Skript 1

—> eine komplementäre Sequenz zum vorgegebenen DNA-Abschnitt entsteht

das neue Polynukleotid wird immer in 5’-3’-Richtung synthetisiert

damit DNA-Synthese starten kann = wird kurzer doppelsträngiger Abschnitt benötigt —> PRIMER (in vivo und in vitro)

katalysiert nukleophilen Angriff auf 3’OH-Gruppe im DN-Strang auf Phosphor Atom im einzubauenden Desoxynukleotidphosphat —> mit Hydroxyl-Gruppe am C-5 der Desoxyribose des dNTP verestert

Hat eine Proofreading Aktivität

DNA-Replikation —> kopiert DNA in vivo

• Prinzip:

• 1. DNA Matrize -> Topoisomerase -> Entspiralisierung

• 2. Helicase -> öffnet Doppelstrang

• 3. Elongation

  • Synthese der Primer an den DNA-Einzelsträngen-> Enzym Primase am 3'-Ende angelagert

  • Anlagerung DNA-Polymerase an Primer -> Das Enzym lagert sich an die Primer an und verknüpft die komplementären Basen mit dem DNA-Strang in 5'-3'-Richtung

• Elongation des Leitstrangs

  • DNA-Polymerase wandert an Tochtersträngen vom 5'-Ende zum 3'-Ende

  • Am Leitstrang bewegt sie sich also in die gleiche Richtung wie das Enzym Helikase -> Synthese Leitstrang -> kontinuierlich!

  Elongation des Folgestrangs

  Ergänzen des Folgestrangs -> Besonderheit -> DNA-Strang ist hier im Vergleich zum kontinuierlichen Strang genau entgegengesetzt (antiparallel) aufgebaut

  antiparallelen Aufbau -> ein Strang der Replikationsgabel verläuft vom 5'- zum 3'-Ende

  Der entgegengesetzte, komplementäre Strang ist antiparallel, da er vom 3'-Ende zum 5'-Ende verläuft.

  Am antiparallelen Strang wandert die DNA-Polymerase in die entgegengesetzte Richtung der Helikase -> DNA-Polymerase nur von 5' nach 3' wandern und die komplementären Basen verknüpfen kann

• Die DNA-Synthese erfolgt also diskontinuierlichund es entstehen immer nur kurze Abschnitte, in der die DNA synthetisiert werden kann

  Sobald ein ausreichend langer Abschnitt des Doppelstrangs durch die Helikase getrennt wurde, ergänzt ihn die DNA-Polymerase durch Okazaki-Fragmente bis zum nächsten, bereits ergänzten Abschnitt oder zum 5'-Ende.

• DNA-Ligase verknüpft unter Energieverbrauch die Okazaki-Fragmente miteinander und bildet so einen Doppelstrang

• Außerdem entfernt das Enzym RNase H die Primer aus den DNA-Einzelsträngen.

  
  

PCR —> in vitro, tausende von Kopien eines DNA Abschnitts herstellen

1. DNA Replikation -> DNA -> Transkriptiption -> RNA -> RNA Replikation -> Translation -> Protein

2. Zwischen DNA und RNA -> Reverse Transkription!

bauen DNA aber auch ab —> Nuclease-Aktivität

Synthese -> immer 5’3’-Richtung

Exonuclease Aktivität kann in beide Richtungen erfolgen

häufige 3’-5’-Exonucleaseaktivität -> proofreading activity

• vom 3’-Ende des neu synthetisierten Strangs werden falsch eingebaute Nukeotide entfernen

Seltener 5’-3’-Exonuklease-Aktivität

nach Restriktionsverdau können die Fragmente mittels Agarose-Gelektrophorese aufgetrennt und ihre Länge mittels eines mitgeführten Stanbdards bestimmt werden

Fragmente können aus dem Agarosegel ausgeschnitten, gereinigt und weiterverarbeitet werden

DNA Replikation kopiert DNA in vivo

In vitro -> tausende Koien eines DNA Strangs mit PCR!

bauen DNA-Moleküle ab, indem sie die Phodphodiesterbindung zwischen den Nukleotiden spalten

wird bei vielen DNA-Rekombinationstechniken verwendet, z. B. bei Klonieren —> Endo- und Exonucleasen

• Endonuklease:

  • spalten Nulkeotide mitten im Strang ab

• Exonuklease:

  • entfernt Nukleotide vom Ende des DNA oder RNA Strangs

Können spezifisch für DNA oder RNA sein

manche Nuclease schneiden einzel-, manche nur doppelsträngige DNA

• —> Restriktionsenzyme

• schneiden an definierten Stellen den Matrizenstrang

• -> blunt und sticky ends; 3’ oder 5’ Überhang

schneiden an definierten Stellen den Matrizenstrang

—> dabei bleiben nach dem Schnitt einer doppelsträngigen DNA

• glatte Enden —> blunt ends. oder

• sticky ends —> kohäsive oder klebrige Enden

  übrig

Palindromische Sequenzen, reproduzierte Schnittsequenzen, 3 3er in der Regel, also 6 Nukleotide

