Brors

SNVs = Single nucleotide variants und SNPs = single nucleotide polymorphisms

Bei den SNVs handelt es sich um Änderungen eines Nukleotids während der Lebenszeit eines Individuums, beispielsweise tp53, welches in menschlichen Tumoren oft mutiert ist. SNVs sind deshalb nur auf einzelne Individuen bezogen. SNPs sind dagegen Nukleotidänderungen über eine ganze Population hinweg. Jedes Individuum erhält diesen SNP über Vererbung.

Ein VAF von 0,25 bedeutet, dass 25 % der Reads an der betrachteten Stelle eine andere Base als die Referenzbase hatten. Betrachtet man eine Tumorprobe, würden 100 % bedeuten, dass jede der Proben an der betrachteten Stelle gegenüber der Referenz mutiert ist. Bei 25 % muss man also davon ausgehen, dass von der Tumorprobe die Hälfte nicht-mutierte Tumorzellen sind, da so schon mal 50 % die Referenzprobe aufweisen würden. Von den verbleibenden 50% ist weiterhin sind die einen 25% Tumorzellen mit der Referenz und die andere Hälfte sind Tumorzellen mit der Variante, womit man auf 25% kommt

Vielleicht sind auch die unterschiedlichen anderen Möglichen Fheler bei dem Pileup gemeint Fehlt noch

richitg

Falsch

richtig

falsch

Richtig

Falsch

Richtig

Falsch

Die Bisulfit-Sequenzierung läuft nach einem Schema ab, bei dem zuerst die genomische DNA durch Ultraschall oder Restriktionsenzyme abgebaut wird, und Adapter über verschiedene Protokolle an die Fragmente bindet. Im Anschluss findet die Bisulfit Conversion von unmethyliertem Cytosin statt. Dabei macht man sich die Reaktion von Cytosin mit Sulphonat-Ionen zu Nutze, die über eine hydrolytische Deaminierung und die Desulfonierung zu Uracil reagieren. Bei der Amplifikation wird dann statt des Uracil ein Thymin eingebaut. Die nach der Amplifikation verbliebenen Cytosine sind dementsprechend methyliert gewesen. Die Unterscheidung von Thymin und Uracil wird dabei über die Betrachtung des Doppelstrangs bzw. der reversen Stranges vollzogen. Der Methylierungsgrad setzt sich dabei aus dem Methylation Score des positivem und des negativen Strangs zusammen. Er bildet sich dabei nach:

𝑀𝑒𝑡h_𝑠𝑐𝑜𝑟𝑒𝑐𝑜𝑚𝑏𝑖𝑛𝑒𝑑 = 𝑐𝑜𝑣_𝑝𝑙𝑢𝑠 × 𝑚𝑒𝑡h_𝑠𝑐𝑜𝑟𝑒𝑝𝑙𝑢𝑠 + 𝑐𝑜𝑣_𝑚𝑖𝑛𝑢𝑠 × 𝑚𝑒𝑡h_𝑠𝑐𝑜𝑟𝑒𝑚𝑖𝑛𝑢𝑠 𝑐𝑜𝑣

Das Variant Calling dieser Daten erlaubt es SNV/SNP Informationen und gleichzeitig Informationen bezüglich der Methylierungen aus einem Datensatz zu erhalten. Eine Korrelation zwischen methyliertem und unmethyliertem Zustand an partiell methylierten Position mit heterozygoten SNPs gibt Aufschluss über die Allel-spezifischen Methylierungen.

lokales —> Smith Waterman

globales —> Needleman Wusch

globales —> Needleman Wusch:

• Matches über gesamte Länge maximiert

• entspricht häufig nicht der biologischen Realität

• negative Werte in der Matrix

lokales —> Smith Waterman

• finde Teilsequenz mit maximaler Ähnlichkeit —> Alignment kann überall starten & enden

• negative Werte werden durch 0 ersetzt

Basic Local Alignment Search Tool

gibt die erwartete Anzahl der Hits an, deren Score mind. so groß ist wie der Beobachtete.

—> Wie viele Treffer mit diesem oder höhrerem Score erwartet man aufgrund von zufälligen Sequenzähnlichkeiten?

Single R :

• classification based on correlation of gene expression

• does not rely on previous clutering

• considers a wide range of genes

Manuelle:

• biased approach

• numbers of examnied markers limited

• examination of sequence info of single cells

• higher resolution of cellular differences —> study cellular heterogeneity

• understandig function of a cell in the context of its microenvironment

• discovery of rare cell populations

• in context of health and disease

• cross knock -> Interaktion von Zellen -> Expression von zB Ligand & Nachbar von Rezeptor

  
  

Unique molecular identifier —> random base sequences

Use: tag each transcript -> so that duplicates of the transcipt can be identified after PCR

• einmal 4 ^ 3

• und beim Zweiten 4 ^ 12

sequencing error : UMI is falsely encoded during sequencing —> new UMI —> sequencing errors inflate UMI count

Fehler passiert an verschiedenen Stellen —> mehr verschiedene Moleküle

PCR amplification error: UMI is changed during PCR amplification —> new UMI

Fehler passiert in einem Durchlaud und wird in folgenden Durchläufen amplifiziert —> weniger verschiedene Moleküle

