Was ist am 5’-Ende und am 3’-Ende eines DNA- bzw. eines RNA-Stranges zu finden bzw. wodurch sind diese Bereiche geschützt?
5´Ende = Phosphatgruppe bindet an 5’-Kohlenstoffatom der Desoxyribose- oder Ribose-Zuckergruppe
3´Ende= Hydroxy (-OH) an das 3’-Kohlenstoffatom der Zuckergruppe gebunden.
Schutz der 5´= 5‘-Ende bekommt „Cap“, ein methyliertes Guanosin.
Schutz von 3´= PolyA-Schwanz
Welche verschiedenen RNAs gibt es?
Welche verschiedenen RNAs gibt es? Funktion, Vorkommen in der Zelle
Was sind die Unterschiede zwischen DNA und RNA?
RNA hat Uracil statt Thymin
fast immer einzelsträngig
Nucleotid besteht aus: Ribose, Base, Phosphat
Identifizieren Sie unter Benutzung des genetischen Codes (Abbildung Vorlesung) eine mögliche 5’→3’-Sequenz von Nukleotiden auf dem DNA-Matrizenstrang, die für eine mRNA codiert, welche in die Aminosäuresequenz Phe- Pro-Lys übersetzt werden kann. a) UUU-GGG-AAA b) GAA-CCC-CTT c) AAA-ACC-TTT d) CTT-CGG-GAA e) AAA- CCC-UUU
Beschreiben Sie die verschiedenen RNA-Polymerasen bei Prokaryonten und Eukaryonten.
Bakterien haben nur eine RNA-Polymerase (macht alles), Eukaryonten drei:
I : macht rRNA,
II : macht hnRNA
III: macht tRNA.
Worin unterscheiden sich DNA- und RNA-Polymerasen?
Im Unterschied zu DNA-Polymerasen benötigen RNA-Polymerasen keinen Primer.
RNA-Polymerasen haben im Gegensatz zu DNA-Polymerasen keine "proofreading" 3'→ 5' Exonuklease Aktivität.
Wie erkennt die RNA-Polymerase, wo der Start der Transkription eines Gens ist?
RNA-Polymerase bindet am Promotor und „startet“ von dort
Welches der beiden DNA-Moleküle wird bei der Transkription abgelesen?
kann sich im DNA-Molekül ändern
abhängig vom Promotor
an sich Synthese von hnRNA immer in 5‘→3‘ Richtung
Ein mRNA-Molekül enthält die folgende Nucleotidsequenz: 5’-CCAUUUACG-3’ Übersetzen Sie die Sequenz in eine Aminosäurefolge
Pro - Phe - Thr
Beschreiben Sie kurz den Prozess der Transkription bei Eukaryonten inklusive der beteiligten Enzyme.
Erläutern Sie die verschiedenen Reifungsprozesse/Prozessierung der mRNA. (Splicing, Capping, Polyadenylierung, Editing)
Splicing: Introns werden durch Splicing (Spleißen) entfernt. (snRNP=small nuclear Ribonucleoproteine binden, Proteine binden, Spleißosom entsteht)
Capping: 5'-Ende der mRNA eine modifizierte Guanin-Nucleotid-Kappe angehängt wird.
Cap-Struktur besteht aus 7-Methylguanosin-Base, die über eine Triphosphat-Brücke mit dem ersten Transkriptionsnukleotid der mRNA verbunden ist.
Funktion: Dadurch wird später bei der Translation die Bindung der mRNA an das Ribosom unterstützt und die mRNA ist vor einem Abbau durch Ribonucleasen geschützt.
Polyadenylierung:
Am 30-Ende der Prä-mRNA wird ein Poly(A)-Schwanz an- gehängt. Die Transkription eines Gens endet stromabwärts („rechts“) des Terminationscodons in der DNA. Bei den Eu- karyoten liegt normalerweise hinter dem letzten Codon in der Nähe des 30-Endes der Prä-mRNA eine sogenannte Polyadenylierungssequenz (AAUAAA). Diese Sequenz wirkt als Signal auf ein Enzym, das die Prä-mRNA abschneidet.
Unmittelbar nach diesem Schnitt hängt ein anderes Enzym 100–300 Adeninnucleotide an das 30-Ende der Prä-mRNA. Dieser Poly(A)-Schwanz unterstützt den Export der mRNA aus dem Zellkern und ist für die Stabilität der mRNA von Bedeutung.
Editing: RNA-Editing: chemische Modifikation einzelner Nukleotide, z.B. Desaminierung von Adenin zu Inosin
Beschreiben Sie die Regulation der Genexpression bei Prokaryonten und Eukaryonten.