Es kann zu einem 5’ (Sau3Al) oder einem 3’ Überhang (Pstl) kommen

RE Typ II —> schneiden zuverlässig an derselben Erkennungssequenz

• nach Restriktionsverdau reproduzierbare Schnitt-Sequenzen vorliegen

Erkennungssequenz = meist Hexanukleotide, manchmal länger manchmal kürzer…

Bei Klonierung

• manche Restriktionsenzyme haben unterschiedliche Erkennungssequenzen, aber erzeugen gleiche sticky Ends

Vorteil von Sticky Ends: Insert (Plasmid) kann gerichtet in den Vektor gebracht werden, Vektor = Teekesselchen -> ist auch immer ein Ding, was genetisches Material transferieren kann

Andere Art genetisches Material zu übertragen:

• Bakteriophagen, Mücken -> auch Vektoren, haben aber damit nicht wirklich was zu tun

Vektor wird mit dem Restriktionsenzym bearbeitet, Insert ebenfalls, wird ligiert -> Vektor mit Insert

Vektor = Plasmide, nichts artifizielles, kennen wir aus der MiBi at its best, viele Bakterien erreichen über Plasmide Eigenschaften, die sie vorher nicht besessen haben

Plasmide sind interessant, da wir 2 Dinge damit tun können

• Normalerweise vermehren sich Plasmide in den Bakterien autonom, in dem lebenden E. coli -> Amplifikation, DNA kann in vivo vermehrt werden

Es kann aber auch eine Expression verursacht werden

Deswegen inseriert man Inserts in einen Vektor

Natürlicher Umgang mit den Plasmiden wird hier ausgenutzt

Wir haben einen natürlichen Vorgang adaptiert und nutzen ihn als Tool

macht es auch alles falsch, wenn es sehr spezifisch sein soll -> funktioniert es oft nicht

-> wenn es aber präzise ist, ist es nicht multifunktionell

z. B. DNA Ligase -> Enzym aus Bakteriophage T4, T4 DNA Ligase = kann beides ligieren, blunt und sticky ends -> multiple einsetzbar

X-Ga l-> Verbindung aus Zucker und Nukleotid

Klonieren in 4 Schritten:

• Restriktion

• Ligation

• Transformation

• Selektion

Operon, erlaubt Bakterien Lactose zu verstoffwechseln

Promotor -> exprimiert einen Expressor, Repressor setzt sich an den Operator, Polymerase kann zwar binden, aber nicht DNA lang rutschen, Bakterium will Glucose, und nicht Lactose haben, wenn Lactose in der Petri Schale ist -> Konfirmationswechsel, Repressor kann Opertor nicht mehr binden etc.

ß-Galactosidase -> Teil lac-Z-Gen (das ist wichtig)

-       X-Gal -> keine Farbe, wenn mit ß-gal reagiert und da ist Galaktose in der Substanz -> entsteht blauer Farbstoff

-       Wenn natürlicher E. coli vorhanden ist, dann würde ß-Gal exprimiert werden und würde diesen abdauen

-       Substratinduzierte Genexpression!

-       Klonierungs E. colis -> lac-Z-Gen -> E. coli ist deletiert, spezieller E. coli Stamm -> sonst würde ß-Gal X-gal in ein blaues Produkt splitten

• Dreieck -> im lacZ-> heißt Deletion -> in dem Stamm wurde das Gen deletiert

In der Plasmidkarte -> genaue Angabe der Restriktionsenzyme, die die genaue Stelle schneiden

• Schnittstelle darf nur 1x vorkommen! Nur 1 Site! Ganz wichtig!

Wenn alles gut läuft, hat man das Insert dann im Vektor -> Screenen

Wenn das Insert drin ist, dann kann diese Reaktion nicht mehr stattfinden und wir haben farblose Kolonien

Wenn das Insert nicht drin ist -> ß-Gal integer-> blaue Kolonien

3 Möglichkeiten

• Kein Plasmid -> ß-Gal Platte + Ampicillin -> ohne Plasmid -> Bakterium nicht resistent

• Ohne Insert -> wird blau

• Mit Insert -> wird weiß, rekombinant

Mit sterilem Holzstäbchen -> Kolonie picken und weiterarbeiten

Repressor kann Operator binden -> stört Polymerase -> Lac-Z kann nicht abgelesen werden

IPTG tut so als wäre es die Laktose

Wenn IPTG an Repressor bindet -> Konfirmationsänderung -> Repressor kann nicht mehr binden

Möglichkeit, das Gen zu exprimieren, Deletion eingebaut -> Stamm mit delta

Der ß-gal fehlt ein Stück -> inaktiv

Passiert im E. coli

Zugabe über Transformation -> Bakterium kriegt lac-Z‘ Gen -> schließt die Lücke, das Stück, das der ß-Gal fehlt, um aktiv zu sein -> blaues Produkt entsteht

IPTG wird nicht abgebaut, Hilfmittel

Welche Kolonien können auf dem Agar wachsen?

