Kartenstapel

• von einer Membran umhüllte Reaktionsräume in eukaryotischen Zellen

• Organellen haben bestimmte Funktion in Zelle. Wie kleines Organ.

 Mitochondrien, Chloroplasten und Zellkern haben zwei Membranen, die  anderen alle nur eine.

• Besteht aus Stapeln von Dictyosomen = Zisterne ;

• Funktion:

  • modifiziert Proteine;

  • verarbeitet und verpackt Substanzen, die in der Zelle gebraucht oder von ihr sezerniert werden;

  • Vesikeltransport (packt auch Proteine in Vesikel)

• verbunden mit Raues ER: ER mit Ribosomen als Ort der Proteinsynthese (Translation)

  • Bildung von primären Lysosomen

  • Quasi Durchgangsstation zwischen dem rauen ER und der Plasmamembran.

• Die Proteine werden durch den Golgi Apparat in Vesikel gepackt und durch Mikrotubuli transportiert

• Aus den Ribosomen (raues ER) gelangen die noch unfertigen Polypeptidketten (in Proteinhaltigen Vesikeln) zum Golgi-Apparat.

• Durch Anfügung weiterer Eiweiße werden die Polypeptidketten fertiggestellt,

• daraufhin in Transportvesikel verpackt und zum Bestimmungsort überführt.

Hydrophobe Schwänze: Bestehen aus Fettsäureketten (binden an OH Gruppe vom Glycerin (verestert)Hydrophile Köpfe: Cholin, Phosphat und Glycerin

Nein, Vakuolen haben die Funktion der lysosomen in Pflanzen (können verdauen (enthalten Nucleasen& Proteasen usw.)) --> abbauende Organellen). (In Schulbüchern schon)

• Phagozytierende weiße Blutkörperchen, also Monozyten, bzw Makrophagen.

  • Deren ganze Aufgabe ist das Verdauen von "Dingen" /betreiben viel Phagocytose) wie Krankheitserreger, Proteine oder alte Körperzellen.

  • Deshalb haben sie von den genannten Zelltypen die meisten Lysosomen (Lysosomen enthalten Verdauungsenzyme für körpereigene und -fremde Stoffe); vllt auch mit Immunsystem verbunden

• gehören beide zum Cytoskelett; bei Tieren und Planzen

• Mikrotubuli:

  • lange, röhrenförmige Filamente (dickste zelluläre Faser);

  • Funktionen: Aufbau der Zellteilungsspindel; Organellen- und Vesikeltransport;

  • Bestehen aus einem alpha und einem beta-Tubulin

• Mikrofilamente:

  • lange Fasern,

  • Funktion: Plasmaströmung und Vesikeltransport.

  • Besteht aus zwei Ketten polymerisierter G-Aktin-Monomeren (globuläre Proteine)

Pflanzen: Glyoxysomen oder eher Peroxisomen

Tieren: Mitochondrien

Bakterien: Cytoplasma

• Speicherung: ER als komplexiertes Calcium (z.B. mit Oxalat) als Salze der Oxalsäure

• Funktion:

  • second messenger, leitet Informationen von der Zellmembran zur Zelle.

  • Muskelkontraktion

  • Inhibitor für bestimme Enzyme.

  • Im Cytosol als gelöste Ionen

Da Calcium-Ionen im Cytosol ein wichtiger „second messenger“ sind, spielt die regulierte Freisetzung von Calcium aus dem ER eine Schlüsselrolle für die intrazelluläre Signalgebung. Die Wirkungen einer durch Freisetzung aus dem ER erfolgten Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration sind vielfältig:

•   Enzyme werden aktiviert oder gehemmt,

• die Genexpression wird reguliert,

• in Neuronen wird die synaptische Plastizität beeinflusst,

• in der Muskulatur kontrahieren die Muskelfasern (Calcium-Ionen werden aus dem ER freigesetzt, das in Muskelzellen als sarkoplasmatisches Retikulum (SR) bezeichnet wird),

• Zellen des Immunsystems setzen Antikörper frei usw.

Ja, Granula (fürs Speichern von Stoffen z.B. Fette) und Vesikel (Stoffwechselprodukte werden in Vesikel eingeschlossen und aus der Zelle befördert.)

• Ribosomen sind KEIN Organell (haben keine äußere Membran)

• Eukaryonten: Gesamt 80 S. Besteht aus Große 60S Untereinheit und kleine 40S Untereinheit

• s= (Sedimentationskoeffizient, Einheit Svedberg)

• 80s = sedimentieren schneller als prokaryotische 70s Ribosomen

• Prokaryonten: Gesamt 70S. Besteht aus Große 50S und kleine 30S. Ribosomen sind aus rRna und Proteinen aufgebaut.

• Kernkörperchen; ein oder mehrere pro Nucleus

• beteiligt an der Bildung von Ribosomen (Zusammenbau der ribosomalen Untereinheiten aus Proteinen und rRNA-Molekülen

• Ribosomale Proteine werden zur Synthese der ribosomalen Untereinheiten in den Nucleolus geschleust.

  
  

Eukaryontisch:

• Genomische (gDNA) in linearen Abschnitten = Chromosomen

• Im Zellkern aufgedreht als eine Doppelhelix, auf Histone aufgewickelt im Zellkern

• bsp.: Homo sapiens: Dna Gesamtlänge 97 cm (3 Milliarden Basenpaare)

Prokaryontisch:

• Genomische D NA (gDNA) ist zu einem Ring geschlossen;

• Plasmid DNA

  • extrachromosomaler Ring, häufig mit Resistenzgenen

• bsp: Eschreichia coli: DNA Gesamtlänge 1,5mm (4,7 Milionen Basenpaare)

• Die richtung eines jeden Stranges bestimmt man, indem man die Bindungen zwischen den abwechselnden Phosphat und Zuckergruppen untersucht, die das Rückgrat jedes Strangs bilden

• 5`( also der Strich): bezeichnet die Postion eines Kohlenstoffatoms im Zuckermolekül

• Phosphatgruppen sind mit 3‘-Kohlenstoff des einen Desoxyribosemoleküls und dem 5‘ Ende des nächsten Zucker moleküls verbunden

• Unterschied an beiden Enden der Plynucleotidketten: an einem Ende freie 5‘ Phosphatgruppe (OPO3- 5‘ Ende; am anderen Ende freie Hydroxylgruppe (OH) der Desoxyribose  3‘ Ende

• In Doppelhelix sind 5‘ und 3‘ Enden miteinander gepaart  verlaufen antiparallel

• 5‘ -> 3‘ und 3‘ -> 5‘ plus die komplementären Basenpaare. Der Doppelstrang ist in sich aufgedreht.3‘ = Zucker    5‘ = Phosphat

• am 5’ ende befindet sich ein freier Phosphatrest

• am 3’ ende ist die OH Gruppe des Zuckers frei

• Synthese immer 5’—>3’ Richtung

An der C5 Stelle ist eine Esterbindung und am C3 Kohlenstoffatom auch.

• Phosphodiesterbindung: feste kovalente Verbindung zw. Dem 3‘-Kohlenstoffatom eines Zuckermoleküls und dem 5‘ Kohlenstoffatoms eines benachbarten Zuckermoleküls

• Esterbindung: Alkohol + Säure

Purin: Adenin und Guanin Doppelring 5er und 6er

Pyrimidin: Cytosin und Thymin: einfacher 6er Ring

• Microsatellites (Simple repeats),

• Large duplications,

• Other intergenic DNA,

• Transposons,

• rRNA,

• Introns,

• Genfragmente

• Pseudogene

Adenin 14 %, Thymin 14 %, Guanin 36 % und Cytosin 36 %.

