Transkription

Prokaryoten: polycistronische mRNA

= 1 Transkript aus mehreren Genen

Eukaryoten: idr monocistronische mRNA

= 1 Transkript entspricht einem Gen

(DNA-abhängige) RNA-Polymerasen

• mehrere UE

• keine Nuklease-Aktivität (kein Proofreading)

• Fehlererkennung möglich

  • falsche Basenanlagerung

  • RNA-Pol verweilt länger an der Stelle

  • erhöht Wahrscheinlichkeit, dass sich das falsche Nukleotid wieder von DNA löst

• Bindungsstelle: Promotor

• 5 UE:

Core

• β’: bindet DNA-Matrix

• β: bindet wachsende RNA

• α: Zusammenbau und Stabilität des Enzyms; Bindung an Promotor, Wechselwirkung mit Regulatoren

• ω: Stabilisierung der eigenen 3D-Struktur und Initiation

• 70σ: Erkennung von Startstellen der Transkription (Anlagern)

• Regulationsregion

  • Aktivatorbindestelle

  • Promotor / Operator

• Transkriptionseinheit

  • 5’-UTR

  • codierende Sequenz

  • 3’-UTR

  • Terminationsstelle für Transkription

• beide können abgelesen werden

  • beide können Promotoren besitzen

• Orientierung der Promotoren entscheiden über Richtung der RNA-Polymerase

  • von rechts nach links: oberer Strang

  • von links nach rechts: unterer Strang

5’-3’-Richtung

Initiation

• Beginn der Transkription

• Erkennung und Anheftung an Promotor

• Öffnung des DS

Elongation

• Synthese der mRNA von 5’-3’ durch Ablesen DNA von 3’-5’

• Ableserichtung und Erkennung des codogenen Strangs durch Promotororientierung

• 5’-Ende mRNA tritt aus RNA-POL heraus

Termination

• Ablösen RNA-POL

• NH2 (Aminogruppe) N-Terminus = 5’-Ende

• (Carboxylgruppe) C-Terminus = 3’-Ende

DNA-Abschnitt, an den die RNA-Polymerase bindet und mit der Transkription der DNA in RNA beginnt

• Transkript beginnt direkt nach Promotor (+1)

• Wird selbst nicht transkribiert

• Je ähnlicher der Konsensusregion, desto öfter transkribiert

• Bei Prokaryoten stark konserviert

  • Pribnow-Box

• Bei Eukaryoten wenig konserviert

  • CAAT-Box

  • TATA-Box

• RNA-POL erkennt DNA durch σ-Faktor

• Entlanggleiten

• Erkennt -35 und -10 Region (Promotorbereich)

• Öffnung der DNA

• σ-Faktor entfernt sich

Zur Genregulation

• koordinierte Genexpression

• z.B. σ32 reguliert Hitzeschockproteingene

Funktionell zusammengehörende Gene, die oft weit verteilt über das Bakteriengenom vorliegen

• unter gemeinsamer Kontrolle

  • z.B. durch einen σ-Faktor

• Hitzeschock-Regulon

  • hohe Temperaturen

  • mehr σ32

  • RNA-POL erkennt andere Promotoren

  • Hitzeschockproteine exprimiert

  • Selbstregulation: fördern Abbau von und hemmen Bindung von σ32

• beschreibt Freigabe des Promotors durch RNA-POL

• starker Promotor wird schnell freigesetzt

  • neue RNA-POL kann binden

• komplementäre Nukleotide am codogenen Strang angelagert

  • passendes Nukleosid-Triphosphat (NTP) bindet

  • Pyrophosphat durch 3’-OH-Ende der RNA ersetzt

• Verknüpfung durch eine Ester-Bindung zwischen Phosphat und Ribose

• 50-100 Polymerisationsschritte/s

  • Anhalten/Verzögern bei Fehlern, besonderen Sequenzen, an DNA-gebundene Proteine

• Ablösen RNA-POL am Terminator

• Entlassen der mRNA

  • 5’-Ende N-Terminus

  • 3’-Ende C-Terminus

• direkte/einfache Termination bei Prokaryoten

  • Rho-unabh,

  • Haarnadelschleife

• indirekte Termination bei Prokaryoten

  • Rho-abh.

