Proteinreinigung

• Deutsches AMG

• Bestimmt unter anderem

  • Anforderungen an die Arzneimittel und Verordnungen für deren Herstellung

  • Sicherung und Kontrolle ihrer Qualität

• Ist eine Sammlung anerkannter pharmazeutischer Regeln über die Qualität, Prüfung und Lagerung, Abgabe und Bezeichnung von Arzneimitteln und den bei ihrer Herstellung verwendeten Stoffen

• Zuständig ist die Arzneibuch-Kommission beim Bundesinstitut für Arzneimittel- und Medizinprodukte bzw. die europäische Arzneibuch-Kommission

• Rekombinante Proteine, die mit Hilfe von Bakterien, Hefen oder Säugerzellen gewonnen werden

  • Impfstoffe, Diagnostika, Antikörper, andere Proteine für die Therapie

• Downstream Processing

• Umfasst alle Schritte zur Gewinnung des Wirkstoffes vom Ende seiner Fermentation bis zur Bulkware als keimarmer Wirkstoff mit einer Reinheit von mehr als 99%

• Prozess möglichst ökonomisch gestalten – Wie kann das erreicht werden?

• Anzahl der Aufarbeitungsschritte erniedrigen

• Stufenausbeute maximieren

• Ziel definieren

• Aufgabe beschreiben

• Informationen zum Zielmolekül einholen Molekülklasse, Molekülcharakteristik

• Welcher Organismus produzierte das Zielmolekül

• Informationen zur Probe, aus der das Molekül separiert werden soll

• Welches Produktionsverfahren wurde eingesetzt

• Welche Analysemethoden sollen eingesetzt werden

• Welche Ressourcen stehen zur Verfügung

• Ladung

• Hydrophobizität

• Affinität

• Löslichkeit/Stabilität

• Molekulargewicht

Durch

• Seitenketten der AS

• post-translationale Modifikationen

• prosthetische Gruppen

• 3-D-Struktur

• entsteht durch ungünstige energetische Situation zwischen hydrophoben Bereichen und dem hydrophilen Milieu

• Nicht-kovalent stabilisiert (ionisch, hydrophob, H-Brücken)

• Kovalent stabilisiert (Disulfidbrücken zwischen Cysteinresten)

• Protein nimmt eine inaktive aber unter Umständen stabile Konformation an

• Reinigung eines Proteins aus einem Kulturüberstand tierischer Zellkulturen bis zu einer Reinheit von mehr als 99 %, ohne Verlust seiner Wirksamkeit

• Ein gering konzentriertes, großes, glycosyliertes Protein, mit korrekter Faltung und ausgebildeten Disulfidbrücken, soll aus einem Kulturüberstand, der u. U. Retroviren enthalten kann, aufgereinigt werden

Für die Aufarbeitung:

• Informationen zur Probe, aus der das Molekül separiert werden soll

• In der Wirkstoffproduktion werden vorzugsweise Medien mit definierter Zusammensetzung benutzt

• Der Einsatz von Serum und tierischer Proteine wird unüblich

• Es können Hydrolysate eingesetzt werden

• Zentrifugation (oft mehrstufig à da kein großer Dichteunterschied)

• Filtration —> im Anschluss an die Zentrifugation

• Produkt muss schnellstmöglich aus dem Überstand entfernt werden, weil Proteasen dieses spalten können

• Viele Proteine mit unterschiedlichen Eigenschaften

• Unter Umständen ähnlich zum Zielprotein

• Unbekannte Eigenschaften

• Auch Nachweis dadurch schwierig

  • i.d.R. HCP Elisa

• Große Ähnlichkeit zum Zielprotein

• Negative Ladung der DNA à positiv geladene Matrix à Ionentauscher

• Viren inaktivieren oder entfernen

  • Inaktivieren durch Medikament

• Niedriger als z.B. in Blutplasma

• Gering —> oft nicht nachweisbar

• Bei rekombinanten Proteinen geringeres Risiko als bei Plasmaprodukten, weil

  • Besser kontrollierbarer Prozess

  • Definierte Ausgangssituationen

  • Höhere Reinheit im DSP

• Trotzdem potentielle Gefahr von Biren in rekombinanten Präparaten

  • Wirtszelle als potenzieller Träger

  • Biologisches Rohmaterial – speziell mit bovinem oder humanem Ursprung

  • Erworbene Viruskontamination während der Fermentation

• „Guideline on Virus Safety Evaluation of Biotechnological Investigational Medicinal Products“

• Drei sich ergänzende Maßnahmen

  1. Zelllinie und anderes Rohmaterial mit tierischem und humanem Ursprung muss getestet werden

  2. Das Potenzial des DSP Viren zu entfernen bzw. zu inaktivieren wird getestet

  3. Das Produkt wird auf Kontamination mit Viren getestet

• Bei “Spiking-Experimenten” wird das Potential DSP Viren zu entfernen, getestet

• Satzkultur (batch culture)

