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Meth Bio

von Zeynep A.

Welche Eigenschaften von Proteinen nutzt man bei der Trennung mittels einer klassischen zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D-Elektrophorese) aus?

Größe und Ladung der Proteine

Nennen Sie zwei Methoden zur Fixierung von Geweben und Zellen in der Elektronenmikroskopie.

Chemische Fixierung
Cryofixierung

Welche Aussagen zur Gradientenzentrifugation sind richtig (r) und welche falsch (f)?

□ Mit der isopyknischen Zentrifugation können in Dichtegradienten Partikel ähnlicher Größe, die sich jedoch in ihrer Dichte unterscheiden, getrennt werden. (r)

□ Bei der Zonen-Zentrifugation liegt die maximale Dichte des Gradienten oberhalb der niedrigsten Dichte der zu trennenden Partikel. (f)

□ Gradienten in einem Ausschwingrotor besitzen eine geringere Probenkapazität und die Beschleunigungs- und Abbremsphase können kritisch für die Stabilität des Gradienten sein. (r)

□ Gradienten in einem Ausschwingrotor besitzen eine hohe Probenkapazität und erlauben den Einsatz extrem hoher g-Werte. (f)

Neben der chem. Fixierung ist die Cryofixierung zur Erhaltung von Zellstrukturen geeignet. Bei welcher der beiden Methoden entstehen in der Regel weniger Artefakte?

Cryofixierung

Nennen Sie zwei häufig verwendete Chemikalien, die zur Fixierung von Zellen und Gewebe in der Elektronenmikroskopie eingesetzt werden

Glutaraldehyd
Paraformaldehyd
(Osmiumtetraoxid)

Was versteht man unter dem Proteom eines Organismus?

Die Gesamtheit aller Proteine (und deren Modifikationen), die von einem Genom (eines Organismus) synthetisiert werden.

Nennen Sie zwei Ansätze, um mittels quantitativer Massenspektrometrie die Häufigkeit von Proteinen zwischen zwei unterschiedlichen physiologischen Zuständen zu vergleichen.

Metabolic labelling
Protein labelling
(Peptide labelling)

Erläutern sie kurz die allgemeine Vorgehensweise bei der Bilderzeugung durch die elektronenmikroskopische Tomographie. Was ist der besondere Vorteil dieser Technik?

Vorgehensweise:

➢ Ein Objekt wird in mehreren Bildern aus verschiedenen Winkeln aufgenommen.

➢ Vorteil: Werden diese Bilder übereinander projiziert ergibt sich ein dreidimensionales Abbild des Objektes. Einblick in jegliche Schichten der Zelle möglich -> Gesamtbild einer Zelle

Durch welche Eigenschaften von Proteinen wird bei den folgenden Methoden eine Trennung erreicht?

a) Ionenaustauschchromatographie: Ladung

b) Gelfiltration: Größe

c) Affinitätschromatographie: Affinität bzw. Aktivität (Bindungspartnern)

d) Klassische 2D-Gelelektrophorese: Größe und Ladung

Erläutern Sie das grundlegende Prinzip auf dem die Trennung von Proteinen/Peptiden durch chromatographische Methoden beruht.

- Probe wird in der mobilen Phase gelöst und aufgetragen

- Wanderung von geladennen Molekülen im elektrischen Feld

- mobile Phase strömt an einer stationären Phase vorbei

- Auftrennung des Gemischs durch wiederholte Wechselwirkungen der Komponenten mit der stationären Phase und Einstellung des Gleichgewichts mit der mobilen Phase

-Trägermaterialien=stationäre Phase (zB. Agarose)

Von welcher Eigenschaft der Peptide hängt deren Ablenkung im Magnetfeld eines Massenspektrometers ab?

Je leichter ein Teilchen und je höher es geladen ist, desto größer isr seine Ablenkung

Abhängig vom Quotienten Masse/Ladung (m/z) des Teilchens

Nennen Sie zwei häufig in der Biologie eingesetzte elektronenmikroskopische Techniken.

➢ Ultradünnschnitt (Messer schneidet gerade durch das

Gewebe)

➢ Gefrierbruch / -ätzung (Messer schneidet das Gewebe

entlang der Mitte von Membranen)

➢ (Tomographie)

Definieren Sie kurz die Gleichgewichtszentrifugation (isopyknische Zentrifugation) und nennen sie zwei typische Gradientenmedien, die bei diesem Zentrifugationstyp zum Einsatz kommen.

➢ Bei der isopyknischen Zentrifugation ist es möglich Partikel von gleicher Größe, aber unterschiedlicher Dichte aufzutrennen, indem die Partikel im Gradienten dort bandieren, wo das Medium die gleiche Dichte wie der Partikel aufweist. (Bandenmuster im Probenröhrchen)

➢ Gradientenmedien: Saccharose, Cäsiumchlorid

Beschreiben sie in Grundzügen wie man Proteine mit Hilfe von spezifischen Antikörpern lokalisieren und im Licht- oder Elektronenmikroskop sichtbar machen kann.