4B. sgRNA Design

• Gibt es ein zweites ATG für das Gen

• Könnte ein Teilprotein aktiv sein

• kann die mRNA Probleme machen

• Schnitt in nicht exprimierte Exons: kein KO

• Schnitt C-terminal: geringerer KO

• manche Stellen nicht erreichbar

• 5´und 3´UTR (Untranslatierter Bereich an den Enden der mRNA) -> kein KO

• welcher der Stränge ist egal

• hoher oder niedriger G/C-Gehalt -> gRNA wenig aktiv

• spezifische Positionen in sgRNA - spezifische Basen

-> Man sollte immer mehrere sgRNAs pro Zielgen testen

• Kurze DNA-Sequenz in der sgRNA

• 8-10 Nuklotide lang

• neben der PAM

• wichtig für die Bindung an der Ziel-Sequenz

• Es ist Position und Basen abhängig innerhalb der sgRNA, ob das Mismatch etwas ausmacht

• In der Seed Region ist es schlimmer

• vorderer Bereich wird mehr toleriert

• Es werden 1-6 mismatches toleriert

• Anzahl an off-targets steigt exponentiell mit Anzahl der mismatches

• viele off-targets nicht vorhergesagt

  
  

• sgRNA kann ausbeulen

• ssDNA kann ausbeulen

• Entstehung eines Frameshifts

• Durch die Toleranz von 1-6 mismachten gibt es viele off-targets

• Problem: Population an Zellen mit unterschiedlichen Mutationen

1. Bioinformatisch

2. In vitro Methoden

   -> Digenome-seq

   -> CIRCLE-Seq

   -> SITE-Seq

-> DNA wird alleine mit Cas9 untersucht

1. In vivo Methoden

   -> GUIDE-seq

   -> LAM-HTGTS

   -> BLISS

   -> IDLV capture

-> Erst Genome Editing dann nach off-targets untersucht

• off-targets vorhersagen

  -> gRNA bekannt, im Genome nach passenden Sequenzen gucken

• Zielbereich amplifizieren (PCR)

• Cas9 schneiden lassen und Stücke wieder auswerten

• Problem: Man findet nur off-targets die man vorhersagt

• In vivo Methode

• Virus mit linearen Virusfragment

• Kann sich nur ins Genome integrieren, wenn es einen DSB gibt -> Da wo Cas9 geschnitten hat

• Wurde es integriert kann es mittels PCR und einem Primer für das Virusfragment untersucht werden

• In vivo Methode

• Einbringung von Doppelsträngigen Oligos

• Werden in DSB eingebaut

• Primer in Oligos

• In vivo Methode

• Basieren auf PCR

• Adaptoren werden ligiert

• In vivo Methode

• Basieren auf PCR

• Adaptoren werden ligiert

• In vitro Methode

• Zwei Ansätze

  1. Ohne Cas9

  2. Mit Cas9

• Bei Deletionen oder Insertionen kann Cas9 nicht schneiden

• Werden mit U3 oder U6 Promotor exprimiert

  -> RNA-Polymerase III-Promotoren

  -> U6-Promotor startet mit “G”

  -> U3-Promotor startet mit “A”

• transkribiert nicht codierende Sequenzen

  -> tRNA, rRNA

• Diese RNAs:

  -> Werden nicht poly-adenyliert

  -> Haben keine CAP

  -> Haben präzises 5´-und 3´-Ende

  -> verbleibt im Kern

• CRISPR-Array

  -> Besteht aus den Repeats und Spacern

  -> Es wird erst eine Pre-CRISPR RNA transkribiert

  -> Nach Expression wird diese mittels RNase III zerschnitten

• CRISPR-Array wird durch Csy4 (Endonuklease) geschnitten

• Nicht RNase III

• Prozessierung von tRNA

• Wenn man seine gRNA zwischen tRNA setzt, werden diese automatisch prozessiert

  -> Promotoren sparen

• Ribozyme = Selbst-prozessierende Systeme

  -> Haben Hammerhead der sich selbst rausschneidet

1. Vor jede gRNA einein eigenene Promotor und Terminator

2. Kombinieren mit tRNA

3. Kombinieren mit Hammerhead oder HDV Ribozyme

• Verlängerung der gRNA

• 2x nCas9

• FokI-dCas9

• Kombinationen von Werkzeugen

• Durch Verlängerung um 2 Nukleotide am 5´-Ende wird Cas9 spezifischer

• Durch Verkürzung um 2-3 Nukleotide am 5`-Ende kann Cas auch spezifischer werden

• 2x nick = DSB

• Vorteil: spezifischer, da paired off-targets unwahrscheinlicher

• Nachteil: 2 effiziente und benachbarte sgRNAs benötigt

• dCas9 = Beide katalytischen Domänen mutiert -> kann nicht schneiden

• FokI an Cas9 fusioniert (N-terminal)

• Vorteil: spezifischer, da paired off-targets unwahrscheinlich

• Nachteil: 2 effiziente und exakt benachbarte sgRNAs benötigt (PAM)

• MegaTALs

  -> Fusion TALE + Meganuklease

  -> Sehr präzise, sehr effizient

• Cas9-ZFNs

  -> Fusion von Cas9 und ZF

  -> Höhere Spezifität