• Periodische Satzkultur (repeated batch culture)

• Zulaufsatzkultur (fed batch culture)

  • Eventuell periodisch

• Kontinuierliche Kultur (continuous culture)

  • Eventuell mit Zellrückführung

• Relativ geringe Produkttiter

• Überstände fallen (periodisch) entsprechend der Wachstumsgeschwidigkeit an

• Längere Kultivierungsdauer

• Relativ hohe Zelldichten/Produkttiter

• Es ist vermehrt mit Zelldebris zu rechnen

• Produkt hat höhere Verweilzeit

• Hohe Zelldichten

• Wenig Biomasse/Zelldebris wegen Zellrückhaltung

• Kontinuierlich anfallende Kulturüberstände

• Große Volumina

• Eventuell instabiles oder empfindliches Produkt

  • Unter Umständen keine Lagerung möglich

• Zum Produkt chemisch verschiedene Proteine und Produktvarianten

• Hohes allergisches Potential

• Nachweis über 2-D-Gele, HPLC-MS, Immunoassay

• Grenzwerte werden individuell von den Behörden bestimmt

• Maßeinheit für die Wirkung, nicht Stoffmenge, eines Präparats

• Für jedes Präparat unterschiedlich

• Wird über Referenzpräparate oder Standards von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) definiert

• z.B. 1 I.E. Insulin = 45,5 µg reines, kristallines Insulin

• Den Aufarbeitungsprozess begleitende Analytik

• UV, pH, Leitfähigkeit

  • on-line-Messung

• Gesamtproteinbestimmung

  • Biuret, Lowry, BCA, UV 

• Bestimmung der Produktkonzentration

  • ELISA, RP-HPLC, UV/Extinktionskoeffizient

• Bestimmung der Produktreinheit

  • SDS-Gelelektrophorese

• Bestimmung des Isoelektrischen Punktes

  • Isoelektrische Fokussierung

1. Prämisse: Jedes Protein ist einzigartig

2. Prämisse: Jede Aufarbeitungstechnik ist einzigartig

3. Prämisse: Um alle Produktanforderungen zu erfüllen, braucht man

   —> Eine gewisse Sammlung an Aufarbeitungsmethoden

   —> Das Wissen um die relativen Stärken und Schwächen der jeweiligen Methode

   —> Man muss in der Lage sein, diese an den Bedarf anzupassen

• Stärken und Schwächen der Aufarbeitungsmethode kennen

• Mit welchem Ziel wird die Methode eingesetzt

• Grundstruktur einer Reinigungssequenz:

• Erster chromatographischer Schritt in einer Reinigungssequenz

• Ziele

  • Weitere Ankonzentrierung

  • Stabilisierung des Produktes

  • Erreichen eines lagerfähigen Zustands

  • Abreicherung grober Verunreinigungen

• „quick and dirty“ – and clever

• Häufig verwendete Capture-Methoden

  • IEX (Ionenaustauschchromatographie)

  • HIC (Hydrophobe Interaktion)

  • Affi (Protein A) à nur bei Antikörpern

• Robuste Methode

• Relativ hohe Kapazität (mg Protein/ml Gel)

• Milde Bindungs- und Elutionsbedingungen

• Einfache Methode

• Relativ preiswert

• Trenneigenschaft messbar (Ladung)

• Relativ gut vorhersagbar

• Grundlage ist eine kompetitive WW zwischen an der Matrix fixierten positiven oder negativen Ladungen und entgegengesetzt geladenen Molekülen

  • Kompetitiv: Molekül kann durch Konkurrenz auch wieder verdrängt werden

• Kationenaustauscher, negativ geladen

  • Sulfopropyl à SP à stark

  • Methyl sulfonat à S à stark

  • Carboxymethyl à CM à schwach

• Anionentauscher, positiv geladen

  • Quaternäres ammonium à Q à stark

  • Diethylaminoethyl à DEAE à schwach

• Schwach bedeutet hier, dass der Ladungszustand in Abhängigkeit vom pH-Wert verändert wird

  • Nur bei einem kleinen Fenster stabil

  • Anders bei stark

• Zu kleine Poren, daher zu geringe Kapazität

• Denaturierende Oberflächenkräfte durch aromatische Kohlenwasserstoffketten

• Entweder gar keine Bindung oder sehr starke Bindung

• Als Trägermaterialien eignen sich auch Dextrane, Agarose und synthetische hydrophile Polymere, Silikate (Mono Q und Mono S von GE)

• Die Ladung eines Proteins ist abhängig vom pH-Wert

• Isoelektrischer Punkt muss bestimmt werden

• Seitenketten der AS

• AS selbst

• PTMs

• Der Isoelektische Punkt (pI) ist die bestimmende Größe für das Retentionsverhalten:

  • pH-Wert liegt über dem pI, Protein ist negativ geladen, Bindung an Anionentauscher

  • pH-Wert liegt unter dem pI, Protein ist positiv geladen, Bindung an Kationentauscher