• Histone sind eine Klasse basischer Proteine, die vor allem im Zellkern eukaryotischer Lebewesen vorkommen.

• Basische Proteine besitzen auf ihrer Oberfläche zahlreiche basische Aminosäuren mit positiv geladenen Seitenketten

  • Z.B. Arginin, Histidin und Lysin.

Chromatin ist ein Komplex aus DNA und Histonen (Proteinen). Hieraus bestehen die Chromosomen, Besteht aus zwei Chromatiden.

• Nein, da es Oft mehrere Tripletts gibt die eine AS codieren¸

• nicht genau ein Triplett bildet eine AS sondern mehrere Tripletts können für eine AS vorhanden sein (degeneriert)

• Manche Tripletts werden lieber genommen, um bestimmte AS herzustellen (bei Pro- und Eukaryoten unterschiedlich)

Exons werden transkribiert und translatiert.

Introns werden transkribiert aber herausgeschnitten.

5‘- und 3‘ UTR Region werden transkribiert, aber nicht translatiert.

Core Promotor: Regulationselemente

• Transkription startet am Ende des Promotors (vor 5' UTR) bis Anfang des Terminators --> primärtranskript entsteht

• Introns werden herausgeschnitten --> mRNA

·       Promotor ist andockstelle für Polymerase (RNA Polymerase II); reguliert Ablesen des Gens

·       Cis-Elemente: Abschnitte Stromaufwärts vom eigentlichen Strukturgen; Enhancer und Silencer (können RNA Polymerase in Aktivität unterstützen oder reduzieren)

--> über trans-Elemente (Transkriptionsfaktoren) reguliert: wirken auf D NA-cis Elemente

DNA soll repliziert werden

• Topoisomerase entwindet Doppelhelix

• DNA Doppelstrang wird durch Helicase aufgespalten

• Proteine (Single-stranded binding protein) stabilisieren Einzelstrang

• DNA wird in 5'- 3' Richtung synthetisiert (Strang der 3'-5' ist kann sofort synthetisiert werden) -->D NA Polymerase III hängt Nucleotide an

• 5'-3' D NA Strang: mehrere kürzere Stücke werden in 5'-3' synthetisiert und werden dann verbunden (Okazaki-Fragmente)

  • Primase bildet erst RNA-Primer: DN A-Polymerase III hängt an das 3' Ende des Primers Nukleotide an

  • Polymerase I kommt, hydrolysiert den Primer und ersetzt ihn durch D NA

  • Ligase fügt zusammen

- Zellaufschluss

- Schutz vor Nukleasen (DNasen = DNA abbauende Enzyme)

- Reinigung (Proteine und anderes entfernen)

- Fällung mit Alkohol (Nukleinsäuren werden aus der Lösung gedrängt = Pellet)

- Aufnahme der Nukleinsäuren in Wasser/TE-Puffer (Aufbewahrung)

• Proteinverdau (Proteinase K)

• Ausnutzen der unterschiedlichen Löslichkeit Einsetzen von organ. Lösungsmitteln Phenol, Chloroform;

• —> Proteine sind weniger hydrophil, gehen daher eher in die organ. Phase, während Nukleinsäuren (Phosphatgruppen) in der wässerigen Lösung bleiben.

• Verwendung von Säulen (Chromatographie)  D NA  bleibt an Säulen haften

• Proteinabbau ( Proteinase K: denaturiert Proteine (denaturiert auch DNase (ist auch ein Protein))

• MG 2+ wegfischen

  • Blockierung der DNase (DNA abbauende Enzyme) durch wegfischen von Mg2+, durch EDTA: ist Komplexbildner mit zweiwertigen Kationen —> Kationen werden weggefischt (Chelatkomplexe werden gebildet) (DNase selbst ist Mg2+ abh (hat dies dann nicht mehr zur Verfügung);

• weitere DNAse Inhibitoren

• Scherkräfte bei der Isolierung von hochmolekularer DNA vermeiden! Kann aber auch bei der Isolierung von Plasmid-DNA ein wichtiger Parameter sein! abgeschnittenen Pipettenspitzen, NICHT vortexen, usw

• Bakterien: Isolierung von Plasmid-DNA durch z.B. alkalische Lyse    

  • SDS Natriumdodecylsulfat: anionisches Detergenz, das zur Denaturierung von Proteinen geeignet ist. (Detergenz=(„Reinigungsmittel“), denaturiert Membranen, Proteine)

• Pflanzen= Mörsern (auch mit Protein K aufschlussmedium)

DNA ist durch Phosphatreste negativ geladen = Anion.

—> Die negative Ladung stammt spezifisch von den Phosphaten im Zuckerphosphatteil der DNA-Kette

DNA ist hydrophiler, durch die negativ geladenen Phosphatgruppen

—> Ausbildung von H-Brücken

—> Löslichkeit in Wasser

• UV/Vis Spektroskopie: Mengen von Nukleinsäuren im Photometer bestimmen ((Mengenbestimmung bei 260 nm; Reinheit 260nm/280nm)

• Agarosegelektrophorese (Vergleich mit bekannten Standardmengen „Mass-Ladder“ Menge abschätzen)

• Quantifizierung = Bestimmung der Menge.

Rechnung:

• dsDNA entspricht bei einer OD von 260nm immer 50 Mikrogramm/ ml (verkehrtherumes q und m)

• esDNA enstpricht 40 Mikrogramm/ ml

• esDNA 33 Mikrogramm/ ml

• ein Basenpaar entspricht 650 DA (Dalton), was wiederrumm 650 g/mol entspricht

DNA Menge bestimmen:

• Gerechnet wird die Dichte x Dichte von ds/es DNA/ esRNA bei Extinktion von 1 x (Gesamtvolumen der Lösung geteilt durch Gesamtvolumen der DNA Lösung, welches mit Wasser aufgefüllt wurde) x Verdünnung (wenn vorhanden)

• 0,7 x 50 Mikrogramm/ml x (500:50) = 350 Mikrogramm/ml

• da man am Anfang 200ml DNA Lösung hatte muss man alles noch mal 200 ml rechnen —> 70000 Mikrogramm = 70mg = 0,07g DNA

Stoffmengenkonzentration.

