Fragen Teil II

• Knock-Out

  • -> funktionierendes Gen gegen ein defektes austauschen

• CRISPR/Cas

  • Ziel DNA zerschneiden

• durch Transfektion

  • Transfektion ist der Prozess des Einbringens von Nukleinsäuren in eukaryotische Zellen. Zellen können zur Integration von DNA in ihr Genom stabil transfiziert oder zur temporären Proteinexpression transient transfiziert werden.

• ist eine Möglichkeit der Säugerzellen sich effektiv gegen eine Virusinfektion zu wehren

• die RNA-Interferenz ist eine postranskriptionelle Down-Regulation der Proteinexpression

• die RNA-Interferenz benötigt siRNAs.

• dicer schneidet die dsRNA in kleine Fragmente —> siRNAs

• die siRNA bindet RISC

• die mRNA (viral) wird durch RISC abgebaut

• CRISPR = clustered regularly interspaced short palindromic repeats

• in Teil des Erbguts von Mikroorganismen und ist eine „Bau-Anleitung“ für kurze RNA- Einzelstrang-Moleküle („Leit-Molekül“, „CRISPR RNA“, „crRNA“), die wiederum eine Genschere an eine bestimmte Stelle des Erbguts dirigieren

• aus crRNA und tracrRNA Hybrid

• Als Transduktion bezeichnet man die Übertragung von DNA-Fragmenten zwischen zwei Bakterien, die durch eine Infektion mit Bakteriophagen vermittelt wird.

• die Aufnahme einer Phagen-DNA in ein Bakterium.

• DNA Polymerase und

• reverse Transkriptase

• gesteigerte Sensitivität und Spezifität

  • um 2-3 Zehnerpotenzen gesteigert

• da die nested PCR nur das Produkt der ersten Amplifikation als Matrize dienen kann

• auch geringste Spuren einer DNA können mit dieser Methode nachgewiesen und diagnostischen Zwecken zugänglich gemacht werden

• Zyklus, an dem die Fluoreszenz erstmalig signifikant über die Hintergrundfluoreszenz ansteigt

• —> Hintergrundrauschen wird durchbrochen/überschritten

• Bakteriophagen als Klonierungsvektor, da bei Plasmiden ab Fremd-DNA größer als 10 kB Umlagerungen entstehen und die Fremd-DNA ausgeschlossen werden würde

  • —> In Bakteriophagen kann man größere Fremd-DNA Stücke einschleusen

• Plasmide —> als Klonierungsvektor —> können nur eine begrenzte Menge an Fremd-DNA aufnehmen

• DNA-Fragmente, die größer als 10 kB sind —> es entstehen Umlagerungen im Plasmid, die zum Ausschluss der Fremd-DNA führen

• In Bakteriophagen kann man größere Fremd-DNA einschleusen —> Bakteriophage lambda = Genomgröße 45 kB, pUC 8 dagegen nur 2,7 kB

  
  

• Bakteriophagen sind Viren, die ausschließlich Bakterien infizieren

  • Sie können sich nicht auf tierischen und menschlichen Zellen vermehren —> für den Menschen ungefährlich

• hochspezifisch gegen Bakterienstamm; hohe Bakterienspezifität

• viele Phagen verfügbar, sind günstiger als Antibiotika

• keine Nebenwirkungen

• Tranduktion mit einem lytischen Phagen führt zu einer intrabakteriellen Synthese neuer Phagenpartikel mit anschließender Lyse des Bakteriums

• Transduktion mit einem lysogenen Phagen führt zur Integration der Phagen-DNA in die Bakterien-DNA

  • Im integrierten Zustand wird das Phagengenom als Prophage (temperenter Phage) bezeichnet

  • durch exogene Faktoren oder auch spontan kann der Prophage wieder zur vegetativen Form werden und neue Phagen produzieren und schließlich die Wirtszelle zum platzen bringen

• SDS —> SDS (Natriumdodecylsulfat), einem anionischen Tensid (Detergens), wird das Protein negativ geladen

  • negative Ladungen des SDS führen zu einer gegenseitigen Abstoßung, was zusam- men mit der Denaturierung durch Aufkochen zu einer Linearisierung der zuvor gefalteten Proteine führt

