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Labor Genetik II

Übung V, VI, VII

AC
von Alik C.

1.    Welches Enzym führt die Verknüpfung des zu klonierenden DNA-Fragmentes mit dem Vektor durch?

  • Ligase


1.    Welche Bindung knüpft dieses Enzym?

Phosphorsäurediesterbindung

1.    Bei welchem zellulären Prozess spielt dieses Enzym eine Rolle?

  • Replikation


1.    Was sind kompetente Zellen?

  • Zellen, die nackte DNA aufnehmen können


1.    Was geschieht während der 30 minütigen Inkubation der Transformationsansätze auf Eis?

  • Plasmid lagert sich an die Zelloberfläche (Negative Abstoßungskräfte sind aufgrund der hohen Salzkonzentration minimiert)


1.    Was passiert beim „heat shock“ während der Transformation?

  • Wärme => Zellen dehnen sich aus => ziehen Wasser ein -> Plasmid wird mit eingezogen


1.    Weshalb enthält das LB-Medium für die Erholungsphase der Zellen kein Ampicillin?

  • Zellen brauchen Zeit (nach der „anstrengenden“ Trasnformation), um die Ampicillinresistenz auszuprägen

  • ß-Lactamasegen muss exprimiert werden, bevor die Zellen auf den Amp-haltigen Agar gelangen


1.    Wozu dient der Transformationsansatz mit der gekauften (supercoiled)  pUC19 Plasmid-DNA?

  • Kontrolle der Transformationskompetenz der gekauftenDH5 α  Zellen

  • Wie gut können sie wirklich fremde DNA aufnehmen


1.    Die Bakterienstämme für die Klonierung sind gentechnisch verändert worden. Nennen Sie zwei Unterschiede zum Wildtyp und erklären weshalb?

  • auxotrophe Mangelmutanten

  • keine Rekombinationsfähigkeit

  • keine Antibiotikaresistenz

  • -> Wildtyp kann in der freien Laufbahn nicht mehr überleben


1.    Was versteht man unter einer Umklonierung?

  • Überführung eines DNA-Fragmentes von einem Plasmidvektor in einen anderen


1.    Was versteht man unter einer „gerichteten“ Klonierung und wie viele verschiedene Restriktionsendonukleasen braucht man hierfür mindestens?

  • Fragment kann nur in eine bestimmte Richtung in den Vektor einkloniert werden

  • Man benötigt zwei verschiedene Restriktionsendonukleasen


1.    Warum wachsen auf unseren Agarplatten nur transformierte Bakterien?

  • Weil nur diese das Plasmid mit dem Resistenzgen enthalten


1.    Worauf beruht die Farbbildung der blauen Bakterien?

Umsetzung von X-Gal durch eine intakte ß-Galactosidase

1.    Richtig oder falsch?

Blaue Bakterien enthalten sowohl das Plasmid als auch das einklonierte Fragment.

  • falsch


1.    Weshalb ist für die Identifikation der „richtigen“ Klone die Antibiotikum-Resistenz alleine nicht ausreichend?

  • Antibiotikaresistenz heißt nur, dass ein Plasmid in der Zelle ist, aber nicht, dass dieses Plasmid auch ein Fragment enthält

  • -> Fragment nur dann, wenn weiße Kolonie -> Plasmid mit Fragment


1.    Warum ist in den LB-Platten X-Gal enthalten?

  • Um das Blau-Weiß-Screening zu ermöglichen

  • Weiße Kolonie -> Plasmid mit Fragment

  • Blaue Kolonie ->Plasmid ohne Fragment


1.    Wodurch werden die Bakterienzellen in unserem Versuch  lysiert?

  • SDS


1.    Wo befindet nach der Kaliumacetatfällung die Plasmid-DNA?

  • Überstand


1.    Wo befindet nach der EtOH-Fällung die Plasmid-DNA?

  • Pellet


1.    Womit wird die RNA nach der Plasmid-Präparation entfernt?

  • RNAse


1.    Zu welchem Pol wandern die DNA-Moleküle während der Elektrophorese?

  • Pluspol


1.    Bei der Gelelektrophorese wandern Plasmide abhängig von ihrer Konformation unterschiedlich weit. Wie heißt die „schnellste“ Konformation?

  • supercoiled Form oder

  • ccc

    • circular cloed coiled


1.    In welcher Konformation werden Plasmide der Größe nach im Agarosegel aufgetrennt?

  • In linearisierter Form


1.    Sie schneiden Plasmid-DANN aus einer blauen Bakterienkolonie mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und HindIII. Wie viele Fragmente erwarten Sie auf Ihrem Agarosegel zu sehen?

  • Es entstehen zwei Fragment (Polylinker + Vektor)

  • aber man kann nur den Vektor auf dem Gel sehen, da der Polylinker zu klein ist (20 bp)


1.    Sie schneiden Plasmid-DNA aus einer weißen Bakterienkolonie nur mit BamHI. Wie viele Fragmente erwarten Sie auf Ihrem Agarosegel und wie groß (ist) sind  diese(s)?

  • Ein Fragment (Vektor + Fragment)

  • 3260 bp


1.    Kann bei der heutigen Gelelektrophorese der Plasmid DNA die Länge der mitpräparierten RNA ermittelt werden? (mit Begründung)

  • Nein, da diese Sekundärstrukturen bildet und nicht der Größe entsprechend durchs Gel wandert


1.    Welche der von Ihnen hergestellten Bakterienklone müssen nach dem Gentechnik-Sicherheitsgesetz durch Autoklavieren unschädlich gemacht werden?

  • Alle, da alle Plasmidvektoren gentechnisch hergestellt wurden


1.    Zeichnen Sie eine Karte für das rekombinate Plasmid pUC560 mit seinen wichtigsten Elementen (ori, Resistenzgen, mcs, Fragment, Restriktionsschnittstellen für HindIII und BamHI, Längen in bp):




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Alik C.

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