Enzyme

• dient der Lokalisation und Verlaufsskontrolle von Erkrankungen und macht ca. 50% der Untersuchungen in der klinischen Chemie aus

• Enzyme sind fast immer Eiweiße, die chemische Reaktionen in biologischen Systemem extrem beschleunigen können, ohne dabei selbst verbraucht zu werden. Sie werden auch Biokatalysatoren genannt. Ohne Enzyme könnte unser Stoffwechsel nicht ablaufen

• Die Vermehrung (seltener die Verminderung) bestimmter Enzyme im Blut kann ein Hinweis auf bestimmte Krankheiten sein. Bestimmungen der Enzymaktivität im Blut sind daher häufig Teil einer Laboruntersuchungen. Selten bestimmt nach Enzyme in anderer Proben (Harn, Stuhl)

• Enzyme werden in der Labormedizin auch als Hilfsmittel bei der Bestimmung anderer Laborwerte (z.B. Blutzucker oder Harnsäure) eingesetzt. Auch Antigen- Antikörper Reaktionen kann man durch Kopplung mit einer enzymatischen Farbreaktion sichtbar machen

• durch die Enzymkinetiken, deren wichtigste Faktoren die Substratkonzentration (S), die Reaktionsgeschwindigkeit (v), die Michaelis- Konstante (Km) und die Maximalgeschwindigkeit (Vmax) sind

• Enzyme sind Biokatalysatoren- welche die Aktivierungsenergie biochemischer Reaktionen herabsetzen und so Prozesse ermöglichen, die normalerweise unter den Bedingungen des menschlichen Körpers überhaupt nicht oder wesentlich langsamer ablaufen würden

• Die Enzymwirkung kann eine Reaktion Millarden- fach noch viel mehr beschleunigen. Viele Stoffwechselvorgänge in unserem Körper würden ohne Enzyme praktisch nicht ablaufen können. Reaktionen, die nur Millisekunden brauchen, würden ohne Enzyme Jahre benötigen

• So können Reaktionen bereits bei 37°C Körpertemperatur ablaufen- viel schneller als normal. Für diese Temperatur sind viele dieser Biokatalysatoren optimiert- der Grund dafür , dass viele davon in der Kälte oder bei Fieber nicht mehr zuverlässig funktionieren

• alle Enzyme sind kompliziert gebaute Proteine. Für ihre Spezifität für bestimmte biochemische Reaktionen sorgt ihr aktives Zentrum. Es hilft bei der Bindung des Substrates, ähnlich wie ein Schlüssel nur in ein bestimmtes Schloss passt (Substratspezifität)

• Gelangt ein Substrat (Edukt) in diese Enzymtasche (aktives Zentrum), erfolgt dort eine chemische Reaktion. Das Ergebnis ist ein Produkt, das eine veränderte Struktur hat. Dabei verändert sich das Enzym selbst nicht- ein charakteristisches Merkmal aller Katalysatoren

• der Stoff, dessen Reaktion/Umsetzung das Enzym beschleunigt, nennt man das Substrat

• der Stoff, der bei einer Enzym- vermittelten Umwandlung entsteht, nennt man das Produkt

• die ENdung des Enzymnamens ist im Allgemeinen “- ase”

• Der erste Teil des Namens sagt oft etwas über das Substrat des Enzyms aus (z.B. Lipase: das Fett- (Lipid-)spaltende Enzym der Bauchspeicheldrüse)

• Aber auch das Produkt kann im Namen aufschienen (z.B. Glutamat- Pyruvat- Transaminase = GPT, die in der Leber vorkommt und heute ALT genannt wird)

• Diese Wirkungsspezifität wird auch zur Einteilung der Enzyme in verschiedene Klassen genutzt. So katalysieren die Oxidoreduktasen Redoxreaktionen und die Hydrolasen spalten Substrate durch Einbau von Wasser

• plasmaspezifische Enzyme

  • Enzyme, die ihre Funktion im Plasma entfalten z.B. CHE, Prothrombin

• Zellenzyme

  • Intrazellulärer Herkunft, bei Zellschädigung gelangen sie ins Blut z.B. Transaminase, AP, Lactatdehydrogenase