• nur die, die transformiert worden sind -> brauchen die Amp Resistenz aus dem Plasmid

Welche Kolonien sind blau?

• die, die das Insert nicht tragen / die, ohne Insert

Welche Kolonien sind weiß?

• die, die das Insert tragen

hat 2 Resistenzen

spalten in multiple Cloning Site (= poly-linker), sitzt in der Tetracyclin Resistenz

-> Durch Schneiden in der Tet Resistenz -> Gen nicht mehr funktionsfähig, Bakterium wird sensibel gegen Tet

DNA-Ligase -> unspezifisch, wirkt überall

Normales Plasmid -> bis 10 kb, z. B. pUC8

Lamda Austausch -> bis 18 kb, z. B. Entfernen von Lamda Genen

Cosmid, Fosmid -> bis 40 kb, z. B. ein Plasmid mit Lambda-cos-Stellen

• Cosmide -> Cos-Sites mit lamda-Cos-Stellen

• Fosmide -> F-pili

Bakteriophage P1-Vektor -> bis 125 kb, z. B. den lamda Vektoren ähnlich, aber mit P1 Genomgröße

BAC, PAC (künstliche Bakterienchromosomen) -> bis 300 kb

YAC (künstliche Hefechromosomen ->bis 600 kb, mega YAC bis 1.400 kb

Plasmid brauch immer ein ORI, Resistenz, Cloning Site, Cos Site

Plasmid offen, Fremd DNA wurde geschnitten, sticky ends

Verpacken das in einen Phagen, nehmen den Phagen -> auf eine E. coli Kolonie

Bakterienrasen, nur E. coli, der das Fremdmaterial aufgenommen hat, kann auf der Platte wachsen -> Tetracyclin

Vorsicht: wenn sich der E. coli teilt, repliziert er bakterielles Chromosom, verteilt das replizierte Chromosom auf beide Tochterzellen, wenn da ein riesen Stück Fremd DNA drin ist -> längere Teilungszeit bis eine große Kolonie da ist

Ein Cosmid enthält einen Replikationsursprung (ori) für die Vermehrung als Plasmid und eine cos-Stelle, die für die Verpackung der DNA in 2 Phagenpartikel erforderlich ist

Einzigartige Restriktionsstellen und Antibiotikaresistenzelemente erleichtern das Klonen und die Selektion

Einfügen eines großen fremden DNA-Fragment in das Cosmid schließt die bakterielle Transformation aus, aber wenn das rekombinante DNA-Molekül eine geeignete Größe hat, kann es in vitro in Phagenpartikel verpackt werden

Die Phagenpartikel werden dann verwendet, um das Cosmid in Bakterienzellen einzuführen, wo es als Plasmid vermehrt wird

Plasmid brauch immer ein ORI, Resistenz, Cloning Site, Cos Site

• Plasmid offen, Fremd DNA wurde geschnitten, sticky ends

• verpacken das in einen Phagen, nehmen den Phagen -> auf eine E. coli Kolonie

• Bakterienrasen, nur E. coli, der das Fremdmaterial aufgenommen hat, kann auf der Platte wachsen -> Tetracyclin

Vorsicht: wenn sich der E. coli teilt, repliziert er bakterielles Chromosom, verteilt das replizierte Chromosom auf beide Tochterzellen, wenn da ein riesen Stück Fremd DNA drin ist -> längere Teilungszeit bis eine große Kolonie da ist

Plasmide sind zirkuläre genetische Elemente, die sich autonom replizieren

sie existieren extrachromosomal

viele Plasmide können während des Konjugationsprozesses der Bakterien von Zelle zu Zelle transferiert werden

einige Plasmide haben die Fähigkeit sich in das Chromosom zu integrieren

• unter diesen Umständen wird die Replikation durch das Chromosom kontrolliert

Plasmide sind für die Zellen nciht notwendig, können den Bakterien aber zu einem Vorteil verhelfen, z. B.:

• Antiobiotika-Resistenzen

• Kontrolle der Produktion von Toxinen

• Kontrolle des Prozesses der Konjugation

• Produktion Hämolysine usw.

Plasmid-Phagen-Hybrid

umfassende Datenbank aller bekannten Restriktionsenzyme

einschließlich Verfügbarkeit durch alle kommerzeiellen Hersteller

Typ I:

• Schnitt an zufälliger Stelle weit von der Erkennungssequenz, benötigt ATP, transferiert eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin

Typ II: -> ist gut!

