Biotechnologie Zusammenfassung Fragen

praktische Nutzung biologischer Phänomene

rote Biotechnologie = Pharmazie/Medizin

weiße Biotechnologie = Industrie

grüne Biotechnologie = Landwirtschaft

Worauf geht die Biotechnologie zurück? Prozesse + 2 Beispiele

-> empirische Prozesse (Bier und Wein Herstellung)

Fleming entdeckt… Penicillin

Watson & Crick veröffentlichen… DNA-Modell

60er/70er Entdeckung…. Restriktionsenyme

70er Sequenzierung … DNA

80er Erfindung der ….PCR

erstes rekombinantes Medikament Insulin

90er Welches Projekt + erste experimentelle… Human Genome Project und Gentherapie

2012 erste Zulassung für …Gentherapie Medikament

2018 Nobelpreis für ….gerichtete Evolution und Selektion

2020 Nobelpreis für …Genome Editing

• Actinomyceten, Archaeen, Bakterien

• Hefen, Schimmelpilze

  • Insektenzellen, Säugerzellen

• viele Organismen sind interessant

• wenige können genutzt werden

  —> viele Organismen lassen sich nicht gut genetisch manipulieren und nur schlecht/gar nicht kultivieren

• Archaeen

• Bakterien

• Prokaryonten

• Archaeen und Bakterien bilden die Prokaryonten

• Archaeen sind den Eukaryonten ähnlicher als den Prokaryonten

• Termitendarm, Rindermagen, auf Reisfeldern

• Archaeen

• strikt anaerob

• alle Organismen die unter extremen Bedingungen leben

• häufig biotechnologisch interessante Produzenten

  —> ABER wenig Einsatz, da sie sehr schwer zu kultivieren sind

Vehikel zur Übertragung von genetischer Information

Überbegriff: Einbringen von fremder genetischer DNA

• Plasmid

• Cosmid

• BAC

• YAC

• MAC

• Klonierungvektoren

  • nicht für die Proteinexpression geeignet

  • werden meist in E.coli eingesetzt

• Expressionsvektoren

  • sind für die Expression geeignet

• Shuttle-Vektoren

  • funktionieren in mehreren Organismen

  • häufig zur Klonierung in E.coli und Expression in anderen Organismen

• ori

  • für die Replikation des Vektors

• Antibiotika-Resistenzgen

  • für die Selektion auf vorhandensein des Vektors

• MCS (=multiple cloning site)

  • zum einfachen Klonieren

• Promotor

  • für den Start der Transkription

• RBS (ribosomale binding site)

  • für den Start der Translation

• Terminator

  • für den Stop der Transkription

• Stop-Codon

  • für den Stop der Translation

• CDS/GOI

  • codierense Sequenz/gene of interest

• kurze Peptidsequenzen oder auch längere Proteinsequenzen, die sich am N- oder C-Terminus des protein of interest befinden

  —> Fusionsproteine

• dienen zur Detektion und Reinigung

  • Detektion:

    • hohe Affinität und hohe Spezifität

  • Reinigung

    • mittlere Affinität und hohe Spezifität

• Western Blot mithilfe von Antikörpern

• Flag-tag, HA-tag, His-tag, Myc-tag, Strep-tag

• GFP-tag, GST-tag, MBP-tag

• Vorwärts-Primer

• Polymerase-Puffer

• dNTP

• Template

• DNA-Polymerase

• Rückwärts-Primer

1. Denaturierung

   • Trennen des Doppelstrangs in 2 Einzelstränge

   • ca. 94°C

2. Annealing

   • binden der Primer

   • ca. 54°C

3. Extension

   • Verlängerung der Primer durch DNA-Polymerase

   • 72°C

4. Wiederholung der Zyklen

   • meist 20-30 mal

• nach der 4+2-Regel

  • 4°C für G-C (3H-Brücken)

  • 2°C für A-T (2 H-Brücken)

• immer am 3´-Ende

• immer von 5`—>3`-Ende

Vorwärts-Primer

• 5’ - XXXXXX— Erkennungssequenz NdeI — Gen für His-tag — primender Bereich “vorderer” Bereich des GFP Gens -3’

Rückwärts-Primer

• 5’ - XXXXXX — Erkennungssequenz EcoRI — Stop-Codon — Gen für Strep-tag — primender Bereich “hinterer” Bereich des GFP Gens -3’

• RNA-Virus

• RNA wird isoliert und in DNA umgewandelt = reverse Transkription

• Nachweis mittels PCR

  • nested PCR

    • erst normale PCR und anschließend erneute PCR mit weiter innen liegenden Primern