• da wir 1,5kb DNA haben:

  • 1500bp x 650 g/mol = 975000 = 9,75 x 10^5 g/mol

  • da wir in Mikrogramm rechnen wird dies ungewandelt in 9,75 x 10^5 Mikrogramm/ Mikromol

• um die Stoffmengenkonzentration herauszufinden werden wir die Konzentration aus Teil 1 geteilt durch die Molare Masse rechnen (g/mol)

• eigentlich wird die Stoffmenge wie folgt ausgerechnet:

  • c= n/ V —> Stoffmengenkonzentration = Stoffmenge durch Volumen

  • c wird in mol/ L angegeben

  • da wir allerdings kein n haben rechnen wir das ganze ein wenig anders aus

  • c = m/M x V

• 350 Mikrogramm / ml : 9,75 x 10^5 Mikrogramm /Mikromol = 0,0003589744 mikromol/ml = 0,36 Mikromol/ L

• Mikrogramm kann jeweils weggestrichen werden und wif bekommen dann automatisch als Ergebnis die Einheit Mikromol / ml

• Nullen können weggestrichen werden wenn die Einheit zum teil geändert wird

Atomare Masseneinheit oder Molekülgewichtseinheit

Ungefähre Masse eines Wasserstoffatoms

1Dalton=1,66x10-27 kg=1,66x10-24 g (= ungefähre Masse eines Wasserstoffatoms)

1 bp = 650 d Molekulargewicht (650 g/mol)

 1 Nukleotid = ca. 335 d

Molmasse = Teilchenmasse * Avogradozahl 1 Mol Nukleotide (= 6 x 1023 Moleküle = Avogradozahl) entsprechend = 335 g 1 Mol Basenpaare = 650 g 21

• chromatographie im elektischen Feld; Gelmaterial ist Agarose

• biochemische und molekularbiologische Methode, in der Nukleinsäurestränge (RNA oder DNA) durch eine Gelektrophorese nach ihrer Größe getrennt werden, um ihre Größe und Masse durch Vergleich mit DNA-Strängen bekannter Größe zu vergleichen

• Agrarose, Elektrophoresepuffer (Tris-Essigsäure-EDTA-Puffer), Agarose-Moleküle über HBBs quervernetzt, Konzentration der Aggarose bestimmt die Größe der Poren

• Gelelektrophorese fungiert wie ein Sieb, bei dem größere Moleküle stärker zurück gehalten werden als kleine

• Anlegen eines elektrischen Feldes: bewirkt Ionenstrom der genutzetn Elektrolyte, negativ geladene Elektrolyte ziehen zum Pluspol

• Abschätzung der Größe erfolgt durch einer mitlaufenden DNA-Leiter

• Bandenmuster entsteht durch DNA-bindene Farbstoffe (Ethidiumbromid, Kristallviolett, Methylenblau)

• Agarose ist Polysaccharid aus D-Galactopyranose und 3,6- Anhydro-L-galactopyranose

• Nach erhitzen löslich in Wasser, bildet bei Erstarren Matrix mit Porengröße von 100-300 nm Durchmesser

• DNA-Moleküle verschiedener Größe wandern im elektrischen Feld mit unterschiedlichem Tempo hindurch

• Anfärben der DNA mit Ethidiumbromid

Sie wandert in Richtung der Anode, weil diese positiv geladen ist und die DNA negativ.

Positiv

Nach ihrer Größe.

UV-Licht.

• Einsatz interkalierender Substanzen z.B. Ethidiumbromid als Fluoreszenzfarbstoff (sind mutagen; lagert sich zw. Basenpaare in DNA ein)

Damit die Polymerase einen Punkt zum Ansetzen hat. So wird nur ein spezifischer Abschnitt synthetisiert. Für jeden Strang wird ein spezifischer Primer benötigt (da 2 DNA Stränge; lagern sich am 3‘ Ende an).

G und C haben 3 Wasserstoffbrückenbindungen, sind also stabiler.

- 1. Denaturierung der DNA: 30 sekunden bei 94°C

- 2. Primer-Annealing (Anlagerung der Primer): 30 Sekunden bei 52°C

- 3. elongation: bei der opt. Arbeitstemperatur der Polymerase (z.B. 72°C) die Länge dieses Schritts hängt von der Länge des Produkts ab (ca. Polymerase 1 min pro kb)

- 35 weitere Wiederholungen

- 7 Minuten bei 72°C, damit alle unverlängerten Abschnitte fertiggestellt werden können#

• Primer Annealing Temperatur berechnen:

  • wie komme ich überhaupt auf die schmelztemperatur?

    • hierfür Alle C,G,A und T aus dem Primer zählen

    • C und G mal 4 rechnen

    • A und T mal 2

    • Alles zusammenrechnen und dann hat man die Schmelztemperatur

    • diese wird dann minus 3 Grad gerechnet und dann hat man die Annealing Temperatur

  • 55-3= 52°C

1.    Primer: 5’CTGTCCCTGTTGAC3‘ (forward primer)

2.    Primer: TTTGCGGCTGATTT (reverse primer)

—> Komplementär und Rückwärts: 5’AAATCAGCCGCAAA3‘

Primer müssen immer in 5´ 3´ richtung angegeben werden, deshalb muss man den komplementären strang noch in rückwärts angeben

Spezifische Primer:

• Amplifikation (Verfielfältigung) einer bekannten Sequenz

Degenerierte Primer:

• Amplifikation einer unbekannten Sequenz; werden eingesetzt, wenn Primer für unbekannte Gene hergestellt werden müssen.

• basierend auf Sequenzkonservierung bei versch. Anderen Arten

• Gucken wo ein Bereich von AS ist, der nicht von zu vielen Basentripletts codiert wird (Arg, Leu und Ser werden von zu vielen Tripletts codiert deshalb die vermeiden)

• Sequenz sollte bei verschiedenen Pflanzen ähnlich sein, sodass man eine Rückschluss drauf beziehen kann, dass es bei der Pflanze mit der unbekannten NS Sequenz ähnlich sein wird

• Rückübersetzung von Aminosäure- in Nukleotidsequenz

  • Jede AS hat einen Buchstaben zugeteilt bekommen —> lernen!!!

• wenn eine AS von mehr als einem Nukleotidtriplett codiert wird, dann werden die verschiedenen Buchstaben durch Y ( C oder T (Pyrimidine)) , R (A oder G (Purine)) oder N (Inosin - paart mit C>A> G, T (mit allen)) ersetzt

  • BSP:

    • Histidin (his): CAG/CAU —>CAN

    • Serin (ser): AGC/AGU/UCA/UCC/UCG/UCU —> NNN

    • Tyr: UAC/UAU —>TAY

    • U wird immer zu T!!!!

  • Bsp übersetzung:

    • GFAWSWG —> Gly, Phe, Ala, Trp, Ser, Trp, Gly

    • GGN TTY GCN TGG NNN TGG GGN —> N am Ende kann weg

    • GGN TTY GCN TGG NNN TGG GG

• durch die Degeneration des genetischen Codes kommt es zu Ungenauigkeiten

• Primer müssen nicht durch 3 teilbar sein! N am Ende wird nicht gebraucht

• Immer 2 Primer erstellen!!!

  • gucken welche stellen ähnlich sind

  • nicht vergessen; 5`Primer und 3` Primer

  • 3` Primer erst normal (5´ 3´ Richtung) ablesen, dann kommplementär (3´ 5´ Richtung) aufschreiben, dann diesen komplementären Strang rückwärst aufschreiben

DNA isolieren,

PCR (schnell und sauber;aber mehrere Primer nötig, da immer nur kleine Abschnitte vervielfältigt werden können  Amplifizierung eines SPEZIFISCHEN DNA Abschnittes)

Klonierung: große Abschnitte können vervielfältigt werden, aber ungenauer?

Methode zur identischen Vervielfältigung von DNA-Fragmenten: Einbringen des gewünschten DNA-Fragments in einen Vektor mit lebenden Organismen

• ringförmige DNA-Moleküle

• kommen in Bakterien vor

• Plasmide sind Vektoren („Genfähren“: Übertragung von DNA von einem Organismus zum nächsten)

• Beinhalten DNA für Gene.