• Faustregel: eine Bindung wird erzielt, wenn man sich eine pH-Einheit oberhalb oder unterhalb des pI bewegt

• Am pI ist die Retention am geringsten

• Die Selektivität des Anionentauschers ist genau entgegengesetzt zu der des Kationentauschers

• Am pI ist die Menge an postiven und negativen Ladungen gleich

• Die Ergebnisse widersprechen teilweise dem Modell

• Wenn pI bei 8,5 liegt und bei pH 4,5 gearbeitet wird, dann binden alle Proteine mit pI 4,5 bis 8,5

  • Zu viele gebundene Proteine

  • Sehr unspezifisch

• Ziel: in kurzer Zeit möglichst viele Informationen sammeln

• Material sparende Methode

• HTS wird erreicht durch:

  • Miniaturisierung durch Einsatz kleiner Reaktionsgefäße

  • Parallelisierung mit entsprechenden Möglichkeiten zum Transfer der Flüssigkeiten, z.B. Mehrkanalpipetten

  • Automatisierung mit Robotern uns entsprechender Software

• Tatsächlich lässt sich das Modell nur auf weniger als 25 % der untersuchten Fälle anwenden

  —> Warum?

• Es ist möglich, dass der pH-Wert passend eingestellt ist und dennoch nur schwache Bindung stattfindet

  • z.B. schwache Bindung an S-IEX obwohl der pH-Wert unter dem pI liegt

  —> Protein ist vorwiegend positiv geladen

  • Kann darauf hindeuten, dass positive und negative Ladungen in der Bindungsregion gemischt vorliegen und sich dort gegenseitig abstoßen

  —> Bindung wird geschwächt

• Es ist möglich, dass der pH-Wert nicht passend eingestellt ist und dennoch eine gute Bindung vorliegt

  • z.B. gute Bindung an Q-IEX obwohl der pH-Wert unter dem pI liegt

  —> Protein ist vorwiegend positiv geladen

  • Kann darauf hindeuten, dass positive oder negative Ladungen bestimmte Bereiche des Proteins dominieren

• In beiden Fällen liegen gleich viele positive und negative Lasungen (=pI) vor

• Hier zeigt sich eine gute Bindung an den Anionentauscher, wegen der günstigen Ladungsverteilung

• Die Bindungsregion ist bei Anionentauschern und Kationentauschern nicht unbedingt gleich

• Das gleiche Protein kann für einen Kationentauscher eine ganz andere und auch stärker oder schwächer ausgeprägte Bindungsregion haben als für einen Anionentauscher

• Modell ist nicht falsch, aber zu generell

• Die Ladungscharakteristik der aktuellen Bindungsregion ist entscheidend, nicht nur die Nettoladung des Proteins

• Modell zur Optimierung während der Optimierungsphase nutzen

• Nicht wundern, wenn Situationen entstehen, die nicht in dieses Modell passen

• „Ungewöhnliche“ Parameter könnten sich hinsichtlich der Abreicherung von Kontaminanten als positiv erweisen

• Sorgfältige Optimierung lohnt sich

• pH-Wert-Änderung

  • bewirkt Änderung des Ladungszustandes

• erhöhte Salzkonzentration (NaCl)

  • Konkurrenz um Bindungsstellen

• Hofmeisterserie auf IEX angewendet

• Warum kann durch Einstellen des pH-Wertes und Erniedrigung der Salzkonzentration ein erheblicher Produktverlust resultieren?

  • Fällungsprozesse!!!

• Vorsicht bei Diafiltration und IEX-Chromatographie

• Aggregation kann durch Erhöhung der Viskosität verringert werden

  • Es kann z.B. Saccharose zugegeben werden

• Vorsicht bei der Probenvorbereitung für die Chromatographie

• DNA zeigt starke Bindung an Anionentauscher und wird vom Kationentauscher nicht zurückgehalten (flow-through)

• Zu beachten: DNA kann stabile Ladungskomplexe mit stark basischen Proteinen formen (z.B. mit IgM)

• Ladungskomplexen sind eventuell zu groß für die Poren sind

  • Erst nach späterer Dissoziation

• Sanitisierungs–Prozedur so auslegen, dass gebundene Viren garantiert getötet werden!