• Folge von GC-Nukleotide im Transkript

• mRNA bindet mit sich selbst und bildet haarnadelförmige Sekundärstruktur

• hairpin interagiert mit β-flap der RNA-POL

• Konformationsänderung der RNA-POL

• NusA (transcription elongation factor) verstärkt Erkennung des Signals

• Bei etwa 80% der Gene in E. coli

• keine besondere Sequenz benötigt, aber Rho-Faktor

• Rho-Faktor ist eine ATP-abh. Translokase

  • aus 6 UE

• Bindung an RNA aktiviert ATPase-Funktion und katalysiert Bewegung in 3’-Richtung

• trennt H-Brücken des Transkripts mit DNA

  • Helikaseaktivität

Teil des prokaryotischen Promotors

• bei -10

• TATAAT

kleine, nicht codierende RNAs:

• rRNA und tRNA

• mRNA nur 5-10%

• rRNA und tRNA lange

• mRNA Halbwertszeit von 30-120s

  • schneller Abbau von RNasen

  • Sonst zu oft translatiert

  • Vorteil: höhere Flexibilität

RNA-POL I

• im Nucleolus

• Synthese der rRNAs außer 5s rRNA (28S, 5,8S, 18S)

RNA-POL II

• im Nucleoplasma

• Synthese der…

  • hnRNA (heteronuklear)

  • mRNA

  • snRNAs (U1, U2, U4, U5: splicing)

  • lncRNAs (long non-coding)

  • miRNAs (micro: Entwicklungsprozesse)

RNA-POL III

• im Nucleoplasma

• Synthese der…

  • 5S-rRNA

  • tRNAs

  • 7SL RNA (Bestandteil Transportsystem zum ER)

  • U6 snRNA

  • snoRNAs (small nucleolar)

RNA-POL IV und V

• im Nucleoplasma

• Synthese kleiner RNAs bei Pflanzen (siRNA: RNA silencing)

RNA-POL mt

• Synthese von RNAs in Mitochondrien

Nuclear-Encoded RNA-POL (NEP)

• erkennt AT-reiches Motiv bei der Expression plastidaler Gene bei Pflanzen

Sie besitzen eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber α-Amanitin (Zellgift eines Pilzes)

einige Hundert hinereinander angeordnete Kopien von rRNA-Genen

• mehrere Einheiten hinereinander

• Auf mehreren Chromosomen verteilt

• Machen 80% der gesamten RNA-Syntheseaktivität aus

• Synthese und Reifung im Nucleolus durch POL I

• NOR: Bereiche wo rRNA-Gene abgelesen werden (Nucleolus organizer region, sichtbar)

Es gibt nur eine

Mosaikgene / split genes

= aus Introns und Exons

• proteincodierend (mRNAs), miRNAs, IncRNAs

• Nur 2% des Gesamtgenoms

• Introns:

  • trennende Sequenz zwischen Exons

  • i.d.R. keine proteincodierende Info

  • aber teilweise Gene für miRNA (vmtl. regulierend)

Codierende Sequenz eines proteincodierenden Gens (“expressed region”)

Trennende Sequenz zwischen den Exons eines proteincodierenden Gens, enthalten in der Regel keine proteincodierende Information (teilweise Gene für miRNA)

Genomvergleich

• Exons gleich

• Introns variieren

• Grenzen sind konserviert:

GT-AG-REGEL

• EXON - GT - INTRON - AG - EXON

• Intronlängen: 0bp (keine) - viele tausend bp

  • Korrelation zwischen Intronlänge und Genomgröße

• Exonlängen: 60-200bp

  • endet oft mit Ende eines Codons

• S1 Nuklease-Methode (Berk-Sharp-Methode)

  • ES-DNA wird abgebaut, DS-DNA vor Abbau geschützt

• Primerverlängerungsmethode (Primer-Extension)

  • Einsatz eines Oligonukleotides zur DNA-Synthese am Transkript

Voraussetzungen

• Kenntnisse über Sequenz im 5’-Bereich des Gens und der vorgeschaltenen Bereiche auf DNA-Ebene

• Präparation von mRNA aus differenzierten Zellen

Methode zur Bestimmung der TSS

• 5’-Teil des Gens cloniert und radioaktiv markiert (da bekannt)

• Restriktion mit Restriktionsenzymen liefert Fragmente

• mRNA aus differenzierten Zellen welche Gen exprimieren isoliert

• verdaute Genprobe zu einem Einzelstrang

• Genprobe und mRNA zusammengebracht

• Hybridisierung von der passenden mRNA am 5’-Ende des Gens

• S1-Nuklease hinzugegeben: baut alle Einzelstränge ab, auch überstehende Enden des Hybrids

• NaOH-Behandlung: entfernen von RNA (instabil im basischen)