  • real time PCR

    • Fluoreszenz gibt einen Hinweis auf die Menge des Ausgangsmaterials

    • hoher Virustiter führt zu gut detektierbarem Signal nach weniger PCR Zyklen als ein niedriger Titer

gezieltes testen auf mutierte Abschnitte

mit spezifischen Primern

z.B. SLiCE (Seemless Ligation Cloning Extract)

• Einfügen von Inserts über Homologieregionen, welche identisch in Vektor und Insert sind

• Vektor muss linear/ offen vorliegen

• Reaktion erfolgt mithilfe von E. coli-Extrakt

• gleichzeitiges Klonieren von mehreren Fragmenten ist möglich

• Homologieregion sollte ca. 36 nt lang sein

• Methode für die definierte Veränderung in doppelsträngiger Plasmid-DNA

• es sind möglich:

  • Substitution

    • Veränderung von Basen/Basenpaaren)

  • Insertion

    • Einfügen von Basen/Basenpaaren

  • Deletion

    • Entfernen von Basen/Basenpaaren

• Einfügen erfolgt über entsprechende Primer in einer PCR-Reaktion

• zur Befreiung verwendet man DpnI

  —> spaltet nur methylierte DNA

• Ziel: Ursprungsvektor loswerden

reprimierter Zustand

• lac-Repressor bindet an die Lac Operator Site

• Blockierung der RNA-Polymerase

  -> keine Transkription

induzierter Zustand

• über Zugabe von Induktor (IPTG (zur Kontrolle der Proteininduktion) oder Laktose)

  • IPTG = Zucker-Derivat, das besonders fest an den lac-Repressor bindet

• bindet an den lac-Repressor

  -> Konformationsänderung

• lac-Repressor kann nicht mehr binden und RNA-Polymerase ist nicht mehr blockiert

  —>Transkription findet statt

Hefeexpressionsvektoren

• induzierbare Promotoren

• Resistenzselektion häufig über Magelmutanten

• konstitutive Promotoren oder induzierbare Promotoren

• Resistenzselektion meist über Antibiotikaresistenz

• Baculoviren infizieren Insektenzellen

• für die rekombinante Expression wird das Gen für Polyhedrin mit dem GOI ausgetauscht

• HeLa

• HEK-293

• CHO

• Verwendung von Zelllysat aus:

  • Bakterien: Expression mit E.coli-Extrakten

  • Säugerzellen: Expression mit Reticulozytenlysat

  • Pflanzenzellen: Expression mit Weizenkeimextrakten

Transformation

• nicht virale Übertragung freier DNA in E.coli, Hefe,Pilze, Pflanzenzellen

• bei Säugerzellen Entartung einer gesunden Zelle zur Tumorzelle

Transduktion

• virale Übertragung von DNA

Transfektion

• nicht virale Übertragung freier DNA in Säugerzellen

trockene Hitze:

• Glaspipetten

• Glasgeräte

• Reagenzgläser

Autoklavieren:

• Medien für E.Coli

• Einweg-Pipettenspitzen

• fester Laborabfall, verunreinigt mit GVOs

Filtrieren:

• Medien für Säugerzellen

Abflammen:

• Impföse

Batch-Kultur

• lag-Phase->log-Phase->stationäre Phase->Absterbephase

  
  

• Induktion der Expression in der log-Phase

• dient zur Verlängerung der Phase der Produktionsbildung. Es wird frisches Medium dazugegeben -> Volumen nimmt zu

• Monitoring offline (einfacher, aber zeitverzögert) oder online

Beides kontinuierliche Kultur

• scale-up schwierig aus physikalischen Gründen

• Schritte der Maßstabsvergrößerung:

  • Erlenmeyerkolben->Pilotanlage->Produktionsfermentor

• Animpfen aus Vorkultur/en

• Airliftreaktor für empfindliche Zellen

• Rührwerksreaktor für unemfindliche Zellen

• Submers-Verfahren wird dem Oberflächen-Verfahren vorgezogen

• Cellulose: beta-1,4-Glucose mit Cellulase abbaubar

• Hemicellulose: verzweigter Zucker-Polymer

• Lignin: sehr heterogen, chemisch und enzymatisch schwer abbaubar, oxidative Spaltung durch Lactase und Peroxidase

• Cellusom= multi-Enzym-Komplex mit verschiedenen Cellulase-Enzymen auf der Zelloberfläche

  
  

Produkt sezerniert ins Medium:

• Vorteil: wenig bis keine Fremdproteine

• Nachteil: Produkt ist stark verdünnt -> großes Volumen

Produkt in der Zelle:

• Periplasma (oxidierende Verhältnisse)

  • Vorteil: geringer Anteil an Fremdproteinen

  • Nachteil: geringere Expressionsrate

• Cytoplasma (reduzierende Verhältnisse)

  • Vorteil: relativ hohe Produktkonzentration

  • Nachteil: hoher Anteil an Fremdproteinen

• Inclusion Body

  • Vorteil: Produkt relativ rein und in hoher Konzentration

  • Nachteil: Rückfaltung relativ schwierig bis unmöglich

• Präproinsulin

  -> Abspaltung der hydrophoben Signalsequence

• Proinsulin

  ->Ausbildung Disulfidbrücken

  ->Abspaltung C-Peptid

• reifes Insulin

• früher Produktion in zwei Stämmen (jeweils einer pro Kette), Produktion als Fusion an beta-Galactosidase

  ->Ausbildung falscher Disulfidbrücken (Problem)

• heute Produktion: Expression in E.coli oder Hefe, Produktion als Proinsulin

  ->C-Peptid bewirkt korrekte Ausbildung der Disulfidbrücken

• Sekundärmetabolite

• Bildung in der stationären Phase = Idiophase

• Proteinbiosynthese, Replikation, Zellmembran/Zellwand

• Penicillin:

  • beta-Lactam ->Wirkungsort Zellmembran/Zellwand

  • blockieren die Transpeptidase und verhindern Quervernetzung des Mureingerüstes

• Synthese

  • halbsynthetische Synthese

  • Penicillium chrysogenum mit Phenylessigsäure kultiviert

    -> Penicillin G

  • Acylase führt zur Abspaltung von Benzylgruppen

    -> 6-Aminopenicillansäure

  • weitere Modifikationen erfolgen chemisch

• Efflux-Pumpen

• verminderte Aufnahme

• Inaktivierung Antibiotikum über Enzyme

• Mutation der Zielstruktur

• mobile genetische Elemente

• Antibiotika-Spaltung durch Enzym beta-Lactamase und Mutation der Zielstruktur (Transpeptidase)

  
  

• neue oder modifizierte Antibiotika

• Reserve-Antibiotika

• Substanzen, die Resistenzen überwinden

  • Clavulansäure

  • Olivansäure

    => Inhibieren beta-Lactamase (binden irreversibel)

• einzellige Organismen

  • Algen,Bakterien, Hefe, Pilze

• Lieferant von Protein

• Gerste, Hopfen, Wasser und Hefe

1. Malzen

   • Bildung von Stärke- und Protein-abbauenden Enzymen (Amylasen und Proteasen)

2. Darren

   • Abtöten der Keime

3. Maischen

   • Amylasen und Proteasen bauen Stärke und Proteine ab

4. Läutern

   • Gewinnung der klaren Würze und Abtrennen des Trebers

5. Zugabe von Hopfen

   • wirkt als Antiseptikum

6. Würze Kochen

   • Inaktivierung der Enzyme

7. Fermentierung/Gärung

   • Hefe setzt Zucker zu Alkohol um

8. Reifen

   • Geschmacksverbesserung

9. Filtration/Pasteurisierung

   • zur verbesserten Haltbarkeit

Bierherstellung ist ein anaerober Prozess.

Es ist ein ineffektiver Prozess (Erzeugung von 2 mol ATP pro mol Glucose

Im Gegensatz dazu:

aerob Prozess: Erzeugung von 38 mol ATP pro mol Glucose).

• Ausgangsprodukt reich an Zucker

  —> Schritte vor der Gärung einfacher

• Weißwein

  • Filtration nach der Fermentation

  • Mostgärung

• Rotwein

  • Filtration vor der Fermentation

  • Maischegärung

• gram+ Bakterien, auch genannt Lactobacillales

• fakultativ anaerob, können Sauerstoff tolerieren, keine Endosporenbildung, morphologisch sehr unterschiedlich

• bauen Kolenhydrate ab und bilden bevorzugt Lactat

• Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus

• Hefe Saccharomyces

• Penicillium

• Ethanol -> Acetaldehyd -> Essigsäure

• aerober Prozes und ist keine Gärung

• Acetobacter und Gluconobacter

• Stärke vom Reis wird durch Aspergillus gespalten

  -> Zucker wird gebildet

• Zucker wird durch Saccharomyces umgesetzt

  -> Ethanol

• ähnelt dem Prozess der Bierherstellung

  (stärkehaltiges Asugangsprodukt)