• Nicht adäquate Equilibrierung ist eine häufige Ursache für missglückte Läufe (üblicherweise mit 10 CV equilibrieren)

  • CV = Säulenvolumen

• Versehentlicher Verlust an Glykoisoformen durch Verteilung der Isoformen innerhalb des Peaks

  • Ein Peak kann mehrere Isoformen abbilden à Schneidecharakteristik

• Notorisches Fouling bei Anionentauschern durch CellDebris, Lipoproteinen, Phospholipiden, Phenolrot, Endotoxinen....– sind negativ geladen und zeigen starke Bindung unter physiologischen Bedingungen

• Hohe Porosität, große Oberfläche, viele Liganden, hohe Kapazität, vorteilhaft für große Biomoleküle

• Soll inert sein

• Wenig unspezifische Bindung

  • Protein soll über Ladung binden

  • Hydrophobizität soll keinen Einfluss haben

• Hohe physikalische Stabilität – hoher Fluss, extreme Salz- und pH-Wechsel möglich

• Hohe chemische Stabilität – gute Reinigung

• Uniforme Partikel, verbessert die Trennung

Reingingssequenz-Grundstruktur

• Ziele

  • Aufkonzentrierung

  • Stabilisierung des Produktes

  • Erreichen eines lagerfähigen Zustandes

  • Abreicherung grober Verunreinigungen

• Ziel: Entfernung weiterer Verunreinigungen

  • Nicht verbrauchte Medienbestandteile

  • Medienzusatzstoffe (z.B. Antischaum)

  • Stoffwechselprodukte der Zellen

  • Host Cell Protein (HCP)

• Ziel: Protein erhält gewünschte Reinheit

  • Entfernung nicht der Spezifikation entsprechenden Varianten

  • Variationen posttranslationaler Modifikationen

  • Aggregate

  • Terminal veränderte Moleküle

• Auswahl der Matrix, insbesondere der Partikelgröße

• Maßstab (scale) in dem man arbeiten will

• Ziel der Separation, z.B. Capture, Purification, Polishing

• Beschaffenheit der Probe

• Totale ionische Kapazität

  • Anzahl geladener funktioneller Gruppen/ml Gel

• Kapazität

  • Anzahl an entgegengesetzt geladenen Molekülen, die ein Tauscher binden könnte

• Verfügbare Kapazität (ist von praktischem Interesse)

  • Anzahl an spezifischen Molekülen, die ein Tauscher unter definierten Bedingungen binden kann

• Dynamische Kapazität

  • Die definierten Bedingungen berücksichtigen auch die Flussrate

• Dynamische Kapazität bei 5% oder 10% Durchbruch

  • Ergibt eine realistische Größe bei Verwendung komplexer Überstände

• Oft abhängig von Fließgeschwindigkeit

• Chromatographie

  • Allgemein, Bindung/Elution

• Historie

• Interpretation von Chromatogrammen

  • Beispiel: DNA-Abreicherung

• Mit wenig plausiblen Ergebnissen umgehen

  • Beispiel: IEX-Aufreinigung von DP12-Ak

• Screening, HTS

• Was ist bei der Probenvorbereitung zu beachten?

  • Beispiel: pH-Wert, Leitfähigkeit erniedrigen à Fällung

• Kapazitätsbestimmung

• Trennung aufgrund unterschiedlicher Hydrophobizitätan der Oberfläche der Moleküle

• Adsorptionschromatographie

• Bindung über hydrophobe Wechselwirkungen

• Erscheint häufig in Kombination mit IEX

• Beliebte Technik in der Proteinreinigung wegen

  • Milden Bindungs- und Elutionsbedingungen

  • Hohe Ausbeuten möglich

  • Hohe Kapazität

• Zusammenlagerung von unpolaren Molekülen in einem polaren Medium

• Spielt eine Rolle, wenn unpolare Moleküle in Wasser gelangen

• Struktur des Wassers wird gestört, weil Wassermoleküle gerne Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden

• Die verdrängten Wassermoleküle orientieren sich neu, um die maximal mögliche Anzahl an Wasserstoffbrücken aufzubauen

• Wenn sich mehrere unpolare Moleküle zusammenlagern, ist die Störung vergleichsweise gering

• Eine hydrophobe Wechselwirkung ist keine chemische Bindung im eigentlichen Sinn – ist ein Entropieeffekt

• Hofstee und Schaltiel:

  • Vergleich mit „self association“ kleiner alipathischer, organischer Moleküle in wässrigem Milieu

• Porath et al:

  • Bindung entspricht einer nicht denaturierenden Salzpräzipitation

• Srinivasan und Ruckenstein:

  • Nehmen an, dass van-der-Waals-Kräfte maßgeblich für die Bindung verantwortlich sind (temporäre Dipole bei polaren Verbindungen)

  —> Vermutlich handelt es sich bei der Bindung zwischen HIC-Ligand und Protein um eine Kombination aller genannten Effekte

• Kombination aus nicht-denaturierender Salzpräzipitation und Chromatographie

• Bindungsbedingungen HIC à Salz hinzufügen

  • Aber welches Salz?

  • Und wie viel Salz?

  • Und warum überhaupt Salz?

