Übungszettel 3

Herauslösen von zu trennenden Substanzen aus der chromatographischen Trennstrecke, der stationären Phase. Mobile Phasen sind Elutionsmittel

Gasförmige oder flüssige bewegliche Phase, die den Analyten über die chromatographische Trennstrecke transportiert. Nicht mischbar mit der stationären Phase.

Flüssige oder feste unbewegliche Phase, die den Analyten während einer chromatographischen Trennung über viele Gleichgewichtseinstellungen kurzzeitig bindet (bzw. löst) und wieder loslässt (bzw. in mobile Phase entlässt). Nicht mischbar mit der mobilen Phase.

Height Equivalent to a theoretical Plate, gibt die Höhe (in mm) einer theoretischen Trennstufe (oder Bodens) an, H = L/N. Ist die Strecke, auf der sich ein GG einstellt. Maß für die Trennqualität des Phasenmaterials unabhängig von Säulenparametern. Niedrige Trennstufenhöhe H = gute Trennleistung.

• tR = tS + tM (Totzeit)

• tR ist die Gesamtretentionszeit (Rückhaltezeit) eines Analyten bei chromatographischen Trennungen, Summe aus Totzeit und Netto-Retentionszeit.

• tS ist die Zeit, die der Analyt an die stationäre Phase gebunden ist.

• Abk. k‘, wird auch Retentionsfaktor genannt

• k‘ = (tR–tM)/tM = tS/tM.

• Der Kapazitätsfaktor k‘ vergleicht den Analyt relativ mit der mobilen Phase. Ist ein Maß für Wanderungsgeschwindigkeit im chromatographischen System, akzeptable Werte für k‘ sind 1 – 5.

• k‘ = 0 ➔ tS = 0 ➔ Keine Wechselwirkung mit Stationärphase

• k‘ = ∞ ➔ tS = ∞ ➔ Irreversible Bindung an Stationärphase.

• k‘ ist von der Säulenlänge und von der Geschwindigkeit der mobilen Phase unabhängig

• Abk. RS

• gibt an, wie gut zwei benachbarte Peaks getrennt sin

• RS < 1,5: Peaks sind nicht getrennt (verschmolzen)

• RS = 1,5: Peaks sind gerade so getrennt

• RS > 1,5: Peaks sind basisliniengetrennt.

• Abk. N, auch Trennstufenzahl genannt

• N = tR 2 /σ 2 = 16·(tR/w)2 ; gibt die Zahl der Gleichgewichte (= theoretischen Böden) an, die ein chromatographisches System für einen Analyten hat. Ist N hoch, dann stellen sich viele GG ein und man hat eine gute Trennleistung (also schmale und hohe Peaks).

Der Verteilungskoeffizient Kd beschreibt, wie sich eine Substanz zwischen zwei (nicht mischbaren) Phasen verteilt, gleiche Volumina der Phasen vorausgesetzt. Kd beschreibt den theoretischen Gleichgewichtszustand.

• Abk. w, dies ist die Peakbreite am Schnittpunkt der Peakflanken (oder auch der Wendetangenten) mit der Basislinie des Chromatogramms

• Bei einer Gauß-Verteilung gilt: Basispeakbreite w = 4·σ; w wird in min oder cm angegeben.

Die Fläche unterhalb eines Peaks bis zur Basislinie kann integriert und somit als Wert angegeben werden. Die Integration erledigen Integratoren oder PCs. Ein chromatographisches System kann mit Peakflächen von geeigneten Standardlösungen für eine quantitative Auswertung kalibriert werden.

• Die Trennung kann über Adsorptions-, Verteilungs- und Ionenaustauschgleichgewichte erfolgen. Größemaufschluss und Affinitätschromatographie.

• Beim Größenausschluss können die Analyten nur in genügend große Poren der stationären Phase, die mit einer stagnierenden flüssigen Phase gefüllt sind, hinein diffundieren, kleinere Moleküle können so von größeren Molekülen getrennt werden.

• Bei der Affinitätschromatographie wird das Schlüssel-Schloss-Prinzip zwischen einem immobilisierten Liganden und einem dazu spezifisch passenden Analyt ausgenutzt. Der Analyt befindet sich dabei im Gleichgewicht mit kompetitierenden Liganden der flüssigen mobilen Phase.