• Enzyme exokrine Drüsen

  • (Schweißdrüsen, Speicheldrüsen) z.B. Amylase, Lipase

• Oxidoreduktase

  • Enzyme der Reduktion und Oxidation z.B. LDH, GLDH

• Transferasen

  • Gruppenübertragene ENzyme, bei denen ganze funktionell Gruppe (wie Phosphatgruppe) von einem Molekül auf ein anderes Übertragen werden z.B. ALT, AST

• Hydrolasen

  • Katalyse von hydrolytischer Spaltung, bei denen eine chemische Bindung entweder unter Wasseraustritt entsteht oder unter Wasseranlagerung gespalten wird, z.B. Lipasen, Amylasen

• Lyasen

  • Katalysieren Molekülspaltungen, bei denen chemische Bindungen ohne Energieverbrauch gespalten oder gebildet werden z.B. Aldolase

• Isomerase

  • Katalysieren Umlagerungen innerhalb eines Moleküls z.B. Triosephosphat- Isomerase (beschleunigt die Umwandlung einer Ketose in eine Aldose)

• Ligasen

  • Zwei Moleküle werden unter Energieverbrauch miteinander verbunden z.B. Carboxylasen

Makroenzyme

• aufgrund der hohen Molmasse und dadurch eingeschränkter Clearance kommt es häufig zu mäßig erhöhten, persistierenden und isolierten, klinisch unerklärlichen Enzymaktivitätsanstiegen

• Ohne Krankheitswert, brauchen länger zum Abbau (evtl. falsch zu hohe Werte der Enzyme)

• Sind verbunden mit Immunglobulinen (z.B. AP, AST, LDH), Lipoproteine (GGT, Lipase) oder in Form als oligomere Form des Enzyms (Makro- CK)

Isoenzyme

• Enzyme, die dieselbe Reaktion katalysieren, aber unterschiedliche molekulare Strukturen, physikalische, biochemische und immunologische Eigenschaften aufweisen ( und z.B. von unterschiedlichen Organen oder Geweben exprimiert werden)

• es erfolgt keine Bestimmung der Enzymkonzentration, da diese unwägbar klein ist, sondern die Messung der Enzymakivität

  • man misst, mit welcher Geschwindigkeit ein angebotenes Substrat von der dazugehörigen Enzym- Art umgesetzt wird. Reaktionsspezifität und Substratspezifität müssen beachtet werden!

• Hierbei kann entweder die Abnahme oder die Zunahme des bei der Reaktion verbrauchten bzw. gebildeten Produktes gemessen werden

• Die gemessene Enzymaktivität wird in der Internationalen Einheit Unit angegeben

• 1 Unit (U) setzt 1 min 1 mikromol Substrat unter definierten Bedingungen um

• In der klinischen Chemie wird laut internationaler Einheit auf Liter bezogen: U/l

• Alternativ 1 mikrokat = 60 U/l, d.h. 1 Katal setzt in1 sec 1 mol Substrat um

• Art und Konzentration des Puffers- pH- Wert

  • Bei allen Reaktionen muss eine optimale H- Ionenkonzentration des entsprechenden Enzyms vorliegen= Puffermilleu -> falscher pH= hemmender Einfluss

• Reaktionstemperatur

  • Nach den neuesten Richtlinien werden Enzyme nur noch bei 37°C gemessen; damit verbunden war auch eine Änderung der Referenzbereiche

• Eventuelle Anwesenheit und Zwischensubstraten

  • (Coenzyme) z.B. NAD oder NADP und Aktivatoren bzw. Inhibitoren

• Reaktionszeit und Zeit der Messung

  • Da die Reaktionsgeschwindigkeit im Verlauf der Reaktion nicht konstant bleibt sondern mit abnehmender Substratkonzentration langsamer wird, muss man, wenn man die Reaktionsgeschwindigkeit als Maß für die Aktivität verwenden will, einen Zeitpunkt definieren,an dem sie bestimmt wird. Damit kommt der Start der Reaktion in Frage also der Moment, wo alle für die Reaktion erforderlichen Parameter zusammentreffen. Unter der Vorraussetzung eines Substratüberschusses bleibt die Reaktionsgeschwindigkeit zunächst für eine mehr oder weniger lange Zeit konstant

• Art und Konzentration des Substrats im Testansatz

  • Es muss hierbei die Substratspezifität des zu bestimmenden Enzyms berücksichtigt werden, ebenso die Substratkonzentration -> die Enzymakitvität muss sich maximal entfalten können und nicht infolge eines Substratmangels eine zu geringe Enzymaktivität vorgetäuscht wird