Transkriptionsfaktoren binden an Promotor (=TATA-Box, da am Promotor häufig viele Adenin-Thymin-Basen liegen)
Transkriptionsfaktoren können an Enhancer oder Silencer binden, die di eTranskription entwerder anregen (Enhancer) oder unterdrücken (=Silencer)
Bei der Stimulation der Transkription eines spezifischen eukaryontischen Gens wirkt der Enhancer nicht direkt auf den Promotor eines Gens ein, sondern übt seine Bindung über bestimmte DNA-Bindeproteine aus. Wie heißen diese Proteine?
trans-Elemente = Transkriptionsfaktoren
Enhancer oder Silencer sind die cis-Elemente
Gene können verschieden exprimiert werden: Nenne 3 Einflussfaktoren
Gen, Gewebe, Licht —> Bsp.: GenA kann in Gewebe A mehr RNA transkribieren als in Gewebe B, weil dort andere Transkriptionsfaktoren herrschen
Welche Funktion haben folgende Substanzen bei der Nukleinsäure-Isolierung? a) Guanidinisothiocyanat b) SDS c) Mercaptoethanol d) EDTA e) Phenol f) Chloroform g) Ethanol h) Cetyltrimethylammoniumbromid
a) Guanidinisothiocyanat = chaotropes Salz, dass Proteine denaturiert, auch RNAsen
b) SDS = denaturiert Proteine —> Deporteinierung der RNA
c) Mercaptoethanol = denaturiert Proteine —> Deporteinierung der RNA, Reduktionsmittel: Reduzieren Stoffe, z.B. Proteine, und lösen Disulfidbrücken
d) EDTA = der Calcium- und Magnesiumionen bindet und dadurch DNasen inaktiviert.
e) Phenol = Der pH-Wert des Phenols zur RNA Isolierung muss im Sauren liegen.
So werden kleinere DNA-Fragmente im Phenol gelöst und größere DNA sammelt sich in der Interphase. RNA bleibt im wässrigen Überstand. —> Proteine ausfällen
f) Chloroform = Proteine ausfällen
g) Ethanol = RNA präzipitieren und waschen
h) Cetyltrimethylammoniumbromid = Pflanzen enthalten z.B. sehr viele Polysaccharide und Polyphenole , die die RNA Isolierung stören,—> Kationisches Tensid, welche komplexiert Polysaccharide.
Welche Reaktion katalysieren DNasen und RNasen? Worin unterscheiden sie sich (mindestens zwei Unterschiede, mit Zuordnung)
Beschreiben sie den Ablauf eines Northern Blots.
Welche Möglichkeiten des „Blottens“ gibt es?
Southern Blotting: Diese Technik wird verwendet, um spezifische DNA-Fragmente in einer Probe zu identifizieren. Die DNA-Fragmente werden durch Restriktionsenzyme zerschnitten, auf einem Agarosegel aufgetrennt und anschließend auf eine Membran transferiert. Die Membran wird dann mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde hybridisiert, die spezifisch an das gesuchte DNA-Fragment bindet.
Northern Blotting: Diese Technik wird verwendet, um spezifische RNA-Fragmente in einer Probe zu identifizieren. Die RNA-Fragmente werden durch Elektrophorese auf einem Agarosegel aufgetrennt und anschließend auf eine Membran transferiert. Die Membran wird dann mit einer radioaktiv markierten RNA-Sonde hybridisiert, die spezifisch an das gesuchte RNA-Fragment bindet.
Western Blotting: Diese Technik wird verwendet, um spezifische Proteine in einer Probe zu identifizieren. Die Prote
Warum muss bei der DNA- bzw. RNA-Isolation auf den pH-Wert des verwendeten Phenols geachtet werden?
Die pH-Bedingungen können die Löslichkeit von Phenol beeinflussen, was wiederum die Effektivität der DNA- oder RNA-Isolierung beeinflussen kann. In der Regel ist es am besten, Phenol in einem pH-Bereich von etwa 7,5 bis 8,0 zu verwenden. Dieser pH-Wert stellt sicher, dass Phenol in seiner ionisierten Form vorliegt und dadurch seine wasserlöslichen Eigenschaften verbessert werden.
Wenn der pH-Wert des Phenols niedriger ist als 7,5, kann das Phenol nicht ionisiert sein und bleibt in seiner nicht wasserlöslichen Form vorliegen.
Wenn der pH-Wert des Phenols höher als 8,0 ist, kann es die Nukleinsäuren denaturieren und die Isolierung beeinträchtigen.
Welcher Informationstransfer wird durch die reverse Transkriptase katalysiert?
mRNA wird in cDNA umgewandelt
Wenn Sie eine mRNA in cDNA umschreiben wollen, welchen Primer nutzen Sie für die Reverse Transkriptase Reaktion??
einen spezifischen Primer
ein Oligo(dT)-Primer (18-30 Thyminbasen). Primer ist komplementär zu PolyA-Schwanz der mRNA.
Wozu werden cDNA-Mikroarrays hauptsächlich verwendet?
DNA-Microarrays dienen dazu, die mRNA-Menge einer Vielzahl von Genen nachzuweisen (Analyse differentieller Genexpression)
Wie funktioniert die Hybridiserung durch cDNA-Microarrays?
Was ist der Untershcied zwischen dem Blotten und den DNA-Microarrays?
Welche Fragen lassen sich mit der „real time-PCR“ beantworten?
Quantifizierung des PCR-Produktes und damit Rückschlüsse (quantifizierung) des Ausgangsproduktes (mRNA bzw. cDNA).
War in Gewebe a mehr RNA als in Gewebe b
Welche Funktion hat die in situ Hybridisierung?
Analyse von Expressionsmustern in Geweben oder Zellen
Hier können die Expressionsprodukte (z.B. mRNA) sogar in Zellen oder Geweben untersucht werden —> keine Isolation notwendig
Beschreiben Sie das grundsätzliche Vorgehen bei der in situ Hybridisierung.
zu 4. die RNA in den Zellen sind sense RNA. —> dementsprechend sind die Gegenstrang RNA-Sonden “antisense” RNA. RNA wird mit RNA hybridisiert.
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