• Häufig verwendet für HIC (auch als Fällungsmittel)

• Salzkonzentration verringern

• Zusatz von organischem Lösungsmittel

• Trennung hängt ab von:

  • Hydrophobizität der Matrix

  • Substitutionsgrad der Matrix

  • Verwendetem Salz

  • Temperatur

  • Hydrophobe Eigenschaften des Moleküls

• Erhöhung der Temperatur erhöht die hydrophobe Interaktion

• Temperatur kann Konformation des Proteins ändern

  • Effekte sind komplex

• Einfluss des pH-Wertes muss ermittelt werden

  • Schwer vorherzusagen

• Trennung beruht auf biospezifischer Bindung zwischen Ligand und Zielmolekül

• Adsorptionschromatographie

• Exklusive technik für die Proteinreinigung

• Trennmethode mit der größten Spezifität und Selektivität

• Hydrophobe Wechselwirkungen

• Ionische Wechselwirkungen

• Wasserstoffbrücken

• Van-der-Waals-WW

• Orientierung der beteiligten chemischen Gruppen macht Selektivität und Spezifität aus

• Bindet spezifisch die Fc-Region eines Antikörpers Zellwandprotein von Staphylococcus aureus

• Größe 40 – 60 KDa

• Schützt das Bakterium vor Phagozytose

• Protein G hat analoge Funktion bei Streptococcen

• Relativ hohe Salzkonzentration

• Basischer pH-Wert

• Elution wird meist durch einen reduzierten pH-Wert erreicht (pH 4,5 bis 2,5)

• Zusatz org. Lösungsmittel ist möglich (z. B. 20 – 30 % Methanol), könnte jedoch zu irreversibler Denaturierung führen

• Extreme Bedingungen, um die Bindung zu lösen sind problematisch

• Resultiert vor allen Dingen aus hydrophoben Interaktionen

• Assoziation wird durch 4 Wasserstoffbrücken stabilisiert

• Keine ionischen Wechselwirkungen

• Begrenzte Stabilität

  • Biologisch à Proteasen

  • Chemische Reinigung nur sehr begrenzt mit NaOH möglich

• Preis

  • MAb select: 2030,- € für 25 ml Gel

  • MAb select sure: 2835,- € für 25 ml Gel

• Leaching

  • Führt im Patienten zu immunologischen Sekundärphänomenen

  • Wirkt selbst als Immunmodulator

• Größere Absetzfläche

• Kleinere Absetzwege

• Deshalb bei gleichem Trommeldurchmesser wesentlich höhere Durchsätze

• Die Aufarbeitung biotechnologischer Produkte beschäftigt sich damit, diese mit Hilfe diverser Grundoperationen aus Prozessen der biotechnologischen Stoffumwandlungen zu isolieren und bis zu einer verkaufsfähigen Form zu bringen

• Im Normalfall

  • Stoff aus komplexem Kultivierungsmedium abtrennen und in möglichst reine Form überführen

• Aufarbeitung = „Downstream Processing“

• Grundoperationen = „Unit Operations“

• Hauptsächlich Aspekte der weißen oder industriellen Biotechnologie

  • Produkte der roten Biotechnologie im komplementären Veranstaltungsteil

1. Bereiten der Fermentationsmedien und Anlagen

   —> Stoffbereinigung, Dampfsterilisation, Sterilfiltration

2. Fermentation

3. Zellabtrennung

   —> Sedimentation, Zentrifugation, Mikrofiltration

4. Aufschluss der Zellen

   —> Vermahlen, Hochdruckhomogenisierung, Chemische Lyse, Osmotischer Schock

5. Abtrennung der Zelltrümmer

   —> Zentrifugation, Mikrofiltration, Verteilung w/w-Zweiphasensystem

6. Konzentrierung

   —> Fällung, Ultrafiltration

7. Grobreinigung

   —> Adsorption/Desorption, Chromatographie, Verteilung w/w-Zweiphasensystem

8. Feinreinigung

   —> Affinitätschromatographie, Elektrophorese

9. Entsalzen

   —> Diafiltration, Gelfiltration, Elektrodialyse

10. Konservieren und Formulieren

    —> Aktivkohlefiltration, Sterilfiltration, Gefriertrocknung

11. Inaktivieren der Abwässer

    —> Dampfsterilisation, chemische Sterilisation

• Umfasst Verfahren zur Freisetzung intrazellulär gebildeter Produkte

  • z.B. Proteine, Plasmid-DNA

• Wird mit konzentrierter Biomasse durchgeführt

• Ausgehend von der Isolierung von Proteinen:

  • Können in sehr verschiedener Weise mit der Struktur der Zellen assoziiert sein

• Lokalisation von Proteinen:

  • Extrazellulär (kein Aufschluss nötig)

  • In der Schleimschicht (Kapsel)

  • In/an der Zellwand gebunden

  • An der äußeren Seite der äußeren Membran gebunden

  • In die äußere Membran integriert

  • An der Innenseite der äußeren Membran gebunden

  • Im Periplasma (Gram-negative Bakterien)

  • An der äußeren Seite der Cytoplasmamembran gebunden

  • In die Cytoplasmamembran integriert

  • An der Innenseite der Cytoplasmamembran gebunden

  • Im Cytosol in löslicher Form

  • Im Cytosol als Einschlusskörper

  • An/in Membranen von Organellen

  • In Organellen (Mitochondrien, ER, Golgi, Lysosomen, Peroxisomen, Chloroplasten usw.)