• schneidet die DNA innerhalb oder in unmittelbarer Nähe der Erkennungssequenz

• benötigt KEIN ATP und hat keine Methyltransferase Aktivität

Typ III: -> benötigt keine DNA

• schneidet die DNA in etwa 20-25 Basenpaare von der Erkennungssequenz entfernt

• benötigt ATP und transferiert eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin

Typ IV: -> Epigenetik

• schneidet nur methylierte/hydroxymethylierte/glucosyl-hydroxymethylierte-DNA

  • im Gegensatz zu den Typen 1-3, die durch Methylierungsmuster gehemmt werden

DNA-Polymerase 1 und 3

Ligase

Vorlage: DNA

Produkt: DNA

Funkion: Replikation

Vorlage: RNA

Produkt: DNA

Funkion: Reverse Transkription

—> von RNA zu DNA !

Vorlage: DNA

Produkt: RNA

Funkion: Transkription

-> Normal

Vorlage: RNA

Produkt: RNA

Funkion: Replikation mancher Viren

unabhängige RNA-Polymerasen —> RNA

unabhängige DNA-Polymerase —> DNA

Vorlage: DNA

Produkt: DNA

Funkion: Replikation

Taq

• hitzebeständig, hohe Elongationsgeschwindigkeit

• fehlende proofreading aktivity

• Elongationsgeschwindigkeit: 1000 bp/min —> schneller !

• Optimum bei 72°C liegt und daher in die PCR eingesetzt werden kann

Pwo

• 5'-3'-Synthese, 5'-3' Exonuclease-Aktivität

Pfu

• 5'-3'-Synthese, 3'-5' Exonuclease-Aktivität, daher hohe Genauigkeit

• Elongationsgeschwindigkeit: 500 bp/min —> langsamer, aber genauer!

Reverse Transkriptase

• aus Retroviren

Neben einer freien 3'-OH-Gruppe benötigen die DNA-Polymerasen Nukleotide in Form von Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTPs) aller vier Basen zugegeben werden (dATP, dTTP, dGTP und dCTP)

Puffer & Oxidan

DNA -> Matrize

Primer

Taqman ?

Beim Einsatz von Polymerasen im Labor ist darauf zu achten, ob die gewählte Polymerase eine proofreading Aktivität hat. Verlangt das Design des Experimentes eine maximale Sequenzgenauigkeit muss die ver-wendete Polymerase eine 3'-5'-Exonuclease-Aktivität aufweisen.

• z. B. Pfu-Polymerase

die Sequenz der flankierenden Bereiche des zu amplifizierenden DNA-Fragments müssen bekannt sein

Fragmentlänge -> nicht länger als 5 kb, sonst Modifikation notwendig

• brauchen Spezialpolymerase

funktioniert mit kleinsten Mengen DNA

Temperaturoptimum bei 37°C

Daher werden bei dieser Temperatur Sequenzier-PCR, in-vitro Transkriptionen u. ä. Experimente durchgeführt

Die PCR’s werden zum Schluss mit einer Erhöhung auf 75°C beendet

Plasmide werden in bakteriellen Wirtszellen effizient repliziert, weil jedes Plasmid einen Replikationsursprung hat -> ori = Origin of replication

Das Plasmid wird mithilfe der Replikationsmaschinerie der Wirtszelle vermehrt inklusive der fremden Gene sie durch die Klonierung eingebaut wurden

Ein bekannter Klonierungsvektor -> Klonierungs Plasmid ist pUC 8

pUC 8 enthält 2 Gene

• ein Gen -> Ampicillin Resistenz

• ein Bakterium welches ein pUC 8 Plasmid enthält produziert eine Beta Lactamase

• dadurch wird es gegen das Antibiotikum Appicillin resistent und wächst auf einer ampicillinhaltigen Agarplatte

normale E. coli ohne pUC 8 sind sensitiv und können in Gegenwart des Antibiotikums nicht wachsen

• das Amipicillin ist somit ein Selektionsmarker für pUC8

LacZ-Gen kodiert für die Beta Galactosidase

• Abbau von Laktose zu Glukose und Galaktose

• E coli Stämme die ein verändertes LacZ-Gen tragen, das nur den Alpha Peptidanteil der Beta Galactosidase codiert

• diese E coli sind auf das pUC8 Plasmid angewiesen welches das fehlende Segment (LacZ’) trägt und dieses mit dem alpha-Peptidanteil zu einem funktionstüchtigen Enzym ergänzt

Mittels Restriktionsenzymen werden die Insert-DNA und pUC 8 Vektor geschnitten

die Ligase verbindet die Plasmide mit dem Insert und die rekombinanten Plasmide werden durch Transformationen plus Calciumchlorid bei 42°C in E. coli eingeschleust