• Die Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase beeinflusst die Peakform und die Effizienz der Trennung. Der Zusammenhang zwischen der Trennstufenhöhe H (wenn klein, dann gute Trennleistung) und der Fließgeschwindigkeit ū wird in der Van Deemter-Gleichung ausgedrückt: H = A + B/ū + C·ū. Die Kurve der Gleichung zeigt ein Minimum bei einer bestimmten Fließgeschwindigkeit ū der mobilen Phase, wo die Trennstufenhöhe H am kleinsten bzw. die Bodenzahl N am größten ist. In diesem Minimum sind also die höchste Trennleistung der Säule und die schmalsten Peaks zu erreichen.

• A-Term, Eddy-Diffusion: Beschreibt den Einfluss der Packung (Korngröße, Korngrößenverteilung) in der Säule auf die Peakverbreiterung.

• B-Term, Longitudinal- bzw. Längs-Diffusion: Die Moleküle diffundieren mit oder gegen die Flussrichtung und eluieren dadurch früher oder später.

• C-Term, Störung der Gleichgewichtseinstellung: Das Verteilungsgleichgewicht eines Analyten zwischen Stationär- und Mobilphase stellt sich mit endlicher Geschwindigkeit ein.

• Eine geringe Strömungsgeschwindigkeit ū wirkt sich beim B-Term negativ aus, dagegen stört eine hohe Strömungsgeschwindigkeit ū beim C-Term. Man muss also ein Optimum für ū finden, um eine optimale Peaktrennung mit schmalen Peaks zu erhalten.

Die Trennstufenhöhe H ist im Gegensatz zur Bodenzahl N nicht von der Länge der Säule abhängig, damit fällt eine Variable, nämlich die Säulenlänge, weg. So kann man in ein van Deemter-Diagramm mehrere van Deemter-Graphen einzeichnen und muss bei verschiedenen Korngrößen einer Säule nicht noch die Säulenlänge berücksichtigen, siehe folgende Abbildung.

• Fließgeschwindigkeit ū: Sollte optimiert werden auf kleinstmögliches H.

• Korngröße (bei gleicher Art der stationären Phase, z.B. RP-C18): Je kleiner die Korngröße, umso größer die Oberfläche der stationären Phase und umso mehr Gleichgewichte stellen sich ein. Je mehr GG bei unveränderter Säulenlänge, desto kleiner wird H.

• Korngrößenverteilung (bei gleicher stationärer Phase): Umso enger (homogener) die Korngrößenverteilung und damit die Packung der Säule, desto geringer wird die Eddy-Diffusion und umso geringer ist die Trennstufenhöhe.

• Je kleiner der Säulendurchmesser, umso geringer sind die Diffusions-Wege derAnalytmoleküle und desto kleiner wird H.

• Durch Optimierung der Eluenten können sich mehr GG einstellen und die Trennstufenhöhe H wird ebenfalls verbessert, also kleiner.

• Adsorption wird durch Anziehungskräfte, die zwischen Stoffen bestehen können, verursacht. Es ist eine reversible Anlagerung von Molekülen ohne feste chemische Bindung. Moleküle stehen in einem Adsorptions-Desorptions-Gleichgewicht zwischen der stationären Festphase und der mobilen Flüssig- oder Gas-Phase bei Adsorptionschromatographie.

• Das Prinzip der Trennung ist, dass unterschiedliche Substanzen verschieden stark an die stationäre Phase adsorbiert werden und durch abwechselnde Adsorptions- und Desorptionsvorgänge verschieden lange benötigen, um die Trennstrecke zu überwinden. Je nach Affinität hält sich eine Substanz mehr in der mobilen Phase auf oder adsorbiert eher an der stationären Phase.

• Typische stationäre Phasen sind Siliciumoxide (SiO2 als Kieselgel; modifiziertes Kieselgel, also Umkehrphasen (RP-Phasen)); Mg-silicat; Mg-oxid; Al-oxid; in der Gaschromatographie nutzt man auch modifizierte Silikonöle (Polysiloxane = organische Verbindungen aus Silicium und Sauerstoff), die von der Polarität mittelbis unpolar sein können.