• Selektionsmarker:

  • ich möchte wissen, ob ein Bakterium das Plasmid aufgenommen hat --> kann mit Markern nachgewiesen werden; z.B. Antibiotika-Res. In Bakterien

  • Bakterien: Antibiotikaresistenz

  • hefe: Autotropher Marker, z.B. Enzym des Aminosäurestoffwechsels

• MCS (multiple cloning site (multiple Klonierungsstelle):

  • viele Schnittstellen für Restriktionsendonuklease enthalten, die jeweils nur einmal in der Sequenz des Plasmids vorkommen

  • dort wird Fremd-DNA eingebracht (Eingefügte DNA-Fragment-Länge: bis 5 kB)

  • Ansatzstellen für Restriktions-Enzyme

• Replikationsursprung (Origin of Replication, Ori):

  • Plasmide können unabh. Vom Wirtschromosom repliziert werden

  • Startpunkt der Replikation,

  • sorgt für die autonome Vermehrung/Replikation des Plasmids,

  • die Stärke des Replikationsursprung regelt die Kopienzahl des Plasmids (bis zu 500 Kopien pro Bakterien-Zelle möglich, high copy

• manche Vektoren enthalten auch noch Promoter zur Expression des eingeschleusten Gens 

In dieses Plasmid wurde Fremd-DNA eingebaut (in MCS).

Vektor = Genfähre

• sind Restriktionsendonucleasen  (Restriktionsendonukleasen hydrolysieren DNA) —> spalten die DNA innerhalb der Sequenz

• Restriktionsenzyme schneiden DNA an von ihnen erkannten spezifischen Sequenzen; schneiden auch Vektoren

• Restriktionsenzyme sollen Bakterien vor eindringender Fremd-DNA schützen

• Unterscheidung zwischen Fremd- und Eigen-DNA erfolgt durch das zugehörige spezifische Methylierungsmuster (schneiden nur unmethylierte DNA)—> DNA in Bakterien ist mytheliert

• Erzeugung von glatten Enden (blunt ends) oder kphäsiven Enden (klebrigen Enden / sticky ends)

• Ereknnungssequenzen: sind Palindrome, hei0t sie können von vorne oder hinten gleichermaßen erkannt werden  

Da sie nur unmethylierte DNA-Fragmente schneiden.--> die chromosomale DNA in Bakterien ist methyliert

Das Enzym erkennt eine spezifische DNA-Sequenz und schneidet an dieser Stelle den Plasmidring eines Bakteriums. Erkennungssequenz GGATCC.; kohäsive Enden (sticky ends) entstehen mit 5‘ Überhängen

Bam = Bacillus amyloliquefaciens H (abbreviation of the bacterial strains from wchich they are isolated)

I = roman numeral indicates the enzyme´s priority of discovery in that strain

typ 2

5 Stück.

Gebraucht werden hierzu …

1. DNA (RNA), die kloniert werden soll

2. Vektoren, die die DNA „eingepflanzt“ bekommen („Genfähren)

3. Restriktionsenzyme, die DNA und Vektoren schneiden

4. Empfängerorganismen, die Vektoren mit DNA eingepflanzt bekommen und  vermehren

5. Selektion der „richtigen“ Zellen, d.h. die die Fremd-DNA enthalten

• Isolation durch beispielsweise Antibiotika-Gebrauch.

• Enzyme: Restriktionsenzyme, Ligase, Polymerase

• mit lebend organismen

Blau-Weiß Selektion (Beispiel-Markergen)

• andere Möglichkeit, Bakterien zu selektieren (keine Antibiotika nötig und mit Auge sichtbar)

• Plasmid enthält lacZ-Gen, das für α-Fragment der β-Galactosidase kodiert (ω-Fragment fehlt noch)

• das vollständige Reporter Gen für beta Galaktosidase , ein Enzym, das X-Gal spaltet wobei blaue Farbe bei raus kommt —> Zucker wird abgespalten, der Farbstoff oxidiert an der Luft und es ensteht ein blauer Farbstoff

• Beta Galaktosidase = besteht aus zwei Untereinheiten (alpha und omega)—> Enzym kann nur gebildet werden, wenn beide Untereinheiten vorhanden sind (sonst kommt es zu keiner Blaufärbung).

  • Omega bringt Bakterium mit, alpha ist im Plasmid.

• Die MCS befindet sich im Reportergen des Vektors: wenn Vektor mit fremd DNA (insert) in MCS eingebaut wird, ist das Fragment nicht mehr aktiv --> Einbau unterbricht alpha Einheit der beta-Galactosidase

• Bei Einbau des Inserts wird das Gen unterbrochen = weiße Kolonien.

• Wird kein Insert eingebaut, Genprodukt = blaue Kolonien

3 Fälle:

1. Plasmid wird nicht aufgenommen = bleibt blau

2. Nehmen Plasmid auf = aber da ist keine Fremd DNA = es bleibt blau

3. Aufgenommen, eingebaut = weiß

Man muss darauf achten, dass die Bakterien keine beta Galaktosidase von Natur aus drin haben.

• z.B. Plasmide, wenn in sie Fremd-DNA eingebracht wurde.

• Allgemein: DNA, die in vitro (organische Vorgänge, die außerhalb eines lebenden Organismus stattfinden z.B. Petrischale) verändert wurde.

  
  

DNA:  5‘ = freier Phosphatsäure-Rest

3‘ = freie OH-Gruppe des Zuckers (Desoxyribose)

RNA:  5‘ = CAP Struktur (methylisiertes Guanosin; Signal für Ribosomen)

3‘ = Ribose Poly A Schwanz (Schutz vor Abbau) Je kürzer der Poly-A-Schwanz, umso kürzer die Lebensdauer der mRNA im Cytosol.

RNA:

Codierende Eigenschaften:

• mRNA = Messenger-RNA:

  • Informationsträger für die Proteinbiosynthese; wenige %—> 5% der gesamten RNA)

  • kopiert die in einem Gen auf der DNA liegende Information, Transport zu den Ribosomen, Translation.

• Prä-oder pre-mRNA/ hnRNA (heterogeneous nuclear RNA)

  • kommt im Zellkern von Eukaryoten vor und ist eine Vorstufe der reifen mRNA

Non-coding RNA: (nicht Protein codierend)

• rRNA = Ribosomale-RNA: (KATALYSE)

  • Bestandteil der Ribosomen / 80 bis 90 %

  • ist am Aufbau des Ribosoms beteiligt und ist bei der Knüpfung der Peptidbindung auch katalytisch aktiv.

• tRNA = Transfer-RNA:

  • Bindung von AS, Wechselwirkung mit mRNA; 5-20%

  • Hilfsmolekül bei der Proteinbiosynthese, indem sie eine einzelne Aminosäure aus dem Cytoplasma aufnimmt und zum Ribosom transportiert. Die tRNA wird durch ein bestimmtes RNA-Gen kodiert.

Regulation (Beispiele): (man muss nicht alle perfekt können)

• siRNA, small interfering RNA:

  • entsteht bei einem Signalweg der Zelle, der als RNAi (RNA Interference) zusammengefasst wird.

  • Dabei wird dsRNA (doppelsträngige RNA; englisch double-stranded RNA) durch das Enzym Dicer in viele kleinere Fragmente von ca. 22 Nukleotiden Länge zerteilt (die siRNAs) und in den Enzymkomplex RISC (RNA-induced silencing complex) eingebaut.

  • Mithilfe der inkorporierten RNA-Fragmente bindet RISC komplementär an DNA, z. B. Genbereiche, oder mRNA und kann diese damit „abschalten“. siRNA's = aktuelles Forschungsgebiet

• snoRNA, small nucleolar-RNA

  • finden sich im Nukleolus, und die eng verwandten scaRNAs in den Cajal Bodies

• snRNA, small nuclear-RNA, kleine Kern-RNA

  • im Zellkern von Eukaryoten, ist verantwortlich für die Prozessierung der hnRNA im Spliceosom.