  • Im Zellkern gebunden (DNA-gebunden)

  • In Ribosomen

  • Am Cytoskelett gebunden

• Beinhaltet mindestens eines der folgenden methodischen Ansätze:

  • Zerstörung der Kompartimentierung (Aufbrechen der Zellen und Organellen)

  • Permeabilisierung der Trennmembranen

  • Solubilisierung der Proteine

• Makroskopisch tragen folgende Elemente zur Stabilität der Zellen bei:

  • Zellwand (Polyglucane, -mannane, Cellulose, Chitin etc.)

  • Zellmembranen (Lipide, Phospholipide, Lipoproteine, Liposaccharide etc.)

  • Cytoskelett (Proteine)

• Mechanische Verfahren

  • Vermahlen in Kugel- bzw. Perlmühlen (als Suspension, Zellkonzentrat, Tiefgefriergut)

• Hydrodynamische Verfahren

  • Hochdruckhomogenisierung (als Suspension, Zellkonzentrat)

  • Prallstrahlverfahren (in Suspension)

  • Ultraschallbehandlung (in Suspension)

  • Hydrodynamische Kavitation

• Thermische Verfahren

  • Gefrier-Auftau-Verfahren

  • Erhitzen

• Thermodynamische Verfahren

  • Trocknung

  • Osmotischer Schock

  • Gasentspannung

• Chemische Verfahren

  • Behandlung mit Basen

  • Behandlung mit Säuren

  • Chemische Permeabilisierung mit Tensiden und Lösungsmitteln

• Biologische Verfahren

  • Enzymatische Lyse

  • Autolyse

• Molekularbiologische Ansätze

  • Leaky-Mutanten

  • Sekretionssteuerung

  • Induzierte Lyse

• Kombinierte Verfahren

  • Enzymatische Lyse und Hochdruckhomogenisierung

  • Etc.

• Glas-Perlmühle (Kugeln zwischen 0,5 und 1 mm)

• Prinzip des Aufschlusses besteht in Scherung der Zellen zwischen bewegten (Glas-) Perlen in einer Schüttung von Mahlkugeln bzw. -perlen, die durch besondere Rührwerke in Bewegung gebracht werden

• Gleiches Prinzip wie Mörser

• Meist wird der Mahlbehälter mit Mahlperlen und Biomassesuspension gefüllt und die Maschine für eine bestimmte Zeit angeschaltet, bis der erwartete Aufschluss erreicht ist

• Satzweiser bzw. diskontinuierlicher Betrieb

• Mühlen können aber auch kontinuierlich betrieben werden, wobei die Verweilzeitverteilung natürlich eine nicht zu vernachlässigende Rolle spielen wird

• Geometrie des Mahlorgans

  • Exzentrische Scheiben und Stiftrührer

• Geometrie der Mahlkammer

  • Für den kontinuierlichen Zellaufschluss sollte das Länge-zu-Durchmesser-Verhältnis groß sein, um eine vernünftige Verweilzeitverteilung (möglichst wenig Rückvermischung) zu gewährleisten

• Abmessungen der Mahlkörper

  • Die Mahlperlen (i.d.R. aus Hartglas) sind gewöhnlich kleiner als 1,5 mm

  • Für Laborzwecke sind diese schon einmal 0,2 mm im Durchmesser, für technischen Einsatz jedoch eher 0,4 mm

  • Zu kleine Perlen bereiten Schwierigkeiten, weil ihre Zurückhaltung im Mahlbehälter technisch zu aufwendig werden kann

• Konzentration der Mahlkörper

  • Der Füllgrad beträgt gewöhnlich 80 % (Schüttvolumen Mahlkörper pro Gesamtvolumen der Mahlkammer)

  • Ein Füllgrad von über 90 % führt zu sehr starker Wärmeentwicklung und Maschinenverschleiß

• Biomassekonzentration

  • Trockenmassekonzentrationen von 50 bis 200 g L-1 werden gewöhnlich eingesetzt

  • Einfluss der Biomassekonzentration auf die Aufschlusskinetik scheint gering zu sein

• Temperatur

  • Es wird gewöhnlich im Bereich von 4 - 15 °C gearbeitet

  • Ein spezielles Verfahren arbeitet mit Feststoff, der durch Einsprühen von Biomassesuspension in flüssigen Stickstoff gewonnen wird

  • Kühlraum oder effektive Kühlung

• Rührerdrehfrequenz

  • Industrielle Apparate besitzen Drehfrequenzen im Bereich von 1.000 bis 2.500 min-1

  • Laborapparate können Drehfrequenzen bis 6.000 min-1 aufweisen

  • Oft wird stattdessen die Umfangsgeschwindigkeit des Mahlorgans angegeben

  • Ein Leitwert für diese Größe ist etwa 10 m s-1

o   In Hochdruckhomogenisatoren wird die Zellsuspension durch Erzeugung hohen Drucks durch enge Spalte gepresst

o   Das Prinzip des Zellaufschlusses basiert auf hydrodynamischer Scherung und schlagartiger Entspannung

