeptiert

-> Wirkung ist oft nicht dauerhaft da nicht alle Zellen erreicht werden und kann zu Immunreaktionen führe

Veränderung von Keimzellen oder frühen Embryonen

1. genetische Defekte können vollständig eliminiert werden

2. Weitergabe an Nachkommen kann verhindert werden

-> unvorhersehbare Langzeitfolgen und mögliche Fehlveränderung

-> ethnische Probleme da in menschliche Evolution eingegriffen wird

1. Diagnostische Tests

   Nachweis bereits vorhandener genetischer Erkrankungen

2. Prädiktive Tests

   Vorhersage von Krankheitsrisiken

3. Pränataldiagnostik

   Untersuchung von Embryonen/Föten und Feststellung genetischer Auffälligkeiten

4. Trägertests

   Feststellung,ob jemand ein defektes Gen trägt

1. Früherkennung von Krankheiten

   rechtzeitige Diagnose -> bessere Therapiechancen

2. Prävention

   Anpassung des Lebensstils und medizienische Vorsorge

3. Familienplanung

   Risikoabschätzung für Nachkommen

   informierte Entscheidungen

4. Personalisierte Medizin

5. Psychologische Entlastung

   Klarheit über genetische Risiken

1. Begrenzte Aussagekraft

   nicht jede Mutation führt sicher zur Krankheit -> Wahrscheinlichkeiten, keine Sicherheiten

2. Psychische Belastung

   Angst vor zukünftigen Erkrankungen

   Unsicherheit bei unklaren Ergebnissen

3. Ethnische Probleme

   pränatale Diagnostik -> mögliche Selektion von Embryonen

   Frage nach “lebenswertem Leben”

4. Fehlerinterpretation

   Ergebnisse können falsch verstanden werden

Fachliche Beratung von Personen/Familien zu genetischen Risiken, Testergebnissen und möglichen Entscheidungen

Aufgaben:

• Erklärung der Testergebnisse

• Einschätzung von Risiken

• Unterstützung bei Entscheidungen

Ziele:

• informierte Entscheidung ermöglichen

• psychische Belastung reduzieren

• Fehlerinterpretation vermeiden

Gen liegt auf einem Autosom (Nicht-Geschlechtschromosom)

-> Männer und Frauen gleich häufig betroffen

Gen liegt auf dem X-Chromosom

-> Männer sind häufiger betroffen (da dur ein X)

-> Frauen sind oft Überträgefinnen

ein Allel reicht, damit Merkmal auftritt

-> Betroffene haben meist betroffene Eltern

Merkmal tritt nur auf bei zwei defekten Allelen

-> Eltern können gesund und Träger sein

1. Autosomal-dominant

   • jede Generation ist betroffen

   • Betroffene haben mindestens ein betroffenes Elternteil

   • Männer und Frauen sind gleich häufig

2. Autosomal-rezessiv

   • überspringt Generationen

   • Eltern sind oft gesund und nur Träger

   • Männer und Frauen gleich häufig

3. X-chromosomal-dominant

   • häufiger Frauen betroffen

   • jede Generation betroffen

   • Ein betroffener Vater hat nur betroffene Töchter aber keine betroffenen Söhne

4. X-chromosomal-rezessiv

   • Männer sind häufiger betroffen

   • Frauen sind meist Überträgerinnen

   • kann Generationen überspringen

   • Ein betroffener Vater hat keine betroffenen Söhne

1. mehr Männer betroffen

   -> X-rezessiv

2. jede Generation betroffen

   -> dominant

3. Gesunde Eltern und krankes Kind

   -> rezessiv

4. Betroffener Vater und betroffener Sohn

   -> autosomal

Untersuchung des ungeborenen Kindes wärend der Schwangerschaft

• Ziel ist die Feststellung für genetische oder chromosomale Auffälligkeiten

• Wird nach Einnistung im Mutterleib durchgeführt (ab 9. Schwangerschaftswoche)

• zum Beispiel Ultraschall, Fruchtwasseruntersuchung oder Chorinozottenbiopsie (Entnahme von Gewebe aus der Plazenta)

-> Risiko eines Schwangerschaftsabbruches durch Eingriffe

-> Entscheidung über Fortführung der Schwangerschaft und geziehlte Vorbereitung auf Geburt

genetische Untersuchung eines Embryos vor der Einsetzung in die Gebärmutter -> nur im Rahmen einer künstlichen Befruchtung möglich

1. Hormonstimulation der Frau

2. Entnahme von Eizellen

3. Befruchtung im Labor

4. Entwicklung mehrerer Embryonen

5. Entnahme und genetische Untersuchung einzellner Zellen aus Embryo (meist im 8-Zell-Stadium)

6. Auswahl eines gesunden Embryos

7. Einsetzen in die Gebärmutter

-> Vermeidet schwere genetische Erkrankungen

-> keine betroffene Schwangerschaft entsteht durch frühzeitige Selektion gesunder Embryonen

-> Embryonenselektion ist ethisch umstritten

-> keine Garantie auf erfolgreiche Schwangerschaft

Aus medizinischer Sicht:

• Pränataldiagnostik

  -> ermöglicht Diagnosen wärend der Schwangerschaft

  -> Risiko durch invasive Eingriffe

• Präimplantaldiagnostik

  -> verhindert Geburt genetisch erkrankter Kinder

  -> keine belastenden Entscheidungn während Schwangerschaften

Aus Ethnischer Sicht:

• Pränataldiagnostik

  -> mögliche Entscheidung über Schwangerschaftsabbruch

• Präimplantaldiagnostik

  -> Auswahl und Verwerfen von Embryonen durch Embryonenselektion

  -> ethnische Diskussion über “Beginn menschlichern Lebens”