• Größenausschlusschromatographie funktioniert darüber, dass die Analyten keine Wechselwirkungen mit der sationären Phase eingehen, sondern diese nur durchwandern und von ihrer Größe abhängende Wege durch die Säule durchlaufen. Dabei gilt, dass große Analyten schneller eluieren, da sie eine kürzere Wegstrecke durch das Säulenmaterial zurücklegen, während kleinere Analyten mehr Möglichkeiten besitzen sich im Säulenmaterial zu bewegen (diffundieren ins Säulenmaterial hinein)

• Die Bestimmung der Molekulargewichte erfolgt darüber, dass mit Hilfe bekannter Standardsubstanzen (gleiche Struktur und bekanntes Molekulargewicht) eine Kalibrierkurve (Molekulargewicht gegen Retentionszeit oder Elutionsvolumen) erstellt wird, die dann zur Auswertung herangezogen wird.

Verschiedene Lösemittel für mobile Phasen haben unterschiedliche Elutionskraft im Vergleich zu einer Referenzsubstanz (Kieselgel für Normalphasen und C18 für Umkehrphasen, heißt dann auch RP-C18 oder RP18). Die elutrope Reihe ist die Anordnung der Lösemittel nach Polarität und nach auf- oder absteigender Elutionskraft in Abhängigkeit der stationären Phase.

• sind kovalent durch eine chemische Reaktion mit einem Packungsmaterial (z.B. Kieselgel) der stationären Phase verbunden

• Dabei handelt es sich z.B. um modifizierte Kieselgele, die Alkylreste (C8, C18), NH2-, CNoder Diol-Gruppen statt einer OH-Gruppe besitzen

• Auch flüssige Polysiloxanfilme bei der GC können chemisch an die Kapillare gebunden sein. Eine nicht kovalent gebundene Phase ist z.B. der Wasserfilm auf Cellulosefasern bei der Papierchromatographie.

• versteht allgemein, dass polare OHGruppen von Kieselgel durch chemische Reaktionen (z.B. mit Organohalogensilanen) gegen unpolare Gruppen ersetzt werden (siehe oben). Die stationäre Phase kehrt somit ihre Polarität um (daher der Name!)

• . Durch die chemische Bindung wird die Substituentenauswahl recht groß, so dass man Phasen mit einer gewünschten Polarität (von mittelpolar bis unpolar, je nach angehängtem Rest) erhalten kann.

sind kugelförmige Partikel, welche als Stationärphasenmaterial verwendet werden. Diese haben eine regelmäßige und weniger poröse Kornoberfläche.

• Bei unregelmäßiger und poröser Kornoberfläche ergeben sich breitere Peaks, da die Analyten unterschiedliche Wege durch die Säule nehmen können.

• Bei regelmäßiger und kugelförmiger Oberfläche ist die Streuung der Wege der Analyten geringer und die Peaks bzw. die Gauß-Verteilung werden schmaler.

• Bei kleineren Korngrößen gibt es eine größere spezifische Oberfläche, somit ist die Kontaktfläche Analyt/Stationärphasenmaterial größer und es gibt damit mehr Gleichgewichtseinstellungen. Mehr Gleichgewichte bedeuten schmalere Peaks und damit eine bessere Trennleistung als bei den größeren Korngrößen.

• Bei der Probenvorbereitung muss der Analyt auf eine für das Messgerät geeignete Konzentration gebracht werden, z.B. dies geschieht durch Verdünnung oder Anreicherung.

• Weiter soll mit der Probenvorbereitung störende Matrix verringert oder entfernt werden, um die Analyse störungsfrei durchführen zu können.

• Eine weitere Aufgabe ist das Lösen von festen Analyten in geeigneten Lösemitteln, um diese chromatographisch analysieren zu können.

Eine Probe besteht aus dem Analyt bzw. den Analyten und der Matrix.

Der Proben-Blindwert heißt auch Leerwert und enthält die Matrix der Probe ohne den Analyt bzw. die Analyten und Reagenzien (z.B. in der Photometrie). Mit dem Proben-Blindwert kann man feststellen, ob weitere Probenbestandteile die Analyse stören. Bei der Chromatographie könnte z.B. ein Probenbestandteil zur gleichen Zeit wie der Analyt eluieren und fälschlicherweise als Analyt-Peak aufgefasst werden