Was gibt es für programmierbare Nukleasen?
Meganukleasen
ZFN
TALEN
Cas9
Was ist ODM? (Oligo-directed mutagenesis)
braucht keine Nuklease
modifiziertes Oligo als Reparaturvorlage
Rate ca. 1x10^-4
Was sind Restriktionsenzyme?
können spezielle DNA-Sequenzen erkennen und schneiden
Was sind Meganukleasen?
Restriktionsenzyme mit langer Erkennungssequenz (12-40 bp)
hohe Spezifität -> schneidet nur 1 x im Genome
Beispiel I-SceI
-> Kommt aus Mitochondrien aus Hefe
-> 18 bp Erkennungssequenz
Re-engineering
-> Verschiedene Alpha- und Beta-Untereinheiten austauschen
-> spezifische Reste mutieren und Mutationen kombinieren
-> Methode ist aufwändig
Was sind ZFN?
erste frei programmierbare Nuklease
ZF sind natürliche DNA-Erkennungs-Module
Ein ZF erkennt 3-4 Basen
Erkennen auf beiden Strängen Basen
-> Können auch überlappen
ZF können an Restriktionsenzyme fusioniert werden
-> FokI
ZFN bindet von 3`->5`
Es sind immer ZFN-Paare nötig
-> Optimaler Abstand 6 bp
bis zu 6 ZF aneinander
Woher stammen TALEs? (Transcription activator-like effectors)
Aus Xanthomonas
Manipulieren Wirtzelle, indem sie Proteine rein schießen über Typ III Sektretionssystem
Wandern in den Zellkern
Binden an Promotoren und schalten Gene an
Wie sind TALEs aufgebaut?
Translocalisationsdömäne
-> Schleußt Protein über TypIII Sekretionssystem
Reapeats
-> Erkennt Ziel-DNA
Nuklearlocalisationsdomäne
-> Bringt Protein in Kern
Transcriptional Aktivierungsdomäne
-> Aktiviert die Transkription
Wie sind die Repeats von TALEs aufgebaut?
Ein Repeat besteht aus 34 Aminosäuren
Ein TAL besteht aus 10-20 Repeats
Repeats sind sehr gleich nur Position 12 und 13 verändert
-> RVD (repeat-variable diresidue)
Jeder Repeat erkennt ein Basenpaar
-> AS 12 und 13 erkennen eine Base
An Position 0 ist immer ein T
In der Natur meist 17,5 Repeats
-> Letzer sehr konserviert
Es gibt schwache und starke Repeats
-> mindestens 3 starke Repeats
-> Schwache: Van-der-Walls
-> Starke: Wasserstoffbrücken
TAL wickelt sich um die DNA herum
Können über DNA gleiten
Schneiden nicht von sich aus!! Brauchen Nuklease
Welche RVD gibt es?
A -> NI
C -> HD
G -> NN
T -> NG
Was ist TALEN?
TALE + Nuklease (FokI)
Konstruktionszeit <1Woche
Kosten: ca. 40€/ TALEN-Paar
N-Terminaler Teil des TALE wird gekürzt
C-Terminaler Teil wird entfernt
FokI ist in + und - geteilt
-> Können nur zusammen schneiden
Schneiden in einem Abstand von 15 bp
Anstatt Restriktionsenzymen kann man auch Aktivatoren oder Repressoren binden
Wie ist CRISPR/Cas aufgebaut?
Cas9 hat zwei aktive Zentren und PAM
-> RuvC und HNH
tracrRNA + crRNA -> gRNA
PAM erkennt Sequenz am Strang, wo nicht die gRNA bindet
Wie funktioniert das CRISPR/Cas-System?
Eigentlich ein Immunsystem für Bakterien gegen Phagen
-> Phagen schießen DNA rein
-> Cas-System klaut einen Teil der DNA (spacer) und baut es ins eigene Genome ein
Kann wieder abgerufen werden und mit Cas9 fusionieren
-> DNA von Phagen wird abgebaut
CAS9 hat zwei aktive Zentren und PAM
crRNA (Erkennung)+ tracrRNA (Befestigung) -> gRNA
sgRNA -> Synthetisch hergestellt
PAM erkennt Sequenz, wo gRNA nicht bindet
-> Code: NGG (Irgendeine Base + G + G)
Schneidet 3 bp neben PAM
Was sind die Vorteile von CRISPR/Cas?
Einfach Spezifität umzuprogrammieren
einfach zu konstruieren (1 Protein mit verschiedenen sgRNAs)
einfach zu multiplexen
Was brauchen wir für Promotoren für CRISPR/Cas?
Was gibt es für verschiedene Möglichkeiten mit CRISPR/Cas?
Was ist die CRISPR/Cas Nickase?
Erzeugt nur einen Einzelstrangbruch am dsDNA
Reparatur durch HDR nicht NHEJ
Homologe Rekombination möglich
kaum Doppelstrangbrüche
2 x Cas9-Nickasen spezifischer
-> Nur wenn beide Binden NHEJ
-> Weniger off-targets
Wie kann man die PAM verändern?
PAM hat NGG als Code
-> N = Jede Base
Kann länger oder kürzer sein
Lange PAM = mehr spezifisch
Kurze PAM = mehr flexibel
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