• Erhitzen —> um Sekundär- und Tertiärstrukturen durch das Unterbrechen von Wasserstoffbrücken und das Strecken der Moleküle aufzubrechen

• DTT —> Optional können Disulfidbrücken durch Reduktion gespalten werden. Dazu werden reduzierende Thiole wie β-Mer- captoethanol (β-ME, 5 % Volumenanteil), Dithiothreitol (DTT, 10 Millimolar) dem Probenpuffer zugesetzt

• TEMED —> Katalysator

• Ammoniumoersulfat —> Radikalstarter

• beide dienen der Katalyse der Acrylamidpolymerisation

  • Die Polymerisation von Acrylamid zu Polyacrylamid wird durch eine Kettenreaktion hervorgerufen. Diese Reaktion kann z.B. von Ammoniumpersulfat (APS) als Radikal gestartet und von TEMED (Tetramethylethylendiamin) katalysiert werden. Es entsteht eine gelartige Matrix, das Polyacrylamid.

• -omab —> murine Antikörper (von der Maus): Endung -omab

• monoklonaler Antikörper ->Körper bildet selbst AK gegen AK!

• ELISA -> häufig AK aus der Maus -> HAMA Antwort

  • Der Begriff HAMA-Antwort ist die Abkürzung für Humane-Anti-Maus-Antikörper-Antwort

  • Es handelt sich dabei um die Reaktion, die das menschliche Immunsystem auf Maus-Antikörper aufbaut. Es gibt eine Kreuzreaktivität zu Antikörpern anderer Säugetiere.

  • Die HAMA-Antwort verstärkt sich bei zunehmender Therapielänge, so dass die Maus-Antikörper neutralisiert werden und die Therapie wirkungslos wird.

  • Durch die Entwicklung chimärer Antikörper oder humanisierter Antikörper oder auch die Herstellung rekombinanter Antikörper mit Hilfe von Phagen-Display-Bibliotheken (siehe auch Phagen-Display), die humane Immunglobulin-Gene enthalten, soll dieses Problem zukünftig umgangen werden.

• -> mehr Antigen Signal als Antikörper, falsch positives Signal

  • ->bindet an 2 Strukturen statt nur einer

  • Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit zwischen den Antikörpern verschiedener Spezies sind HAMA-haltige Seren eventuell auch in der Lage, Assays zu stören, in denen Antikörper aus anderen Spezies verwendet werden.

    
    

• Ist ein Selektionsmarker

• durch die auf dem Klonierungsvektor liegende Antiobiotikaresistenz wachsen nur die resistenten Bakterien auf der Agarplatte und die, die gegen das Antibiotikum sensitiv sind, nicht

  
  

• große kB können integriert werden

• ist gut erforscht

• der Aufbau des Genoms und auch die komplexe Regulation der Genexpression sehr genau bekannt sind. Die Infektion (Virusinfektion) des Wirtsbakteriums Escherichia coli führt entweder zur Produktion von Nachkommenphagen (ca. 100 infektiöse Partikel pro Zelle) und Lyse der Wirtszelle (lytische Infektion, Dauer: ca. 40–45 Minuten; Bakteriophagen II ) oder nach Integration der Phagen-DNA in das Bakterienchromosom ( Lambda-Phage ) zur simultanen Vermehrung des Prophagen mit der Wirtszelle

• Die detaillierten Kenntnisse über den Lambda-Phagen ermöglichten u.a. die gezielte Konstruktion von Mutantenphagen, die als Vektoren zur DNA-Klonierung, z.B. beim Aufbau einer Genbibliothek(Expressionsbibliothek), verwendet werden

• erster Schritt: zwei neue DNA-Stränge, die für den nächsten Zyklus als Vorlage dienen

  • diese haben eine variable Länge, aus diesen entsteht nach weiteren Zyklen das gewünschte DNA-Produkt in definierter Länge —> exponentielle Phase

• kürzere Stücke werden schneller repliziert -> am Ende mehr von den kurzen als von den langen Stücken

• die Fragmente werden im Verlauf bzw. nach den ersten Zyklen kürzer, da sich die Primer immer wieder an den selben Stellen anlagern -> dieser Abschnitt dient dann als Matrize für weitere Zyklen

• -> Die Polymerase produziert den Gegenstrang, indem sie die Primer 5'→3' (in Pfeilrichtung) verlängert. Die Produkte sind jeweils noch an einem Ende zu lang. Dies ist damit zu erklären, dass lediglich ein Startpunkt (Primer), nicht aber ein Endpunkt exakt festgelegt ist.