• V Null ist die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion. Also die Geschwindigkeit, bei der noch kein Produkt verhandeln ist, aber dafür noch die maximale Substratkonzentration

• V max ist die maximale Geschwindigkeit, die die Reaktion erreichen kann. Sie ist erreicht, wenn alle Enzyme mit jeweils einem Substrat besetzt sind. Ab hier beeinflusst die Menge des Substrats die Reaktionsgeschwindigkeit nicht mehr, weil alle Enzyme bereits okkupiert sind und der Sättigungszustand erreicht ist. Erst, wenn mehr Enzyme hinzugegeben werden, die dann wieder Substrat binden könnten, würde sich die Geschwindigkeit erhöhen

• S ist die Menge an Substrat, die bei der Reaktion zur Verfügung steht

• K m ist die Michaelis- Menten- Konstante. Bei ihrem Wert ist genau die Hälfte aller, an der Reaktion beteiligten Enzyme mit einem Substrat besetzt

• V Max und K m sind beide nicht abhängig von der Substratkonzentration. Sie sind Enzymeigenschaften beziehungsweise Enzymkonstanten. V max ist abhängig von der vorgegebenen Enzymkonzentration. K m ist eine echte Enzymkonstante, die für jedes Enzym gilt, unabhängig von der Konzentration der Enzyme oder Substrate

• Substratspezifität und Substratkonzentration lassen sich durch die Michaelis Konstante objektivieren und sind experimentell festgelegt

• Die Michaelis Konstante ist eine für jedes Enzym- Substrat- Paar charakteristische Größe

• Die Michaelis Konstante K m entspricht der Substratkonzentration (mol/l), bei der genau die Hälfte der Enzyme mit einem Substrat besetzt sind und so die Enzymareaktion mit halbmaximaler Geschwindigkeit (V max) abläuft und dient zur Abschätzung, wie schnell eine Substanz im Körper umgebaut wird

• Hat K m einen großen Wert, braucht man viel Substrat um die halbmaximale Geschwindigkeit zu erreichen, da die Enzymaffinität für das Substrat sehr niedrig ist

• Hat K m einen kleinen Wert, braucht man hingegen sehr wenig Substrat, um die halbmaximale Geschwindigkeit zu erreichen, das das Enzym sehr affin ist

• K m wird in mol/l angegeben

• am Verbrauch eines von der Enzymreaktion umgesetzten Substrates

• an der Bildung eines aus der Enzymreaktion hervorgehenden Produktes

Der optisch- enzymatische Test ist ein photometrisches Messverfahren, das der Akitvitätdbestimmung von Enzymen oder der Bestimmung von Substratkonzentrationen unter Zuhilfenahme von Enzymen dient. Voraussetzung ist, dass alle an der Reaktion beteiligten Stoffe im Überschuss vorliegen müssen, die Messung im pH- Optimum erfolgt sowie auf eine standardisierte Temperatur geachtet wird

• hier ist das Enzym in der Lage, das Substrat unter Anwesenheit des Coenzymes NAD+ (Nicotinamid Adenin Dinucleotid) direkt umzusetzen und damit die Oxidation oder Reduktion es Coenzyms unmittelbar durchzuführen. Solche Test sind auf NAD bzw. NADP abhängige Dehydrogenasen beschränkt, z.B. Lactata- Dehydrogenase, Glucose- 6P- Dehydrogenase

• Grundlage ist dabei die Änderung des Absorptionsmaximums des Cofaktors. In der reduzierten Form als NADH liegt das Absorptionsmaximum der Cofaktoren bei 340 nm; komm es zur Oxidation liegt es bei 260 nm. Diese Änderung wird mittels eines Photometers gemessen

• zusammengesetzt optische Tests müssen dann angewandt werden, wenn die Testreaktion selbst nicht von einer NAD bzw. NADP abhängigen Dehydrogenase katalysiert wird. In diesem Falle muss der Testreaktion eine Indikatorreaktion nachgeschlagen werden, in der ein Produkt der Testreaktion in einer NAD bzw. NADP abhängigen Reaktion oder einer anderen photmetrisch quantifizierbaren (Farb)- Reaktion weiter umgesetzt wird.

• Beispiel: Triglyceridbestimmung im Serum (GPO- PAP- Methode)