6

• Präzise Änderungen (nicht zufällige Reparatur)

• Jede Änderung möglich (Transition (C -> T), Transversion (C -> G), Insertion, Deletion, Inversion)

• Gen/Protein bleibt funktional (nicht inaktiviert)

• Allelaustausch möglich

• gezielte Veränderung

• HDR oft weniger effizient als NHEJ

• Schnitt nah am zu veränderten Ort essentiell

• Template muss erneuten Schnutt durch Cas9 blockieren (z.B. PAM verändert)

• Erhöhung der Kopienzahl der Reparaturvorlage = erhöhte Effizienz

• Geminiviren:

  -> dsDNA

  -> Replikation im Kern

• Unser gewünschtes DNA-Fragment auf den Virus und mittels Agrobacterium in Pflanzen einbringen

• Virus wird im Kern Zirkulär

• kein Größenlimit, wenn kein Zell-zu-Zell Transport nötig

• verlängerte sgRNA dient als Vorlage zur präzisen Veränderung

• Fusionierte Reverse Transkriptase RNA -> DNA

• nCas9 + pegRNA + Reverse Transkriptase

• Die pegRNA ist anderes herum, als es in die DNA integriert werden soll

• Durch Nicken ein freies 3`OH Ende

• Eine zweite sgRNA, um den nicht-editierten DNA-Strang zu nicken

• hohe Effizienz = auch diverse “indel” Mutationen

• Insertion, Deletion und alle Basenveränderungen möglich

• Twin Prime Edtiting für präzise Deletionen

• Relativ niedrige Effizienz

• stark abhängig von Art und Ort

• z.T. chimäre Pflanzen

• Klasse 1 = Multi-subunit effector complexes

  -> Sehr viele verschiedene Proteine beteiligt

• Klasse 2 = Single-protein effector modules

  -> Ein Protein mit mehreren Funktionen

Es gibt mehr Klasse 1

Cas9 gehört zu Klasse 2

• Gehört zu Klasse 2 Typ II

• SpCas9 (Normale) blunt end

• FnCas9 mach Überhänge

• FnCas9 alleine nicht aktiv, kann Nukleosomen nicht zurseite schieben

• Gehört zu Klasse 2 Typ V

• PAM liegt auf der 5`Seite (Bei Cas9 auf der 3`Seite)

• Der Schnitt ist nicht in der nähe der PAM, sondern am anderen Ende

• Schnitt ist mit Überhang (5`-Überhang)

• schneidet selbst seinen crRNA-Vorläufer

• Es gibt keine Cpf1-Nickase!!!

• Klasse 2 Typ VI

• Schneidet RNA nicht DNA

• 64 nt gRNA (28-30 nt Zielsequenz)

• Schritt 1: Erkennung und Schnitt einer Ziel-RNA

  -> Aktivierung von Schritt 2

• Schritt 2: unspezifische RNase-Aktivität

  -> Schneidet alle RNAs

• Transkript “knock-down”

• Live Zell-Transkript Imaging

• RNA-Editierung

• Erkennung von RNA zur Diagnose (SHERLOCK)

• Virusinhibition

• Modulation des Splicing

• Detektion von SARS-COV-2

• Wird auch C2c2 genannt

• Abbau von Ziel-RNA

  -> Abbau von RNA im Organismus oder infektiöse RNA

• Zielsequenz darf keine Sekundärstrukturen haben

• RNA-Baseneditor

• Anstelle die DNA zu editieren wird die RNA editiert

  
  

• Nachweis von Nukleinsäuren

• unspezifische, rasche RNase-Aktivität zur Signalverstärkung

• Target Sequenz wird von Cas13a erkannt und beginnt mit Nuklease-Aktivität

• Es gibt Reporter Moleküle die durch die Nuklease-Aktivität von Cas13 geschnitten werden

• Verwendung:

  • Nachweis von Erregern

  • Stamm-Genotypen

  • SNPs in Menschen

  • Corona Test

• Cascade-Systeme sind alle Cas-Proteine der Klasse 1

• Besteht aus vielen Cas-Proteinen

• Es werden immer 5 Basen erkannt und eine steht in die andere Richtung

• Kann als Schredder verwendet werden

  -> Cascade bindet an Zielsequenz und aktiviert Cas3

  -> Cas3 Helikasedomäne entwindet DNA

  -> Cas3 zieht DNA ein

  -> Cas3 zerkleinert DNA

• Cas3 schreddert in eine Richtung bis 20 kb

  
  

• Zerstörung der Cas3

• Rest kann an Zielsequenz binden

• Fusion mit p300 um Gene anzuschalten

Idee: Loci auf dem Chromosom markieren über fluoreszierendes Cas9

• Damit man sehen kann, wo genau sich ein bestimmter Bereich in der Zelle befindet

• Split-Cas9

• Optogenetic-Cas9

• Cas9-Protein in zwei Teile geschnitten

• Die beiden Teile wurden mit anderen Bindedomänen fusioniert

• Rapamycin hält die Einheiten zusammen

• Ein Teil mit NES (Hält Teil außerhalb des Kerns)

• Ein Teil mit NLS (Bringt, wenn beide Teile zusammen sind in den Kern)

• Licht induzierbare Reaktion

• Licht-abhängige Aktivierung von Ionenkanälen

• Erregung von Nervenzellen

• Split-Cas9 an lichtabhängigen Domänen fusioniert

Nutzung:

• Repression

• Aktivierung