• Im nächsten Zyklus entstehen erstmals PCR Produkte in der richtigen Länge – allerdings sind die Gegenstränge jeweils noch zu lang.

• Im dritten Zyklus entsteht erstmals das PCR Produkt als Doppelstrang in der richtigen Länge (die anderen Produkte sind in H nicht dargestellt).

  
  

• -> die Primer umrahmen die DNA-Sequenz, die in der PCR vermehrt werden soll

  • daher sehr spezifisch

  • definieren die zu amplifizierenden Bereiche

• 2 Primer, einmal für 3’ und einer für 5’ Ende

• Primer —> Oligonukleotide, die komplementär zur Zielsequenz sind

• zwei kurze, künstlich hergestellte Primer (=Startersequenzen bestehend aus 15-30 DNA Basen), die passend (komplementär) an die Enden der zu vervielfältigenden DNA paaren können

• wenn die Oligonukleotide nicht bekannt sind, die die zu amplifizierende eingrenzen, kann eine PCR nicht durchgeführt werden

• —> nur ein bekannter DNA Abschnitt kann mit Primern gekennzeichnet werden und demnach amplifiziert werden

• außerdem:

  • lange DNA Sequenzen -> können nur über Klonierung amplifiziert werden

• zum Blau-Weiß-Screening —> Identifikation von bakteriellen Klonen, die ein Transgen enthalten

• Durch Aktivität des Operon kann nachgewiesen

• IPTG tut so als wäre es die Laktose

  -       Wenn IPTG Repressor bindet —> Konfirmationsänderung —> kann nicht binden

  -       Möglichkeit, das Gen zu exprimieren, Deletion eingebaut —> Stamm mit delta

  -       Der ß-gal fehlt ein Stück —> inaktiv

  o   Passiert im E. coli

  o   Zugabe über Transformation ein Plasmid, lac-Z‘ Gen —> schließt die Lücke, das Stück, das der ß-Gal fehlt, um aktiv zu sein —> blaues Produkt entsteht

• X-Gal —> keine Farbe, wenn mit ß-gal reagiert und da ist Galaktose in der Substanz —> entsteht blauer Farbstoff

• IPTG —> Strukturanalogon der Laktose —> IPTG bindet an Repressor —> dieser wird inaktiv, Polymerase kann an Operator binden Strukturgene werden abgelesen

• Länge -> Basen durchzählen, Bsp: 21 Basen -> 21 mer

• Temperatur: G/C = 4°C, A/T= 2°C

• -> Geeignetes Primer Paar wenn:

  • Temperatur um 60-64 °C

  • ausgewogenes GC/AT Verhältnis

  • 18-20 mer lange Primer

• Fragmentgröße berechnen-> Basen Primer 1 + alle Basen dazwischen + Basen Primer 2

• Indirekter ELISA

• (C) Viele physiologischen Vorgänge lassen sich nur in Primärzellen beobachten.

• (D) Primärzellen sind schwer zu transfizieren.

• Collagenase

• Pronase

• eine Zentrifugation mit Gegenstromprinzip

• eine Möglichkeit Zellen nach Größe und Dichte zu trennen

• ein Verfahren in dem Moleküle mittels Laser ionisiert werden.

• eine Methode, die zunehmend in der Mikrobiologie ausprobiert wird.

• ein Verfahren in dem die Flugzeit der ionisierten Teichen detektiert.

• dass ein Elektron sein Energieniveau verändert.

• dass ein Elektron den Atomverband verlässt.