• In diesem Verfahren wird die Zellsuspension mittels hohen Drucks durch Düsen beschleunigt

• Der Freistrahl wird entweder auf eine feste Oberfläche gerichtet (einfacher Prallstrahl) oder zwei Freistrahlen werden aufeinander gerichtet (Gegenstromprallstrahl)

• Der Aufschluss wird durch die intensive Turbulenz im Prallbereich der Flüssigkeitsstrahlen bewirkt

• Für dieses Verfahren wird die Zellsuspension in flüssigen Stickstoff gesprüht und die sich bildenden Feststoffteilchen werden in den üblichen Perlmühlen vermahlen

• Sehr aufwändiges, aber auch schonendes Verfahren, weil es bei tiefen Temperaturen durchgeführt wird

• Verpressung gefrorener Zellpaste ist Grundlage

• Zellmasse von -25 bis -30 °C wird unter einem Druck bis 550 MPa durch Schlitze oder Düsen gepresst

• Probleme bereiten der Substanzverlust durch Eiskristalle und die 20 %ige Volumenänderung beim Übergang von Eis I in Eis III

• Gängige Apparate für den Laborbereich sind die Hughes- und die X-Presse

• Vorteile des Verfahrens sind, dass selbst S. cerevisiae in einem Durchgang zu 90 % aufgeschlossen werden kann und dass wenig kleine Bruchstücke gebildet werden

• Beschallung von Suspensionen mit Ultraschall ist die Standartmethode für Gesamtaufschluss im Labor

• Methode basiert darauf, dass im Schallfeld eines Piezokristalls, der mit einer Frequenz von 15 - 25 kHz schwingt, Kavitation auftritt

• Kavitation bezeichnet das Auftreten von Gas- bzw. Dampfblasen in Flüssigkeiten

• Dampfblasen implodieren im Schalldruckmaximum und führen zu intensiver Scherung der Zellen

• Hohe Viskositäten und Kohlendioxid verhindern die Kavitation

• Aufschlusseffekt ist proportional zur eingestrahlten Energie (60 - 200 W) und hängt vom mittleren Volumen der Zellen ab

• Probleme mit dieser Technik sind:

  • Starke Wärmeentwicklung durch Energiedissipation

  • Auftreten lokaler Temperaturspitzen

  • Erzeugung freier Radikale

  • Die Zelltrümmer sind sehr fein, was deren Abtrennung erschwert

• Wenn Flüssigkeiten durch Rohreinengungen beschleunigt werden, so wird der statische Druck des strömenden Mediums im Einengungsbereich herabgesetzt (Gesetz von Bernoulli)

• Dies führt im Extremfall zur Kavitation, was für den Zellaufschluss genutzt werden kann

• In entsprechenden Verfahren wird die Zellsuspension durch Ventile gefördert

• Der Energiebedarf scheint geringer zu sein im Vergleich zu anderen Verfahren

• Ein Einsatzfall ist der Aufschluss von Alcaligenes eutrophus zur PHBExtraktion (PHB = Polyhydroxybuttersäure) durch die ICI

• Sonst liegen wenig Daten vor; es gibt aber durchaus neueres Interesse

• „Esoterisches Design“

• Prinzip (Frazer, 1951) beruht darauf, dass die Zellsuspension mit Gas (N2, CO2) bei hohem Druck (30 - >100 bar) gesättigt wird

• Explosionsartige Entspannung setzt das gelöste Gas wieder frei, wodurch Zellen durch sich intern bildende Gasblasen zerrissen werden

• Geschwindigkeit der Entspannung und der Löslichkeitsunterschied des Gases sind entscheidende Größen

• Technik wird zur Präparation von Organellen genutzt

• Sonst liegen wenig Erfahrungen mit dieser potenziell gefährlichen Technik vor

• Rührwerkskugelmühle

  • Braucht am wenigsten Energie

• Hochdruckhomogenisator

  • Mittlerer Energieeintrag

  • Wirkt sich bei zu viel Energie negativ aus

• UIltraschallhomogenisator

  • Energieeinbringung ist am höchsten

• Kostengünstige Methode

• Für technischen Maßstab geeignet (besonders kleine Moleküle)

• Anwendbarkeit hängt jedoch von vielen Faktoren ab und ist nicht vorhersagbar!

