Sie verwenden Kationenaustauschchromatographie zur Trennung einer Mischung von Dipeptiden. Die Peptidmischung enthält die Peptide RD, AV, DI, WE und KS. Sie eluieren die Dipeptide mit einen NaCl Gradienten (pH 7,4) mit zunehmender Konzentration von NaCl. In welcher Reihenfolge eluieren die Dipeptide ?
Bei der Kationenaustauschchromatographie liegen negativ geladene Gruppen auf der Oberfläche der chromatographischen Säule vor. Es binden positiv geladene (kationische) Gruppen an diese Oberflächen und tauschen dabei mit anderen Kationen. Die Elutionsreihenfolge ergibt sich damit aus der Ladung der Dipeptide, die mit der größten negativen Ladung eluieren zuerst, die mit der größten positiven Ladung am Ende:
DI, WE, AV, RD, KS
Natriumdodecylsulfat (SDS) denaturiert Proteine. Überlegen Sie, warum SDS die Proteinstruktur zerstört. Warum wird SDS in der Gelelektrophorese verwendet? Welche Informationen erhalten Sie wenn Sie ohne SDS in der Gelelektrophorese arbeiten?
Natriumdodecylsulfat (SDS) ist ein anionisches Detergens mit einer geladenen Sulfatkopfgruppe und einer hydrophoben aliphatischen Kette. Es bindet mit großer Affinität an Proteine mit bis zu 1 SDS Molekül pro 2 Aminosäurereste und hebt dabei bestehende Wechselwirkungen im Protein auf. Es denaturiert das Protein. Die zahlreichen negativen Ladungen überdecken die Eigenladung der Proteine – das Ladung zu Masse Verhältnis aller Proteine wird dadurch nahezu gleich. Die denaturierten Proteine können dadurch in der Gelmatrix gut nach ihrer Größe aufgetrennt werden.
Arbeitet man ohne SDS so wird die native Konformation der Proteine erhalten. Auch (einfache) Proteinkomplexe bestehend aus mehreren Proteinketten können so in der Gelelektrophorese getrennt werden. Man spricht von „nativer“ Gelelektrophorese. Allerdings ist diese Art der Gelelektrophorese schwierig durchzuführen und hat geringere Auflösung als die denaturierende Gelelektrophorese.
Einige Proteine wandern in einem SDS Gel anomal. So unterscheidet sich manchmal die Molekülmasse, die anhand eines Gels ermittelt wurde, deutlich von der Molekülmasse aufgrund der Aminosäuresequenz. Wie lässt sich dieser Widerspruch erklären?
Hier kann zum einen eine unvollständige Denaturierung des Proteins vorliegen. Dies hat einen Einfluss auf die Wanderungsgeschwindigkeit im Gel und die aus dem Gel bestimmte Molekülmasse ist damit deutlich verschoben.
Eine andere Möglichkeit ist das die berechnete Molekülmasse nicht mit der tatsächlichen übereinstimmt. Dies kann durch Verlust eines Teils der Aminosäuresequenz durch proteolytische Abspaltung (Verschiebung zu kleinerem Mw) oder durch eine post-translationale Modifikation ( Verschiebung zu größerem Mw) erklärt werden.
Sie trennen eine Mischung von fünf Proteinen. Welches wird als zweites in der Gelfiltrationschromatographie eluieren?
(a) Cytochrome C Mw 13,000 Da
(b) Immunoglobulin G Mw 145,000
(c) Ribonuclease A Mw 13,700
(d) RNA Polymerase Mw 450,000
(e) Serum albumin Mw 66,000
In der Gelfiltrationschromatographie eluieren größere Proteine zuerst. Damit wird b) Immunoglobulin G als zweites Protein eluieren. Dies setzt voraus, dass die Poren-größe so gewählt ist, das Immunoglobulin G noch zum Teil in die Poren eindringen kann
Monoklonale Antikörper können mit chemischen Methoden an einen festen Träger gebunden werden. Erläutern Sie, wie solche mit Antikörpern versehenen Partikel für die Proteinreinigung verwendet werden.
Monoklonale Antikörper binden ein Antigen hochspezifisch an einer bestimmen Stelle (Epitop). Wird der Antikörper an die Oberfläche eines chromatographischen Materials, wie z.B. Sepharose, gebunden, kann eine Affinitätssäule hergestellt werden und für eine Reinigung des Antigens verwendet werden. Die Lösung mit dem Antigen wird auf die Säule aufgegeben, das Antigen wird vom Antikörper gebunden. Alle anderen Komponenten in der Lösung laufen durch die Säule und werden vom Antigen getrennt. Das Antigen kann dann durch Salzlösungen, die die Interaktion des Antikörpers mit dem Antigen aufheben, von der Affinitätssäule eluiert werden.
Zuletzt geändertvor 2 Jahren