• microRNAs:

  • sind eng verwandt mit den siRNAs und dient der Regulation zellulärer Prozesse wie z. B. Proliferation und Zelltod.

 andere:

• Ribozyme (KATALYSE)

  • sind katalytisch aktive RNA-Moleküle. Sie katalysieren wie Enzyme chemische Reaktionen.

• RNA-Viren:

  • nutzen RNA als Speichermedium, dsRNA (doppelstrang), ss(+)RNA, ss(-)RNA

Instabilität:

• OH-Gruppe an der 2‘-Position der Ribose -> erhöhte Instabilität und Angreifbarkeit

• RNA-Abbau in der Zelle auch durch die Länge des Poly-A-Endes bestimmt, mit zunehmender Verweildauer der RNA im Cytoplasma wird dieser verkürzt; sinkt Poly-A-Ende unter eine kritische Länge wird die RNA degradiert

• RNA ist sehr anfällig für Hydrolyse durch RNasen

Prokaryoten:

• nur eine RNA Polymerase, die alles macht

Eukaryoten: 3 RNA Polymerasen

• I : macht rRNA,

• II : macht hnRNA (prä- oder pre-mRNA)

• III: macht tRNA.

• DNA-Polymerasen brauchen Mg2+ um zu arbeiten, RNA-Polymerasen nicht.

• DNA Polymerase verantwortlich für DNA Repilkation

• RNA-Polymerasen brauchen keine Primer und haben keine proof-reading 3‘-5‘ exonuklease-Aktivität (RNA ist im Gegensatz zur DNA nur kurzlebig und wird nicht weitervererbt, weshalb es nicht soo wichtig ist, die RNA zu korrigieren —> weniger Auswirkung als Genveränderung)

  • DNA Polymerase hat beides

• RNA-Polymerase bindet an Promotor und startet von dort

Promotor (spezielle DNA-Sequenz)

Beide werden abgelesen. Entweder von 3‘ zu 5‘ oder anders herum.

• Abh. Vom Promotor

• Nukleinsäuren werden immer in 5‘-3‘ Richtung gebildet

Prolin, Phenylalanin, Thriptophan

• Bei der Transkription wird die Information der DNA Sequenz (eines Gens) in eine komplementäre RNA Sequenz umgeschrieben. (Mit Translation Teil der Genexpression);

• Transkription findet bei Eukaryoten im Zellkern statt

• Gebraucht wird:

  • DNA Matrize (einen der beiden DNA Stränge) für die komplementäre Basenpaarung

  • passende Nucleosidtriphosphate (ATP,GTP,CTP,UTP)

  • RNA-Polymerase: hohe Prozessivität (eine einzige Bindungsreaktion des Enzyms an die Matrize führt zur Polymerisierung von hunderten von RNA-Basen; ist bei DNA Polymerase auch so)

• 3 Schritte:

  • Initiation: RNA-Polymerase-Proteinkomplex bindet an Promotor; Initiationsstelle innerhalb des Promotors als Start der Transkription

    • Cis Elemente (sind Teil der D NA): Enhancer oder Silencer (wirken abschwächend oder verstärkend auf core Promotor (Kern Promotor)

      • --> Gen wird stärker oder schwächer abgelesen

    • Trans Elemente (Transkriptionsfaktoren)regulieren cis-Elemente:

    • Transkriptionfaktoren: Proteine, die abschwächend oder aktivierend auf cis Elemente einwirken

  • Elongation:

    • RNA-Polymerase entspiralisiert die DNA bei jedem Schritt um ca. 10 Basenpaare und liest Matrizenstrang in 3‘-5‘ Richtung (RNA wird in 5‘-3‘ Richtung aufgebaut)

    • durch Basenpaarung lagern sich komplementäre Ribonukleotide an, Esterbindungen zwischen Phosphat und Ribose werden geknüpft

  • Termination:

    • bestimmte Basensequenzen bestimmen Ende der Transkription; RNA Transkript löst sich von Matrize

• Prä-mRNA mit CAP-Struktur am 5‘ Ende, Poly-A-Schwanz am 3‘ Ende, Exons und Introns ist enstanden

• Introns werden durch Splicing entfernt (Spleißenzyme) reife mRNA

• Splicing = Spleißen: Introns und UTRs werden herausgeschnitten

  • (snRNP=small nuclear Ribonucleoproteine binden, Proteine binden, Spleißosom entsteht)

• Capping = methyliertes Guanosin am 5‘-Ende

• Polyadenylierung = Poly-A-Schwanz am 3‘-Ende

• Editing = chemische Modifikation einzelner Nukleotide (z.B. Desaminierung von Adenin zu Inosin oder Methylierung)

Eukaryoten:

ignaltransduktionsketten regulieren

Binden der Transduktionsfaktoren

• Erst Signal: Licht oder hormonelles Signal

  • Diese Signale binden an Rezeptor; geben Signal an G-Proteine weiter; diese geben Signal an sekundäre Botenstoffe (z.B. cAMP,cGMP…)weiter; sekundäre Botenstoffe sorgen für Aktivierung von Protein-Kinasen (phosphorilieren unter Verbrauch von ATP): letzte Proteinkinase gelangt in Zellkern (macht aus inaktiven Transkriptionsfaktoren aktive, welche auf Genexpression wirken)

Prokaryotes: Operon Modell (promoter, operator, strukturgene)

• Substratinduktion ( Operator ist inhibiert und wird durch Substrat als Signal aktiviert)

• Endproduktrepression ( anders herum)

Transkriptionsfaktoren (Aktivator und Repressorproteine)

a) Guanidinisothiocyanat =

• chaotropes Salz, dass Proteine denaturiert  (RNasen sind auch Proteine!)

b) SDS =

• anionisches Tensid (Tenside haben hydrophoben und hydrophilen Anteil; nach Abspaltung des Gegenions negativ geladen; sorgt für Zellaufschluss (denaturiert Membranen und Proteine)

c) Mercaptoethanol =

• Reduktionsmittel; Reinigung von Enzymen, RNA und DNA; Ethanol mit Thiogruppe

d) EDTA =

• Komplexbildner für Zweiwertige Kationen; Mg2+ wegfischen

e) Phenol =

• Ausreinigung von Proteinen (Proteine ausfällen; Zellen von Proteinen reinigen)

f) Chloroform =

• Ausreinigung von Phenol (Teil des Phenols aus der wässrigen Phase (wo die Nukleinsäuren drin sind) entfernen); und Zellen von Proteinen reinigen

g) Ethanol =

• Ausfällen von Nukleinsäuren (wird versucht ins Pellet zu bekommen)

h) Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) =

• kationisches Tensid (nach Abspaltung des Gegenions positiv geladen) wird als Detergens verwendet (Pflanzen enthalten z.B. sehr viele Polysaccharide und Polyphenole , die die RNA Isolierung stören, daher Verwendung von CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid, welches Polysaccharide komplexiert.)