Die Plasmidkarte von pUC8 zeigt, dass in dem lacZ'-Gen ein „Polylinker" liegt, eine Stelle an dem Erkennungssequenzen verschiedener Restriktionsendonucleasen liegen

• Diese Restriktionsstellen kommen nur einmal im Plasmid vor

Die Ligation fremder DNA in eine dieser Stellen führt zu einer Inaktivierung des Gens und daher zum Verlust der beta-Galactosidase-Aktivität

• Das ermöglicht die Selektion zwischen einem rekombinanten und nicht-rekombinanten Plasmid

Die Identifizierung des korrekten rekombinanten Plasmids ist schwierig, da die Klonierung oft zu einer Vielzahl von Ligationsprodukten führt

• Darunter auch solche, die keine Fremd-DNA eingebaut haben

Durch den Nachweis, ob eine funktionell aktive beta-Galactosidase synthetisiert wird führt man wie folgt:

Die Verbindung X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indoyl-beta-D-galactopyranosid) wird von der beta-Galactosidase zu einem blauen Farbstoff umgesetzt

Werden dem Agar X-Gal und IPTG (Induktor für das Enzym, Isopro-pylthiogalactosid) und Ampicillin zugesetzt, färben sich nicht-rekombinante E. coli Kolonien blau

• denn sie synthetisieren beta-Galactosidase

Im Gegensatz dazu sind die rekombinanten mit dem unterbrochenen lacZ'-Gen weiß (= Lac-Selektion oder auch Blau-Weiß-Selektion)

Plasmide, die als Klonierungsvektoren dienen können nur eine begrenzte Menge an Fremd-DNA aufnehmen

Sind die DNA-Fragmente größer als 10 kB entstehen Umlagerungen im Plasmid, die zum Ausschluss der Fremd-DNA führen

In Bakteriophagen kann man größere Fremd-DNA Stücke einschleusen

• Der Bakteriophage Lamda beispielsweise hat eine Genomgröße von 48,5 kb (Vergleich: pUC8 hat 2,7 kb)

• 15 kb werden benötigt um den Phagen in die Wirts-DNA zu integrieren

• Diese können dem Bakteriophagen Lamda entnommen werden ohne seine Fähigkeit zu beeinträchtigen Bakterien über den lytischen Zyklus zu infizieren

Integration -> Att-Site, hier kann inserieren

o   Attachement Site des Bakteriums & des Phagen -> matchen

Weiterer Bakteriophage kann das Bakterium nicht inserieren

Weitere Infektion nicht mehr möglich

• Kann wieder ausgeschnitten werden

• Weg der Replikation am ORI

• Analog zum rolling circle

• Wenn F-Plasmid weg -> ein Teil bleibt da, F- und F+ Zelle

• Auf Phagen DNA -> Attachement Site, bak. Chromosom hat ebenfalls Attachement Site

  
  

Integration

• “Bak Site” -> attached mit dem weißen und dem Dreieck

• Anderer Teil -> attached dazwischen

Integration und Exzision Mechanismus

• kann nicht nur integriert, sondern auch exzidiert werden

• dann sieht es wieder aus wie auf dem ersten Bild

Viren, die Bakterien infizieren, werden als Bakteriophagen bezeichnet

Sie sind durch eine hohe Bakterienspezifität gekennzeichnet, die durch spezielle Rezeptoren auf der Bakterienoberfläche vermittelt werden

Früher hat man diese Phagenspezifität für die Typisierung von Bakterienstämmen und die Verfolgung von Infektionsketten genutzt

Die Aufnahme der Phagen-DNA wird als Transduktion bezeichnet und kann zwei Konsequenzen für das transduzierte Bakterium haben:

• 1. Die Transduktion mit einem lytischen Phagen führt zur intrabakteriellen Synthese neuer Phagenpartikel mit anschließender Lyse des Bakteriums

• 2. Die Transduktion mit einem lysogenen Phagen führt zur Integration der Phagen-DNA in die Bakterien-DNA

Im integrierten Zustand wir das Phagengenom als Prophage (temperenter Phage) bezeichnet

Durch exogene Faktoren oder auch spontan kann der Prophage wieder zur vegetativen Form werden und neue Phagen produzieren und schließlich die Wirtszelle zum Platzen bringen

Adsorption

Penetration

Uncoting

Assembly

Escape

Die Aufnahme der Phagen-DNA wird als Transduktion bezeichnet und kann zwei Konsequenzen für das transduzierte Bakterium haben:

• 1. Die Transduktion mit einem lytischen Phagen führt zur intrabakteriellen Synthese neuer Phagenpartikel mit anschließender Lyse des Bakteriums

• 2. Die Transduktion mit einem lysogenen Phagen führt zur Integration der Phagen-DNA in die Bakterien-DNA

 Der Phage λ ist ein temperenter Bakteriophage

Seine lineare Phagen-DNA wird nach der Infektion der Wirtszelle von der DNA-Ligase des Bakteriums zu einer zirkulären DNA geschlossen

Die zirkuläre DNA kann in das Bakterienchromosom integrieren

Die Integration der Phagen-DNA in das Wirtsgenom ist eine ortspezifische Rekombination und kann zu spezialisierter Transduktion führen

In diesem Zustand ist der Lambda-Phage ein Prophage und bleibt in das Wirtsgenom integriert ohne seine Gene zu exprimieren.

