Restriktionsanalyse

Im prokaryontischen Chromosom

Kleinere extrachomosomale DNA-Moleküle

—> Episomale genetische Elemente in Form von zirkulären, doppelsträngigen DNA-Molekülen

• CCC: Covalently closed Circle —> DNA liegt in überspiralisierter Form vor.

• OC: Nicked Circle —> Durch Einzelstrangbruch in einem der beiden DNA-Stränge der CCC

• Linear: Durch Doppelstrangbruch der CCC

• Lineare DNA: Größe entspricht Fragmentlänge

• Plasmid-DNA: Größe abh. Von Länge und Konformation

Bakterielle Enzyme (sequenzspezifische DNA-Endonukleasen), die an beiden DNA-Strängen, an definierten Stellen die Phosphodiester-Bindung hydrolysieren, also die DNA “zerschneiden”.

Die DNA-Erkennungssequenzen sind in der Regel symmetrisch - “palindromisch”

• Erkennungsmelodie spezifisch

• Schnittstelle unspezifisch

• Schnittstelle außerhalb der Erkennungsstelle

Bsp.: EcoPI

• Erkennungsstelle spezifisch

• Schnittstelle spezifisch

• Erkennungsstelle innerhalb der Erkennungsstelle

—> a) Glatter schnitt: “blunt Ends”

Bsp.: SmaI

—> b) Versetzter Schnitt: “Sticky ends” - überhängende 5´-oder 3´-Enden (Kohäsive Enden)

Bsp.: EcoRI

• Erkennungsstelle spezifisch

• Schnittstelle spezifisch

• Erkennungsstelle außerhalb der Erkennungsstelle

• Nicht Palindrome Erkennungssequenz

Bsp.: HgaI

Restriktionsenzyme mit identische Erkennungssequenz.

• Unterschiedliche Enzyme schneiden an der gleichen Stelle der Erkennungssequenz

• Unterschiedliche Enzyme schneiden in der gleichen Erkennungssequenz an verschiedenen Stellen

• 5´-sticky-ends: 5´-Enden sind länger nach dem Schnitt

• 3´-sticky-ends: 3´-Enden sind länger nach dem Schnitt

Restriktionsenzyme haben i.d.R. Eine eigene zugehörige Methyltransferase, die die Aufgabe hat die zelleigene DNA so zu methylieren, dass diese durch das Restriktionsenzyme nicht abgebaut werden kann.

—> DAs spezifische Methylierungsmuster schützt also vor dem Nucleaseabbau

Zb.: Abfolge GAATTC kommt sehr häufig vor —> Methyltransferase methyliert 2. A von GAATTC —> E.Coli schneidet methylierte DNA nicht —> eingeschleuste Fremd-DNA fehlt dies Modifikation —> Wird geschnitten und so zerstört

• Polymer aus ß-D-Galactose und 3,6-ANhydro-Alpha-L-Galactose

• Bildet beim GelierenDoppelhelizes die sich zu Aggregaten zusammenlagen

• Konzentration bestimmt Porengröße und Trennverhalten

• umgekehrt prop. zu dem Logarithmus des Molekulargewichts

• Abhängig von Agarose-Konz., Stromstärke, Pufferbedingungen,…