• Abbau von DNA bzw. RNA zu einzelnen Nukleotiden

• Unterschiede:

  • DNAse braucht Mg2+ als Co Faktor

  • RNAse lässt sich schwer abbauen, sehr stabil (brauchen keine Mg2+-Ionen als Cofaktoren

  • unterschiedlicher pH Wert des Puffers

• ist eine Hybridisierungsmethode

• Analyse der Genexpression (Menge an Transkript z.B. mRNA)

• Ablauf:

  • Isolierung von RNA

  • Auftrennung der RNA nach ihrer Größe in einer denaturierenden Agarosegel- Elektrophorese (Formaldehyd)

  • Blotten: Übertragung der RNA auf eine Nylonmembran mittels Kapillarstreifen ( Blot = Abklatsch)

    • Membran ist Abklatsch des Gels

  • Hybridisierung mit radioaktiv markierter cDNA des interessanten Gens mit komplementärer RNA

  • Sichtbarmachung auf Film (Erkennung der gesuchten RNA-Sequenz)

• Southern Blot (Nachweis spezifischer Nukleotidsequenzen (DNA))

• Northern Blot (Nachweis von spezifischer RNA)

• Western Blot (Nachweis von spezifischen Proteinsequenzen)

• DNA und RNA haben unterschiedliche pH-Werte;

• Der pH-Wert kann sie ungeladen machen, dafür benötigt es aber unterschiedliche pH-Werte.

  • RNA braucht einen niedrigeren pH Wert (Unter 7; im sauern) als DNA (7,5-8).

• Der ph-Wert des Phenols zur RNA Isolierung muss im sauren liegen

  • So werden kleinere DNA-Fragmente im Phenol gelöst und größere DNA sammelt sich in der Interphase. RNA bleibt im wässrigen Überstand.

• Ist ein Enzym

• DNA Polymerase, die RNA als Matrize benutzt

• Rückübersetzung von RNA in cDNA.

Oligo(dT)

• 18-30 Thyminbasen

• komplementär zum Poly A Schwanz der mRNA

• DNA-Microarrays dienen dazu, die mRNA-Menge einer Vielzahl von Genen nachzuweisen (Analyse differentieller Genexpression)

• Um z.B. Auswirkungen von der Umwelt bei zwei unterschiedlichen Menschen bezüglich Krankheiten auszuwerten.

• Mehrere Gene gleichzeitig überprüfen.

Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäure,

Eine Form der quantitativen RT-PCR

• Zusätzlich Quantifizierung des PCR-Produkts und damit Rückschlüsse (Quantifizierung) des Ausgangsprodukts (mRNA bzw. cDNA)

• wie viel RNA hatte ich anfangs?

• wie war die Expressionsstärke des Gens?

• Rückschluss auf RNA zu Beginn möglich

Es kann festgestellt werden, ob und wo RNA/Gen in einem bestimmten Gewebe oder Zellen vorhanden ist.

• analyse von Expressionsmustern in Gewebe oder Zellen

1.    Fixierung 

• Fixierung des Gewebes ohne Zerstörung der RNA

2.    Einbettung mit Schnitten 

• Einbettung (Paraffin oder Methacrylate) und Herstellung von Schnitten

3.    Durchlässig machen des Gewebes 

• Gewebe durchlässig Machen (Proteinase), negative Ladungen absättigen, Refixierung

4.    Hybridisierung

• Hybridisierung mit markierter (z.B. DIG) Gegenstrang-RNA- Sonde für die zu analysierende RNA

5.    Abwaschen der überschüssigen Sonde 

6.    Nachweis gebundene Sonde 

• Nachweis der gebundenen Sonde (z.B. DIG-Antikörper)

7.    Gegenfärbung

• Vor der Sequenzierung muss der Nukleinsäureabschnitt (spezifische DNA Abschnitt) vervielfältigt werden —> Klonierung oder PCR

• Kettenabbruchmethode - Denaturierung des Abschnitts in Einzelstränge - dNTPs und ddNTPs werden hinzugegeben (in 4 verschiedene Ansätze) - solange bis ein ddNTP eingebaut wird (durch Polymerase), wodurch es zum Abbruch kommt

• Wiederholung bis die fluoreszierenden ddNTPs dann abgelesen werden können (Auftrennung durch Kapillarelektrophorese)

• am Ende lässt sich Nukleitidsequenz des DNA-Moleküls, das als Matrizenstrang gedient hat, ablesen

• Bis 500 Nukleotide kann Sequenzlänge  genau bestimmt werden, danach ungenau

• Sulfurylase (ATP)

• Luciferase (Licht)

• Apyrase, da sie in jedem Durchlauf die nicht eingebauten Nukleotide und ATP abbauen muss.

DNA Polymerase

NCBI- BLAST, NAR, KEGG oder NCBI (National Center for Biotechnology information)

Basic Local Alignment Search Tool

a) nein

b) nein

c) nein

• Genomisch: enthält gesamte Genom, auch nicht-codierende Bereiche (Introns) „originale DNA“

• cDNA: aus mRNA umgeschriebene DNA

  • nur noch Exons (keine Introns, Promotoren, UTRs usw. (keine nicht codierende mehr)—>komplementäre DNA des originals

  • Nutzen: Klonierung von Genen und Expression in anderen Systemen

• genomische Datenbank muss genommen werden; dort kann man Promotoren finden; in cDNA sind keine Promotoren mehr

  • Promotoren sind Startpunkte der Transkription der mRNA (durch reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben  nicht codierend; nicht in mRNA oder in cDNA drinnen)

a)

b)

c)

Die Translation ist der Vorgang, in den Informationen der mRNA (die aus der DNA stammt) dazu dient, eine spezifische Sequenz von AS zu bestimmen und zu verknüpfen, sodass ein bestimmtes Polypeptid (10 bis 100 miteinander über Peptidbindungen verknüpfte AS) entsteht. Dies geschieht durch zwei Untereinheiten eines Ribosoms. Um die richtigen AS zu erkennen, werden Basentripletts abgelesen.

Initiation:

• Initiationskomplex wird gebildet

  • Besteht aus beladener tRNA und kleine ribosomale Untereinheit

  • Binden beide an mRNA

• Kleine Untereinheit bindet an 5‘-Cap-Gruppe der mRNA —> mRNA wandert, bis sie auf Startcodon (AUG) trifft

• tRNA: ist mit Anticodon Methionin (bei Eukaryonten)/ Formyl-Methionin (bei Prokaryonten) beladen & bindet durch komplementäre Basenpaarung an Startcodon

  • Vervollständigung des Initioationskomplexes

• große Ribosomale Untereinheit kommt hinzu: die mit Methionin beladenen tRNA befindet sich jetzt in der P-Stelle des Ribosoms; in A-Stelle liegt zweite mRNA Codon

• Initiationsfaktoren (Proteine) fügen mRNA, 2 ribosomale Untereinheiten und tRNA zusammen

Elongation:

• Beladenen tRNA, dessen tRNA zum zweiten Codon der mRNA komplementär ist tritt in offene A-Stelle der großen ribosomalen Untereinheit ein

  • Bindung zw. tRNA und ihrer AS in der P-Stelle wird gelöst

  • Zw. Dieser AS und der AS, die an die tRNA in der A-Stelle gebunden ist, wir eine Peptidbindung gebildet

  • Peptidyltransferase-Aktivität

  • tRNA, die nun ohne AS an P-Stelle ist wandert zur E-Stelle und dissoziiert vom Ribosom (gelangt ins Cytosol und wird dort neu mit z.B. Methionin beladen)

  • zweite tRNA (mit nur Dipeptid) wandert von A zur P-Stelle, während sich das Ribosom entlang der mRNA in 5‘-3‘ Richtung um ein Codon weiterbewegt

  • —>Schritte wiederholen sich und Polypeptidkette wächst

• Polypeptidkette wird pro Zyklus um eine AS verlängert.