-> geringe Mengen DNA kopieren & anreichern

viele versch. Methoden

• Real-Time-PCR

• Muliplex-PCR

• Sequenzier-PCR

• NEsted-PCR usw.

3 Schritte

• Denaturierung bei 94-96°C

  • ist die Aufspaltung der soppelsträngigen DNA in ihre beide Einzelstränge

• Annealing -> Primer Anlagerung bei 58-64, max. 66 °C

  • ist der Vorgang, bei dem der Kopiervorgang starten kann

  • kurze komplementäre Oligonucleotide (Forward-Reverse-Primer), die das zu amplifizierende DNA Stück einrahmen, lagern sich an die DNA

• Elongation bei 68-72 °C

  • DNA Polymerase lagert sich an die Primer an und rutscht über das Template

  • dabei synthetisiert das Enzym einen komplementären Strang

3 Schritte -> Wdh. 30-40 Zyklen, sodass sich das entsprechende DNA Fragment anreichert

• -> Millionen exakter Kopien

die dann der Fragestellung entsprechend angereichert werden können

• z. B.: Auftrennung im Agarosegel, Reinigung aus dem Gel, Sequenzierung., Klonierung usw.

trennt DNA Fragmente ihrer Größe nach auf

abhängig von Agarosekonzentration -> Porengröße zwischen 100 und 300 nm

man kann Banden

• rausschneiden

• aufreinigen

• sequenzieren

• klonieren

Farbstoff:

• Ethidiumbromid -> interkaliert zwischen den Basen

nach Restriktionsverdau: Fragmente mittwes Agarosegelelektrophorese —> aufgetrennt und ihre Länge durch mitlaufenden Standard bestimmen

• Fragmente können auch aus dem Gel ausgeschnitten, gereinigt und weiterverarbeitet werden

  
  

ist die klassiche Methode der DNA-Sequenzierung

ermöglicht die Bestimmung der Basenabfolge innerhalb eines bestimmten DNA-Moleküls

-> kurze DNA-Stränge können so entschlüsselt werden

erstes entschlüsseltes Genom: Bakteriophage 1977 - Nobelpreis

DNA -> Ausgangsmaterial, das untersucht & analysiert werden soll

je mehr genetisches Material, desto besser

Primer lagert sich während der Sanger Sequenzierung an jeweils einen Einzelstrang der DNA-Matrizen an

dient dort als Ansatzpunkt für die DNA-Polymerase

dienen der DNA-Polymerase als Bausteine, so dass diese überhaupt erst über Material verfügt, um die Einzelstränge komplementär zu kopieren

vier Nukleotide:

• Adenin

• Guanin

• Cytosin

• Thymin

Abbruch Nukleotide -> werden von DNA-Polymerase genau so verbaut wie normale Nukleotide

allerdings: Kopiervorgang wird durch Abbruch Nukleotide beendet, wenn diese eingesetzt werden

es gibt 4 Abbruch Nukleotide

• ddATP

• ddCTP

• ddGTP

• ddTTP

können mit Fluoreszenz-Farbstoff markiert werden

• jedes der 4 mit unterschiedlichem Farbstoff

Modifikation -> alle ddNTPs in ein Reaktionsgefäß -> entstehenenden Kettenabbruchprodukte werden mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt -> mit Laser zur Fluoreszenz angeregt -> die ddNTPs am ende jedes DNA-Fragmentes zeigen FLuoreszenz unterschiedlicher Farbe -> von Detektor erkannt-> Elektropherogramm gibt direkt die Sequenz der Basen des sequenzierten DNA-Stranges wieder

ist ein PCR-Verfahren, bei dem zwei PCR-Reaktionen nacheinander geschaltet werden

ein Teil des PCR-Produktes aus der ersten Amplifikation dient als Matrize für die zweite PCR

in der zweiten PCR wird durch ein zweites Primerpaar, das an Sequenzbereiche innerhalb der Matrize bindet (nested primer) ein kürzeres DNA-Fragment amplifiziert

Vorteil: eine um etwa 2-3 Zehnerpotenzen gesteigerte Sensitivität + gesteigerter Spezifität

• da für das nested-PCR-Produkt nur das Produkt der ersten Amplifikation als Matrize dienen kann

• -> kürzere Sequenzen werden amplifiziert -> Qualität gesteigert & Fehler verringert

auch geringste Spuren von DNA können mit dieser Methode nachgewiesen und für diagnostische Zwecke genutzt werden