• event —> transcript is expressed in a cell but is not detected in its mRNA profile

• amount of drop out rate is highly technology dependent

• resulting matrix is SPARSE (count matrix besitzt viel mehr Nullen als sie eig haben sollte)

• after filtering out non-informative genes (ca. 15k genes are still present) —> 15 dimension

• reduction of dimensionality by PCA to:

  • reduce computational burden

  • reduce noise of the data

  • visualize data

• Behalten nur der Hauptkomponenten, die die meiste Varianz erklären

• Transformation der Data in PCA

• Nutzen der transformierten Daten für UMAP

PCA —> lineare Methoden

Modularity = Maß für die Aufteilung durch ein Clustering (misst die Stärke der Teilung eines Netzweks in Module (wie Gruppen, Kluster, etc)

Hohe Modularität —> gut : Je höher, desto besser sind die Kluster abgetrennt —> dichte Konnektivität eines Klusters und geringe Konnektivität zu anderen.

Niederige Modularität —> schlecht —> undichte Konnektivität eines Klusters und gute Konnektivität zu anderen.

• bottom up approach/agglomerative clustering —> at initiation each node is by itself and represents a single community

• Phase 1 : Modularity optimization:

  • compute modularity of node i with all neighboring nodes j

  • place i in community where gain of modularity (modularity in newneighborhood compared to current) is maximised

    —> erst für alle Zellen

• Phase 2 : community aggregation:

  • All nodes that belong to the same community are reduced to a single node

    • links between nodes of the same community lead to weightes self-loops

    • weights of the links between the new nodes are given by the sum of the links between nodes in the corresponding communities

    
    

biological:

• sequence several samples from the same cell line

• biological variation typically mich higher than technical noise

• several (6) samples from the same cell line —> control for measurement accuracy and variations in environment and cells’ response

  —> allows for conclusions about the specific cell line

technical:

• sequence same sample twice

• prepare several libraries from the same sample —> control for measurement accuracy

  —> allows for conclusios about JUST THIS sample/ preparation & measuremtn accurac

  —> usually not needed for RNAseq

physical : sonication

enzymatic : RNAse

chemical : divalent metal cation & heat

mainly looking for mRNA:

• searching for Poly-A enrichment

• rRNA depletion (e.g. ribozero)

• side selection for small RNAs

sample prep overview:

• fragmentation

• ligation

• amplification

• GC bias

• contamination

line 1 : @ character is followed by information about the sequecing run

line 2 : raw sequence letters

line 3 : a separator which is simply a + sign

line 4 : encodes the quality values for the sequence in line 2

primary errors: base substitutions due to alignment errors

Illumina : subsitution

Ion torrent : insertions

Nanopore : deletions

PacBio RS : insertions

• allows for detection for introns (first detect exons —> by exclusion introns are known)

• Spliced aligners - STAR (Spliced Transcripts Alignment to a reference):

• based on BWT, looks for longest exact match for each read MMP1 (maximal mappable prefix) --> repeat for unmapped part of read (MMP2) --> works for short & long reads, fast mapping, error tolerant, memory intensive

read count : count the number of reads that map to each gene

read counts must be normalized due to differnt sequencing depths and length of the gene before comparing for gene expression

expression levels ARE NORMALZED READ COUNT VALUES

• negative binomial distribution

• overdispersion: observed dispersion is bigger than expected dispersion —> in that case we have differential expresson

1. retract expression data

2. model by negative binomial distribution

3. size factor estimation

4. dispersion estimation

5. generalized linear model fit

6. statistical test

7. multiple testing correction

advantages:

• ability to resequence the same molecule multiple times for improved accuracy

• ability to sequence molecules that cannot be readily amplified because of extremes because of extremes of GC content, secondary structure

Disadvantages:

• high error rate

• low throughput

• high cost

• base call accuracy

• signal intensity

• singnal to noise ratio

• base position and composition of read

P : error prob of a given base call P err = 10 ^(-Q/10)

Phred score : Q = -10 * log10(P)

• design your experiment

• randomize sample handling as much as possible

• during quality control check for batch effects (PCA, cluster anaylsis)

• normalization

• Evtl. unterschiedliche Genexpression aufgrund der Behandlung -> aber Unterschiede erstmal normal und müssen nix bedeuten

• Vergleich der Daten: log2 fold change, D-value

• Zusätzliche Infos benötigt: libary composition, Dispersion Estimation for variability within group

Gene set enrichment analysis (GESA)

1. Überexprimierte Gene un randked gene list (L) zusammenfassen

2. Spezifisches Gene set (S) zum Vergleich suchen (Datenbanken)

3. Enrichment Score (ES) berechnen -> kummulative Summe wenn Gen in L in S gefunden wurde, ansonsten Reduzierung

mRNA Transkript wird exprimiert in der Zelle, aber mRNA wird nicht detektiert im mRNA Profil

—> Fehlerrate sehr von der Technologie abhängig

—> Matrix wird SPARSE —> viele Nullen

• Q misst den Zuwachs and Modularity wenn der Punkt i dem selben Cluster zugeordnet wird wie Punkt j

Q groß: viele Verbindungen viele Verbindungen zsw i und und dem Cluster von j bestehen

Q kleiner: wenige Verbindungen zws i und dem CLuster von j