• Wirkungsweise beruht auf einer Veränderung der Zellwandstruktur (Aufbrechen), die eine nachfolgende Extraktion ermöglicht

• Die Haupteinflussgrößen sind:

  • Trocknungsgeschwindigkeit (langsames Trocknen (z.B. im Luftstrom) besser geeignet, Gefriertrocknung eher von Nachteil

    • Austausch des Wassers gegen organische Lösungsmittel à Aceton, Ethanol - bei -5 bis -10 °C wird angewandt

  • Wahl des Extraktionsmittels, pH 8 - 9 besser als pH < 7

    • Zusatz von organischen Lösungsmitteln und Detergenzien

  • Temperatur während der Extraktion, 2 - 5 °C gebräuchlich im Fall labiler Proteine

    • Wenn aber z.B. bei 40 - 45 °C gearbeitet werden kann, wird die Extraktion wesentlich beschleunigt

• Prinzip dieser Methode beruht auf der Bildung von Eiskristallen während des Einfrierens

• Daher ist langsames Einfrieren angebracht

• Verfahren liefert aber gewöhnlich schlechte Ausbeuten und wird daher selten oder vornehmlich im Labormaßstab genutzt

• Protokoll

  • Einfrieren auf Trockeneis oder im Ethanolbad

  • Auftauen bei RT oder 37°C

  • Mehrmals hintereinander!

  • Besonders für tierische Zellen geeignet

• Werden Zellen höheren Temperaturen ausgesetzt, führt dies zur Lyse der Zellen (sog. Autolyse)

• Gefahr, dass Zielproteine geschädigt werden

• Verfahren ist daher für die Freisetzung temperatur-stabiler Proteine besonders geeignet

• Im großen Maßstab wird das Verfahren oft in Kombination mit erhöhtem Druck genutzt

• Beispiele: Extraktion von PHB aus Ralstonia eutrophus, Herstellung von Hefeextrakt

• Verfahren beruht darauf, die Zellen mit hohen Konzentrationen niedermolekularer Stoffe zu equilibrieren, um sie dann fast reinem Wasser auszusetzen

• Wasser dringt in die Zellen ein, was zu einem Druckanstieg im Innern der Zellen führt, wodurch diese zum Platzen gebracht werden können

• Prinzip beruht also auf der Wirkung des osmotischen Drucks

• Trennt eine semipermeable Membran eine Lösung von reinem Lösungsmittel und ist die Membran nur für das Lösungsmittel durchlässig, so ist ein Ausgleich der Konzentrationen (eigentlich des chemischen Potentials) nur durch Verdünnung der Lösung möglich

• Permeation des Lösungsmittels führt zum Druckanstieg in der Kammer des Lösungsmittels

• Besonders geeignet für:

  • fragile Zellen (Gram-negative Bakterien, Algen, Protozoen)

  • Halophile (Salztolerante)

  • Mikroorganismen Gram-negativen Bakterien, wenn selektiv periplasmatische Proteine freigesetzt werden sollen (—> Standardmethode)

• Amphiphile Stoffe werden hauptsächlich zur Solubilisierung von Membranproteinen eingesetzt

• Allgemein bewirken Detergenzien die Zerstörung der Plasmamembranen durch Einlagerung in die Lipid-Doppelschicht

• Umfangreiches Einsatzgebiet

• Problematisch ist oft die Abtrennung der Detergenzien von den Proteinen

  • Müssen nachgewiesen entfernt sein

• Ethylendiamintetraessigsäure

• Standard-Chelatbildner

• Destabilisierende Wirkung von Chelatbildnern beruht auf der Komplexierung von Calciumionen, die die äußere Membran Gram-negativer Bakterien stabilisieren

• EDTA allein reicht aus, um Pseudomonaden aufzuschließen

• Sonst wird es eher in Kombination mit Detergenzien oder lysierenden Enzymen eingesetzt

• Screening von sog. Leaky-Mutanten

• Induzierte Lyse, z.B. durch BRP (bacteriocin release protein) oder Hämolysin

  • Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine durch gram-negative Bakterien

• Steuerung der Sekretion ins Periplasma bzw. ins Medium mit Hilfe von Signalsequenzen - z.B. von SPA, ompA

• Verwendung exportkompetenter Organismen (B. subtilis, Hefen, Pilze), um Export ins Medium zu erreichen

• Batch Adsorption angelehnt an Expanded Bed Chromatographie

• In einen Schritt Zellabtrennung, Konzentrierung und Reinigung

• Kleines Totvolumen

• Guter Fluss

• Perfekte Ad- und Desorption

• Aber: nur partikelfreie Lösungen

• Batch Adsorption

  • Chromatographiematerialien fluidisieren

  • Vorteil: geringer Produktverlust

  • Nachteil: Separation von Adsorbermaterial

• Fluidized Bed Adsorption/Expanded Bed Adsorption

• Hohe Titer

• Man kann direkt mit den Zellen aus dem Bioreaktor arbeiten

• Für alle Zelltypen geeignet

• In einem Schritt Zellabtrennung, Konzentrierung und Reinigung

  • Erspart Zentrifugation

• Reduziert Kosten, Zeit und Produktverluste

• Energieeffizient

• Für partikelförmige Verunreinigungen geeignet

• Geringer Druck und hohe Flussrate

• Zielmolekül wird von den Beads adsorbiert

• Debris/Kontaminanten fließen nach oben