Termination:

• Erkennung des Stoppcodons (UAA,UAG,UGA)

  • Eintritt in A-Stelle.

  • Release-Faktor bindet und Bindung zw. Polypeptidkette und der tRNA an der P-Stelle wird hydrolysiert

  • —> Polypeptid löst sich vom Ribosom

Ribosom: rRNA und Proteine

Proteolytische Prozessierung: Bestimmte Enzyme werden in ihrer inaktiven Vorstufe synthetisiert & erst am ort wo sie wirken sollen in die aktive Phase überführt

Im Labor: beta-Mercaproethanol, Dithiothreitol (DTT)

Zelluläre: Glutathion, Cystein

• Differentielle Zentrifugation

• Isopyknische Sedimentation/ Gleichgewichtssedimentation/ Dichtegradienten-Zentrifugation

• Aufreinigung bzw. Anreicherung eines Enzyms

  • Nach jedem Schritt wird die spezifische Aktivität d.h. die Anreicherung bzw. Ausbeute (über die Gesamtenzymaktivität) bestimmt

  • Reaktionsrate eines Enzyms mit einem Substrat zu messen

• Spezifische Aktivität eines Proteins = Proteinaktivität im Bezug zur Proteinmenge.

• µmol Substratumsatz/min mg Protein = U/mg Protein; oder Katal / mg Enzym (Katal = mol/s)

• U=Unit (alles vor mg Protein); U = µmol/min;

• z.B. Malatdehydrogenase (Aktivität wird am Photometer gemessen = das Maß für das gesuchte Protein)

Bradford-Methode

Lowry-Methode (Biuret-Reaktion)

Reduktion und Farbumschlag

Bradford: 1 bis 10ug/ml

Lowry: 0,1 bis 1 ug/ml

Y= m*x+n

m= y2-y1/x2-x1

 1,75-0,4/1,4-0= 0,964

Y=0,964*x+ 0,4

1,2= 0,964x+0,4

1,2-0,4=0,964x

0,8:0,964=x

0,829=x

0,829mg/ml*20= 16,59 mg/ml (mal 20 weil die Lösung 1:20 verdünnt war)

16,59mg/ml * 0,1ml = 1,65 mg (wir haben 0.1ml Probe, deshalb muss alles auf diese Größe runtergerechnet werden)

1,2 – 0,5 = 0,7

Y = 0,9963x

0,7 / 0,9963 = 0.703 mg/ml

0,703 * 20 = 14 mg / ml

14 mg / ml * 0,1 ml = 1,4 g Protein.

Blindwert ist b in der Formel y=mx+b (steht bei 0 in der Tabelle)

Ammonium Kationen —> ist ein antichaotropes Salz

• initiieren hydrophobe Interaktionen und wirken präzipitierend

• dazu gehören:

Elektrophorese: nach Ladung und Größe

Chromatographie: Größe, Beschaffenheit, Dichte

• Gel-Ausschlusschromatographie: Größe und Form

• Ionenaustauschchromatographie: Ladung

Große Moleküle, da sie nicht in das Gel hineinpassen.

Anionenaustauscher = DEAE (Diethylaminoethyl) ist positiv geladen.

BSP Kationen: Carboxymethyl (CM): negativ geladen

• danach: Fraktionssammler, in welcher die Aktivität des Proteins und die Konzentration gemessen wird

• hiervon werden nur die Säulen ausgewählt, welche über der Proteinaktivität von der vorherigen Messung liegen

• mit dieser wird weitergerechnet

• BILD

• 
  

Bezieht sich auf die spezifische Aktivität

• spez. Akt. nach dem Aufreinigungsschritt im Verhältniss zur spez. Aktivität im Rohextrakt

• 
  

• Bezieht sich auf die Gesamtaktivität

• (Gesamtaktivität nach dem Aufreinigungsschritt im Verhältnis zur Gesamtaktivität im Rohextrakt * 100%)

Je stärker negativ geladen, desto weiter zur Anode (+)

Polyacrylamidgel.

Aufgabe a)

• 2 D: zwei Dimensionen

• Erste dimension: zuerst isoelektrische Fokussierung,

  • Durchlauf einer isoelektrische Fokussierung, bei welcher die Porteine nach ihrer Ladung aufgeteilt werden, da das Gel bei der isoelektrische Fokussierung,oben den pH-Wert 9 und unten 3 hat

  • an dem isoelektrischen Punkt der Proteine bleiben diese hämgen; Aufteilung nach Ladung

• zweite dimension: dann SDS Page

  • Überdeckung der Ladung der Proteine

  • Aufteilung nach Größe

Aufgabe b)

• Aufteilung nach Ladung UND Größe, sodass die Proteine besser getrennt werden

• Darstellung als Punkte; jeder Punkt ist ein Protein (manchmal auch mehr als einer)

• bei 1D: Gelelektrophorese sind Banden oder Punkte zu sehen, die allerdings nicht nur ein Protein sondern mehrere Hunderte sind

• Denaturierende Gelelektrophorese.

• SDS (negativ geladen) überlagert die Ladungen der Proteine im Gel, sodass die Proteine nur nach Größe aufgeteilt werden

• Das Protein hat somit keinen Ladungsträger und kann nur noch nach der Größe aufgetrennt werden.

• Laufgeschwindigkeit verringert sich, da die Ladung abgeschwächt wird.

• Coomassie-Blaufärbung:

  • dauert lange aber Gele lassen sich entfärben = Proteine können weiterverwendet werden

  • nicht sensitiv (40-50 ng)

  • Coomassie bindet an Proteinen (entfärben mit Essigsäure/Methanol)

  • quantitativ („halb“)

  • Gele lassen sich z.T. wieder entfärben, Weiterverwendung der Proteine für andere Tests

  • einfach, dauert etwas länger (14-18 h)

• Silbernitrat-Färbung:

  • sehr sensitiv, dafür aber aufwendig und stört viele Methoden

  • Silbernitratbindetnicht- stöchometrisch an Proteine und wird reduziert

  • nicht quantitativ

  • Silbernitrat (und Formaldehyd) stört viele Methoden, daher nur begrenzt eingesetzt

  • etwas aufwendiger, kurze Zeit (3-4 h)

• Pouceau S-Färbung:

  • einfach und kurze Zeit, dafür aber nicht sensitiv

  • insensitiv (100 ng)

  • Ponceau S bindet reversibel an positiv geladene Aminosäuren

  • nicht quantitativ?

  • Farbstoff lässt sich mit Wasser auswaschen; Proteine nach Blot weiterverwenden

  • einfach, kurze Zeit

Blotten = Übertragung von einem Elektrophoresegel auf eine Nylonmembran.

Southern Blot:

• Nachweis spezifischer DNA.

• Zuerst Auftrennung von der Nukleotidsequenz durch RFLP. Sichtbarmachung durch entweder radioaktive oder DIG präparierte Sonden, die komplementär zum gesuchten Stück binden.

  
  

Northern Blot:

• Untersuchung und spezifische Markierung von RNA.

• Zuerst Isolierung der RNA, dann Auftrennung auf einem Agarosegel, danach Übertragung der RNA auf eine Nylonmembran.

• Anschließend Hybridisierung mit radioaktiv markiterter cDNA.

Western Blot:

• Spezifischer Proteinnachweis.

• Blotten vom Gel auf eine Membran.

• Bindung primärer und sekundärer Antikörper.

• Mischung aus verschiedenen gegen diverse Epitope gerichtete Antikörper.