Anwendungsform der diagnostischen PCR -> vor allem in der Forensik für Short tandem Repeats

ursprünglich: PCR vor allem für die Amplifizierung von DNA zur Sequenzierung eingesetzt

durch Forschritt der Sequenzierungsprojekte -> möglich, die PCR als diagnostische Methode zu nutzen

für viele Erkankungen -> verschiedene Viren, Bakterien oder genomische Veränderungen ursächlich -> Für Bestimmungder Krankheitsursache notwendig, mehrere PCR-Nachweise gleichzeitig durchzuführen

Prinzip:

• einzelne PCR-Verfahren nicht in getrennten PCR-Reaktionen, sondern alle zusammen in einer PCR-Reaktion

  • Aufwand, Kosten, Zeit -> verringert

• -> PCR-Ansatz, mit dem Potential zum Nachweis von mehr als nur einem Genom-Abschnitt

Entwicklung einer Multiplex-PCR -> mit erhöhtem Aufwand verbunden

• durch die höhere Anzahl von Primern/Sonden -> Wechselwirkungen zwischen Oligonukleotiden viel wahrscheinlicher, treten in der Realität häufiger aus

• Wechselwirkungen würden Sensitivität der Multiplex-PCR reduzieren und müssen deswegen ausgeschlossen werden

reale Bedingungen: sehr schwer Wechselwirkungen zwischen den Oligonukleotiden vollständig auszuschließen

-> sensitive Multiplex-PCR Anwendungen sind aktuell vor allem -> Duplex-PCR

deshalb: Nachweis der zu bestimmenden Genomsequenz mit einer internen Amplifikationskontrolle kombiniert

• Amplifikationskontrolle für viele diagnostische PCR-Anwendungen vorgeschrieben, um falsch negative Kontrollen auszuschließen

• Falsch negativ -> wenn in der zu untersuchenden DNA Inhibitoren für den PCR-Nachweis enthalten wären

  • hauptsächlich Inhibitoren der Taq-Polymerase, wie z .B. Fe-Ionen aus Erys

• Amplifikationskontrolle -> PCR-Nachweis -> detektiert Abwesenheit von Inhibitoren für die PCR

• dafür wird eine 2. PCR-Reaktion konstruiert und der PCR-Ansatz mir einer kleinen Menge der Ziel-DNA für diese PCR versetzt

• bei einem negativen Ergebnis für den Nachweis der zu bestimmenden Gensequenz muss diese Amplifikationskontrolle positiv sein, um die Abwesenheit von Inhibitoren und damit die Richtigkeit des negativen Ergebnisses zu bestätigen

• Wenngleich Duplex-PCR-Reaktionen am weitesten verbreitet sind, so sind Verfahren mit 1-4 PCR-Nachweisen pro Ansatz keine Seltenheit mehr

spielt insbesondere bei der Vemehrung einiger Viren z. B. Retroviren -> HIV, eine wichtige Rolle

Hierbei wird die RNA in einen DNA Strang umgeschrieben und anschließend zu eibnem DNA-Doppelstrang ergänzt

Ablauf:

• mRNA + Primer

• Inkubation mit reverser Trankriptase um einen cDNA zu synthetisieren -> Hybrid aus cDNA und mRNA liegt vor

• cDNA Strang -> mrNA Strang hydrolisieren

• Inkubation mit DNA Polymerase um 2. DNA Strang zu synthetisieren

• dsDNA liegt vor -> Inkubation mit terminaler Transferase um einzel-strängige Teile hinzuzufügen

• doppelsträngige cDNA, bereit zur Einfügung in einen geeigneten Klonierungsvektor

Reverse Transkriptse macht DNA aus einem RNA Template -> Gegeteil von Transkription

ausgewählte Phagen sind hochspezifisch für bestimmte Bakterienarten

nur schädliche Bakterien werden abgetötet; Antibiotika treffen alle Bakterien, auch Normalflora und co.

Phagen Phagen vermehren sich am Ort der bakteriellen Infektion

• sind alle Bakterien eliminiert, werden die Phagen abgebaut oder ausgeschieden

Phagen sind weitestgehend frei von Nebenwirkungen

• unser Körper kennt Phagen

Therapeutische Phagen -> vergleichsweise preiswert

Nur lytische Phagen einsetzen, lysogene Phagen sind gefährlich für den Menschen

Enzyme von Phagen für tiefes Eindringen in Gewebe -> keine Resistenzbildung möglich, immer noch selektiv, v. a. bei resistenten Bakterien

Pharmaindustrie hat kein Interesse an Therapie, da nicht patentierbar – zu alt

Beispiel:

• Streptokokken-Bakteriophagen -> Indiziert bei infektiösem pathologischem Prozess

Alternative zu Sanger Methode

Cycle Sequencing: Benutzen von 4 Fluoreszenzfarbstoffen anstatt Radioaktivität

ddNTPs werden mit Farbstoff markiert, dNTPs nicht

Vorteil: nur noch 1 Ansatz notwendig

Gleiches Kettenabbruchprinzip

• Bruchstücke werden auf kapillare gegeben und nah der Größe aufgetrennt

• Je kleiner das Fragment, desto schneller passiert es die Kapillare. 