• Antisense -> nur temporär

• Crispr-Cas

• Knock-Out

• Mutation kann durch den Promoter getriggert werden

• Kontrolle, ob das Gen für die Mutation vorhanden ist

• Yeast-two-hybrid

• Affinitätschromatographie

a) Antigen, das den IgG AK binden kann

b) entweder Antikörper oder Antigene binden an die Kugeln/Säulenmaterial (z. B. aus Agarose), dann geht man mit dem Analyt dadrüber, was bindet bleibt hängen, rest weggewaschen, dann eluiert

• Säule mit Polymerkügelchen -> an ein Fängerprotein gekoppelt

• Zielprotein wechselwirkt mit dem Fänger -> wird gebunden

• über Änderung pH Wert oder Ionenstärke -> Zielprotein von dem Fänger eluiert

• Zielprotein liegt in reiner Form in dem Eluat vor

• -> Isolierung und Identifizierung eines Proteins

  
  

• Knock-out

• Anti-Sense

• RNAi -> DICER/RISC

• Crispr-Cas

• SiRNA

• SDS

• Elektrophorese

• ELISA

• einige pysiologische Prozesse -> können nur hier nachgestellt bzw. nachvollzogen werden

• Proteine bleiben ursprünglich -> posttranslationale Modifikation

  
  

• ca2+-Phosphat-Präzipitation

• Elektroporation

• Gun-Shoot

• Lipofektion

• Sonoporation

• Quetschen von Zellen

• Strukturanalyse kleinerer Moleküle (bis 100 kD)

• Die Kernresonanzspektroskopie ist eine spektroskopische Methode, die durch Untersuchung der elektronischen Umgebung von Atomen, einen Aufschluss über benachbarte Atome und Atomgruppen innerhalb einer Verbindung gibt und somit eine räumliche Darstellung der Struktur erlaubt.

• Vorteil ist, dass man hier keine Kristalle benötigt

• kleines Volumen einer gereinigten und konzentrierten Proteinlösung wird in ein starkes Magnetfeld eingebracht

  • Atomkerne, ins besondere der Wasserstoff besitzen ein magnetisches Moment (Spin)

  • Der Spin richtet sich in einem starken magnetischen Feld parallel zu diesem aus. Durch Einstrahlung von Pulsen elektromagnetischer Strahlung Radiofrequenzbereich (RF) lässt sich die Ausrichtung des Spins stören und wird in einen angeregten Zustand versetzt. Wenn angeregte Wasserstoffkerne in den Grundzustand zurückkehren und sich wieder ausrichten emitteren sie die RF-Strahlung. Die Frequenz und Intensität der Emission hängt von der Umgebung jedes einzelnen Wasserstoffkerns ab. Ist ein Kern angeregt, beeinflusst er die Absorption und Emission der Strahlung benachbarter Kerne.

• Proteine bis 100 kD untersuchen und auch solche analysieren die sich einer Kristallisation verweigern

• Überdies kann man Informationen zur Faltung von Proteinen und Änderungen bei Bindungen mit anderen Molekülen (Dynamik) erhalten

• Mit entsprechenden Alignmentprogramen (BLAST, FASTA, ClustalW) kann man nun nach Homologien zu anderen Proteinen suchen und das Protein in eine Familie einsortieren

• Strukturanalyse kleinere Moleküle bis 100 kD

• Proteine bis 100 kD untersuchen und auch solche analysieren die sich einer Kristallisation verweigern

• Und Analyse der Proteine, die sich einer Kristallation verweigern

  • Vorteil: keine Kristalle benötigt

  • Überdies kann man Informationen zur Faltung von Proteinen und Änderungen bei Bindungen mit anderen Molekülen (Dynamik) erhalten

• Ein kleines Volumen einer gereinigten und konzentrierten Proteinlösung wird in ein starkes Magnetfeld eingebracht

• Epitopmarkierung

• Fusionsprotein z. B. GFP-Protein

• live-cell-imaging mit FRET

• Ultrazentrifuge

  • Zellkern + Zellplasma trennen

• zu viele dNTP -> PCR inhibieren

  • außerdem: c beeinflusst c von freiem Magnesium -> MG c muss ebenfalls erhöht werden, sonst kann die Polymerase nicht arbeiten.

• dNTP degradiert -> macht die Taq-Polymerase arbeitslos, kann das neue Polynukleotid nicht synthetisieren

• falsche MgCl c?