• aus verschiedenen B-Zellen

• Gegen das gleiche Antigen, aber gegen verschiedene Epitope gerichtet.

• Gegen GENAU ein spezifisches Epitop gerichteter Antikörper. Kann durch Fusionierung von B-Zellen (B-Lymphozyten) einer immunisierten Maus und Tumorzellen (Myelomzellen) hergestellt werden.

• Immunisierung eines Tieres

• Gewinn dessen Plasmazellen

• Verschmelzung mit Tumorzellen (da eingeschränkte Zellteilung)

• Bildung von AK

• monoklonal da es aus EINER B-Zelle entstanden ist; wurde gemischt mit tumorzellen, damit sich die Zelle vervielfältigen kann

Monoklonal ist spezifischer

• Antigene Determinante, Antikörper Bindungsstellen

• Molekulare Struktur an einem Antigen, die eine spezifische Immunantwort auslösen kann.

• sind die Molekülabschnitte eines Antigens, die eine spezifische Immunantwortauslösen können.

• Schwangerschaftstest

• Impfstoffe

• Krebsforschung

• Immunhistochemie: indirekter Nachweis von Zelltypen, Differenzierungsstadien in Organismen durch Nachweis von Antikörpern.

a)

• Nutzen eines SDS oder 2D Gels

• Bande wird ausgeschnitten

• Proteine tryptisch verdaut

  • Trypsin: Endopeptidase

    (normalerweise im Darm)

    • Proteine werden in Peptide gespalten

    • Spaltet nach Lysin, Arginin und modifiziertem Cystein

• dann Massenspektronomie

  • Ionen werden in den gasförmigen Zustand überführt (Desprption)

  • durch elektrisches Feld beschleunigt

  • Analysator (die Ionen werden nach ihrem Masse-zu-Ladung-Verhältnis getrennt) (ist die Ladung bekannt, kann direkt auf die Masse des Ions geschlossen werden)

  • Detektor

• Dann Datenbanksuche/Datenbankvergleich mit bekannten Protein und Peptidmassen

b)

• Angabe in m/q

  • m = Masse

  • q = Ladung

    • Meisten x+1; also einfach positiv geladen

• Röntgenstrukturanalyse, MALDI-TOF

• Proteine werden ionisiert ud gasförmig gemacht

Partikelkanone mit Kugeln

Protoplastentransformation

Agrobactericum tumefaciens

a) Ti-Plasmid: Tumor induzierendes Plasmid von Agrobacterium tumefaciens

b) T-Region, VIR-Region, ORI (Origin of Replication), Opinabbau, Konjugation

c) ORI, VIR-Region, LB und RB

• In der T-Region sind Selektionsmarker und Genkonstrukt eingebaut.

• Selektionsmarker für Pflanzen und Bakterien

• ORI von Vermehrer (E. coli) und A. Tumefaciens

• BILD

• 
  

Nein, da sie nur in den Zellen, aber nicht im Genom sind.

stabile Transformation :; einbringunv ins genom

DNA irgendwo in der Zelle: transente Transformation

• Nutzen von binären Vektoren

  • Teile aus Blättern einer Pflanze, z.B. Tabak werden entfernt, und mitsamt des Agrobacteriums auf einen Nährboden gegeben, auf welchem nur die Pflanzenzellen wachsen, die die DNA vom Agrobakterium erworben haben

  • erst bekommt die Pflanze eine Triebanregendes Medium, sobald Triebe gesprossen sind, wird das Medium auf ein Wurzel antreibendes Medium gewechselt

  • sobald die Wurzeln entstanden sind wird die Pflanze, mitsamt den Agrobakteriumgenen in einen Topf gepflanzt

  • agar Nährboden bestückt mit Kanamycin (Selektion der Transformanten) + Cytokinin (Sprossen) und Auxin (Wurzeln), damit die Pflanzen wachsen können

  • 
    

    

• Selektion auf gv Pflanzen mit Selektionsmarkern

  

Antibiotika- und Herbizidresistenz

Probleme: Aufnahme der Resistenzen, Multiresistente Keime

• RNA-Interferenz

• Crispr Cas

• (Antisense-RNA)

Knock-out: Gen komplett ausgeschaltet

Knoch-down: Gen nur stark vermindert

Ja.

z.B. Abwehr von Viren oder Verminderung von Vorgängen.

Nicht-Expressionsvektoren werden nicht in den Organismus eingebaut, können also auch nichts expressieren.

Kein Spleißen = zu viele AS im Protein

• Bakterien und Archaeen

• verschafft Resistenz gegen bestimmte Viren oder Plasmide

  (bakterielle „Immunantwort“)

• eine Endonuklease

Durch cas9 mit den entsprechenden RNA-Sequenzen kann sequenzspezifisch doppelsträngige DNA geschnitten werden, wodurch gezielte Deletionen erzeugt werden können.

cas 9

• RNA spacer-Sequenz wird ausgetauscht (zur DNA-Zielsequenz komplementäre RNA)

• RNA repeat ist vorhanden

• cas9 schneidet die DNA nahe der geänderten Zielsequenz.

• mobile genetische Elemente

• ist ein DNA Abschnitt im Genom, der ein oder mehrere Gene umfasst uns seinen Ort im Genom verändern kann

• Am besten charakterisiert ist die AcDs Familie der Transposons

  • kommen natürlicherweise bei Mais vor

  • gehören zu den DNA-only-Transposons

  • enthalten:

    • gen für ein spezielles Enzym (Ac-Transponase) das bestimmte Signale (Ds Sequenzen) in der DNA erkennt und genau da Stücke aus der DNA herausschneidet und sie an einer anderen, nicht vorhersagbaren Stelle wieder in die Erbsubstanz integriert

  • 2 Mechanismen

    • cut and paste

    • copy and paste

• Zellkern: Durchmesser zwischen 5 und 16 µm. Lichtmikroskopisch ist er das am leichtesten erkennbare Zellorganell.

• Grenze Lichtmikroskop: 200nm bis 5mm

• Die Lichtmikroskopie hat den großen Vorteil, dass lebende Zellen nichtinvasiv, also ohne sie zu beeinflussen, untersucht werden können. Der Einsatz von Licht unterschiedlicher Farbe ermöglicht es zudem, gleichzeitig mehrere Strukturen sichtbar zu machen.

  
  

• Ribosomen: Durchmesser von ca. 25 nm

• Elektronenmikroskop: 0,2 nm- 100 Mikrometer (tote Lebewesen)

Licht-Mikroskopie

Fluoreszenz-Mikroskopie

Konfokale-Laser-Scanning-Mikroskopie

• Voraussetzung: Anregungslicht, fluoreszierende Farbstoffe

• Detektion: emittierendes Licht

• Cis-Elemente,

• Promotor,

• Transkriptionsfaktoren,

• Enhancer,

• Silencer

Promotor-Reportergen-Fusion Einführung und testen in einem Organismus. Enzymaktivität stellt Promotoraktivität dar.

• GFP = green fluoreszenz protein

• Beta-Galactosidase

• Luciferase

• Beta-Glucuronidase                          

• wahrscheinlich bei Eukaryoten

Oberflächenstrukturen an toten Objekten

• Proben mit Gold, Platin oder Graphit bedampfen

• Elektronen beschleunigen

• Hochvakuum

• Elektronenstrahl mit einem bestimmten Muster über das Objekt führen nochmal gucken

• Fixierung

• Dehydratisierung

• Einbettung mit Acrylharz

• Dünnschnitte

• Kontrastierung

50 nm