Auswertung der Banden via Laser -> So kann Nukleotidreihenfolge ermittelt werden

Polymerase PWO oder Klenow bei 37°C nur forward oder reverse primer benötigt, sonst funktioniert Prinzip nicht

Sequenzierung mit 4 verschiedenen Ansätzen und radioaktiv markierten Nukleotiden (ddNTP)

Bei einem Einbau eines ddNTP kommt es zum Kettenabbruch

Die Sequenzierung ist auf der nächsten Folie sichtbar

Kettenabbrüche sollten random und an jeder Stelle erfolgen, so kann Nukleotidreihenfolge bestimmt werden

Vervielfältigungs Methode für Nukleinsäuren

-> PCR Verlauf in Echtzeit plus Quantifizierung der amplifizierten Genfragmente duch Fluoreszenzmessung

• Fluoreszenz nimmt proportional mit der mit der Menge der PCR-Produkte zu -> Quantifizierung

zur Erkennung Erbkrankheiten, Bestimmung der Viruslast nach Infektionen, Quantifizierung von Genexpressionen

RNA oder DNA Probe

• bei RNA: erst muss mit reverser Transkriptase aus RNA cDNA hergestellt werden

Hydrolisierungs Primer -> TaqMan

Hybridisierungs Primer -> LightCycler

DNA-Bindung -> SYBR Green

RT-PCR -> Reporter und Quencher

• Reporter =

• Quencher = inaktiviert Reporter, bei Elongation durch die Polymerase wird die Sonde abgebaut -> Entfernung Reporter und Quencher wird größer -> Reporter leuchtet

Weiterentwicklung der TaqMan Sonde

tragen ebenfalls Reporter und Quencher an ihren Enden

bilden durch selbstkomplementäre Sequenzen eine haarnadelförmige Struktur aus

durch die Bindung an die Zielsequenz -> Auffaltung der Struktur -> Fluoreszenzunterdrückung des Primers wird aufgehoben

Nachteile:

• begrenzte Haltbarkeit fluoreszenzmarkierter Primer

• SYBR Green:

  • Farbstoff kann nicht nur mit Zielsequenz, sondern auch mit Primer-Dimeren oder PCR-Beiprodukten reagieren -> hohe Sensi, geringe Spezi

• Sondentechnik:

  • hohe Spezifität, geringe Sensitivität

Spezi -> am Ende der RT-PCR durch Schmelzkurvenanalyse prüfen

Für alle gilt:

• Fluoreszenz ist porportional zu den PCR-Amplifikaten -> Quantifizierung der Zielsequenz!

Beurteilung der Spezifität der PCR-Produkte

DNA-Fragment wird kontinuierlich erhitzt

• Fragment wird aufgeschmolzen

• Schmelzpunktanalyse zeigt nur den Peak des Zielgens

  • Primerdimere (SYBR!) hätten einen oder mehrere zusätzliche Peaks mit geringerem Schmelzpunkt verursacht

  • wenn verschiedene DNA-Fragmente in der Probe enthalten sind oder die Fragmente sich durch Basenveränderungen unterscheiden -> mehrere Peaks, versch. Tm-Werte

Bei Schmelzkurvenanalyse:

• alle Produkte sollten den gleichen Schmelzpunkt haben

• -> Nachweis für keine Artefakte, saubere Herstellung, gute Qualität

• 2 °C -> A/T

• 4 °C -> G/C

Schmelztemperatur -> Tm -> Temperatur, bei der die Helixtruktur zur Hälfte verloren gegangen ist

cycle threshold -> TaqMan

Zyklenanzahl der PCR, in de das “echte” Fluoreszenzsignal das Hintergrundrauschen der Fluoreszenz übersteigt

Hämatologie -> Faktor V Leiden

Onko -> Onkogen k-ras, HER2-Neu

MiBi -> Bacillus anthracis, Candida albicans

Viro -> Hepatitis A, Parovirus, Herpes Simplex Virus

Genetik -> Detektionen, Insertionen

Lebensmittelchemie -> Mikroorganismennachweis im Bier, Nachweis genetisch veränderter Lebensmittel

Grundlagenforschung -> Vergleich von RNA-Expressionsmustern ganzer Proteinfamilien z. B. Zytokine, Signalwege

Tiermedizin, Zoologie -> Verschiedene Erreger von Tierseuchen z. B. Vogelgrippe Virus

Forensik -> SNP-Analysen für den genetischen Fingerabdruck