• Übrige Sequenz ist Länge des Genanfangs und TSS

• Gelelektrophorese zur Längenbestimmung

• Oligonucleotid als Primer von transkribierter DNA abgeleitet

• Mit mRNA-Proben gemischt

• Primer bindet im Idealfall an mRNA wo er komplementär ist

• reverse Transkriptase erstellt cDNA

• Bestimmung der Länge des Syntheseprodukts

• Länge der cDNA entspricht dem Abstand von dem Primer bis zum Transkriptionsstart

• etwa 60 Nukleotide

  • 35 stromaufwärts vom TSS (-35)

  • 25 stromabwärts vom TSS (+25)

• TATA-BOX zwischen -26 und -34 vor Startpunkt

  • typisch für regulierte Gene

  • 30% aller humanen Gene

• Startnukleotid (meist A) liegt in Initiator-Box (INR)

  • Pyrimidinreich

• GC-Boxen mit/ohne DPE (downstream promotor element)

  • 40 - 45% aller Gene mit GC-Boxen

  • Cytosin kann methyliert werden (Aktivierung)

• MTE (motif ten element)

• BRE (TFIIB recognition element dowstream or upstream)

• GTFs (generelle Transkriptionsfaktoren) grundsätzlich für Start benötigt

= generelle Transkriptionsfaktoren

• von RNA-POL II für positionsgenaue Bindung und Effizienz benötigt

• Leucin-Zipper-Motiv

  • zwei α-Helices, die durch Wechselwirkungen zwischen hydrophoben Aminosäure-Seitenketten (oftmals von Leucin) zusammengehalten werden

• Helix-Turn-Helix (HTH)

  • zwei α-Helices, die über eine kurze ausgestreckte Aminosäurekette (Turn) verbunden sind

• Helix-Loop-Helix

• Zinkfinger

• Coiled-coil

= ein Motiv von DNA-bindendenen Proteinen

• enthalten ein oder mehrere Zinkmoleküle als Strukturkomponente

• Beispiel: GC-Box-Protein Aktivator

  • Wichtige Rolle bei Einleitung der Transkription, besonders an Promotoren ohne TATA-Box

  • Protein:

• Zinkfinger in DNA-Bindedomäne treten in Wechselwirkung mit DNA

• intragenische regulatorische Elemente

  • Teile des Promotors im Gen anstatt davor!

• regulatorische Elemente stromaufwärts

• genauer und effizienter Start

• Aufbauphase

  • Präinitiationskomplex (PIC) aufgebaut aus allen Faktoren und POL III

• Funktionsphase

  • Elongation kann stattfinden

• Abbauphase

• Stabilisierung der Bindung von TFII-D an DNA durch TFII-A und -B

• gemeinsam wird TATA-Box erkannt

• Leitung von POL II zum Promotor durch TFII-F

• Steuerung und Anlagerung von TFII-H mithilfe von TFII-E

• TFII-H:

  • Proteinkinase

  • DNA-Helikase: Entwindung DNA, offener Promotor-Komplex

  • ATPase-Aktivität: Energiebereitstellung

• Lokale Aufschmelzung der DNA-Doppelhelix

• Phosphorylierung durch TFII-H führt zum ablösen vom Promotor und Start der Elongation

• Anheften der 7-Methylguanosinkappe am 5’-Ende

• Anbringen des Poly(A)-Schwanzes am 3’-Ende

• Entfernen der Inteonsequenzen (Spleißen)

• 7-Methylguanosinkappe

  • Stabilisierung und Schutz vor 5-Exonukleasen

  • Erhöhung der Translationseffizienz im Verlauf der PBS

• 5’-nicht-Codierungsregion

• Codierungsregion (offenes Leseraster)

• 3’-nicht-Codierungsregion

• Poly(A)-Ende

• mRNA-Synthese

• mRNA-Prozessierung

  • 5’-Cap-Struktur

  • spleißen

  • Editing

  • 3-Polyadenylierung

• Chromatinmodifikation- und modelling

• DNA-Reperatur: NER mit TFIIH

Capping

• Anhängen 7-MGTP über Guanosyltransferase an 5’

• Stabilisierung, Schutz vor 5’-Exonuklease

• Erhöhung Translationseffizienz in PBS

Poly(A)-Ende

• AAUAAA als Polyadenylierungssignal

• PAP (Poly(A)-Polymerase) hängt A an

• PAP II (Poly(A)-Bindeprotein) baut Rest ab