  • sie sind wichtiger Cofaktor der DNA-Polymerase,

  • bilden lösliche Komplexe mit den dNTPs und

  • wirken sowohl auf die spezifische als auch die unspezifische Anlagerung des Primers an die Template-DNA stabilisierend.

  • -> die drei Punktewürden beeinträchtigt werden

• Inhibitoren im Versuchsansatz?

  • inhibiert die Enzymreaktion

• Zu viel Polymerase?

  • Unspezifisch synthetisierte DNA-Stücke unterschiedlicher Größen laufen genau da, wo das man das gesuchte Fragment vermutet und verdecken es gnadenlos

• Insert -> wird in Vektor eingebaut

• Dann Restriktion

• Dann Ligation

• Dann Vektor + Insert

• Proben müssen denaturiert und ggfls. müssen die Disulfidbrücken mit DTT/ß-Mercaptoethanol reduziert werden

  • -> die Proteine durch SDS -> negative Ladung

• Um die Proben hinsichtlich der Größe vergleichbar zu machen muss ein Standard bzw. eine Leiter mit bekannten Proteingrößen aufgetragen werden

• nach Proteingröße

• alle Proteine laufen zum Pluspol, da durch SDS negativ geladen

• kleine Proteine laufen schneller zum Pluspol als große

• hepatische Sternzellen

• Myofibroblasten

• Kupffer-Zellen

• Lebermakrophagen

• Hepatozyten

• Transforming Growth Factor-Beta (TGF-beta) -> eines der wichtigsten bekannten Zytokine in der Genese von fibrotischen Organveränderungen -> kann an Rezeptoren andocken

• im Wesentlichen von den nicht-parenchymatösen Zellen der Leber, HSC, Kupffer-Zellen und wahrscheinlich auch Endothelzellen, als großer latenter TGF-beta-Komplex exprimiert

• Es initiiert u. a. die Aktivierung von HSC der Leber und somit deren Aktivierung zu MFB, die die hauptsächlichen Produzenten von Komponenten der extrazellulären Matrix (synthetisieren Kollagen) sind.

• Pronase

• Collagenase

• man kann in primären Zellen die physiologischen Prozesse nachstellen

• Gegenüber permanenten Zelllinien, die etabliert und immortalisiert sind, haben Primärzellen den Vorteil, dass sie wesentlich besser das in vivo-Verhalten der Zellen widerspiegeln

• am wenigsten veränderte Zellen

• Analysen generationsübergreifender Effekte

• Feststellung von Differenzierungsvorgängen

• behalten in-vitro meist ihre Eigenschaften und Charakteristika

• Verwendung für Genanalysen auf Expressionsebene

• besseres Verständnis für zelluläre Antworten in physiologischem Zusammenhang

• Transfektion

• Transduktion: Übertragung von DNA von einem Bakterium auf ein anderes oder auf eine eukaryotische Zelle durch Phagen

• Konjugtion bei einzelnen Protisten

Zu den Mechanismen des Genaustauschs zählen:

• Transformation: Aufnahme von freier, „nackter“ DNA durch einen Prokaryoten

• Transfektion: Aufnahme von freier, „nackter“ DNA (oder RNA) durch eine eukaryotische Zelle

• Transduktion: Übertragung von DNA von einem Bakterium auf ein anderes oder auf eine eukaryotische Zelle durch Phagen

• Konjugation: Übertragung von DNA durch direkten Zell-Zell-Kontakt über eine Zytoplasmabrücke

• Lebersinusoiden -> Leberzellen

• sticky Ends -> Überhang

• wenig Genprodukt wird hergestellt, da

  • es fehlt der prokaryotische Promoter

  • passende Terminationssequenz fehlt

    • Die prokaryotischen Gene enthalten hingegen keine Introns. Prokaryoten besitzen deshalb keine Enzymausstattung zum Prozessieren und können daher eukaryotische Gene nicht exprimieren.

  • Shine-Dalgarno-Sequenz im 5’UTR

• Aufreinigung der Proteine ist schwierig und kostenintensiv

• In Bakterien versuchen, eukaryotische Proteine zu exprimieren, Probleme bei Proteinfaltung:

  • Keine posttranslationale Modifikation

  • Acetylierung, Glykosylierung usw.