Zellkultur

Weil sie kleiner als die Poren sind → kleine sich verbreitende Prokaryoten mit dem

kleinsten selbst-replizierenden Genomdurchmesser von 0,1-2 microns

• DAPI staining – “Milky Way-Like fog”

• Ready-to-use Set basierend auf PCR-Amplifikation einer Gensektion die für 16S-rRNA codiert

Um die Zellen und Gewebekomponenten in einem „life-like state“ zu erhalten

o → Verhindern der Autolyse und Fäulnis oder zellulärem Verfall

o → Verhindern von Verlust und Diffusion von löslichen Substanzen

o → Verbesserung der Starrheit (rigidity) und mechanischer Stärke der Zellen

o Um die Reaktivität zum Färben und anderen Reagenzien (AKs und Nukleinsäure-

sonden) beizubehalten

Cross-linking

→ create intermolecular bridges and a network of linked antigenic proteins

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▪ + preservation of cell morphology suited for immunostaining of membrane

proteins

▪ - reduced target antigenicity → aldehydes (formalin or formaldehyde,

glutaraldehyde)

▪ Paraformaldehyde (PFA)

—> Powder form of polymerized formaldehyde

—> Decomposes in formaldehyde when heated (in aqueous solution) • Needs to be dissolved in PBS before use

—> Methanol is added to formalin prevent precipitation (effect on

permeabilization)

—> 4% PFA solution is optimal or fixing tissue and cells

Precipitating (denaturing)

→ strong dehydrants and cause the precipitation of cellular proteins

+ good choice for aldehyde-sensitive epitopes, permeabilization step might

be avoided

– can remove small soluble molecules and lipids, not recommended for use

with overexpressed fluorescent proteins highly volatile and flammable →

organic solvents (methanol, acetone, picric acid)

o Serinprotease (23,3 kDa), aus der Bauchspeicheldrüse eines Schweins

o wird verwendet, um Zellen voneinander und von der Zellkulturflasche zu trennen →

splittet Proteine und Peptide der ECM und adhäsiver Zellen

o Man muss auf die Aktivierungszeit und Temperatur achten, diese variiert je nach

Zelltyp und ist normal bei 37°C für 5 min. Zu langes Trypsinieren kann lösliche

Moleküle schädigen

o Alternativen, z.B. für andere Zelltypen sind andere Proteasen wie Kollagenase,

Elastase, etc.

DMEM = Dulbecco’s Modified Eagle‘s Medium

o Hat eine erhöhte Konzentration an Vitaminen und Aminosäuren und ist mit höheren

oder niedrigeren Glucoselevels erhältlich

o Weitere Bestandteile sind: anorganische Salze (NaCl, KCl, MgSO4…)L-Aminosäuren

(Arg, His,…), Vitamine (Folic acid, Riboflavin…) und weitere(D-Glucose, Phenolrot,

Natrium-pyruvat)

Aktive Aufnahme durch Endozytose!

o Endosomaler Untergang → Toxizität!

o Erhöhte Zellteilungsrate erhöhte Wahrscheinlichkeit des Einbringens von DNA in den

Zellkern → Konfluenz maximal 60-80 %!

o Verwendung serumfreier Medien nötig!

o Dafür günstig und einfache Prozedur

o Toxizität stark zelltypabhängig

o Toxizität: Ca2+-Phosphat Präzipitation > Lipofektion > Kationische Polymere

40 Zellen / (4 mm² * 0,1 mm * 0,5) = 200 Zellen/mm³ = 200 Zellen/µL = 2 * 10^5

Zellen/mL

Muss um den Faktor 4 verdünnt werden, d.h. 125 µL Zellsuspension und 375 µL

Pufferlösung

o Poor growth of the cells

o Turbidity of the medium (unclear medium)

o Colour change of the medium into yellow – acidification

o Detachment of the cells o Microscopic recognizable “storm” of the cell lawn

o Sterility control: small volumes of the solutions used on LB-Agar and overnight

incubated at 37°C

Transiente Transfektion:

▪ Schneller Abbau fremder DNA

▪ „Verdünnung“ bei der Zellteilung

o Stabile Transfektion: Integration der eingebrachten DNA im Wirtsgenom (Einbringen

in Zelle → Zellkern → chromosomale DNA → Selektion z.B. über Antibiotika-

Resistenz

Physikalisches Verfahren: Gene Gun

• DNA an Wolfram- oder Goldpartikel absorbiert

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• „Beschuss“ des Gewebes

• Ursprünglich für Pflanzenzellen entwickelt

• Auch geeignet zur Transfektion von Primärzellen, Organen und

Organellen (Mitochondrien und Chloroplasten)!

• Fehlende Zellspezifität!

Physikalisch: Transfektion seneszenter Zellen, Nukleofektion (spezialform der

Elektroporation, für sich nicht teilende Zellen (primäre Neuronen) - DNA

gelangt direkt in den Zellkern

biochemisch: ca2+phosphat-präzipitation, Lipofektion, kationische Polymere

(PEI-Dendrimere) für HEK (da gut für stark proliferierende Zellen)

▪ Mikroinjektion zur Generierung transgener Mäuse

▪ Elektroporation für Suspensionszellen

▪ Außer biochemischen und physikalischen Verfahren auch virale Vektoren

möglich

NeuN färbt Neuronen (durch Cy3), DAPI färbt Nuclei und Cy5 (Y188) war gegen APP o NGS, Rabbit-anti-APP und Goat-anti-rabbit-Cy5 ???

human embryonic kidney cells

immortalized

high transfectability

express the SV40 antigen

derived from a foetus, were immortalized via transfection with adenovirus 5 DNA

can maintain a high copy number of transfected plasmid and express recombinant proteins at a high level

Taking tissue from a primary tissue and immortilazing it

Biochem Verfahren:

• Ca-Phosphat-Präzipitation

• Lipofektion

• Kationische Polymere —> PEI

Physikalische Verfahren:

• Mikroinjektion

• Elektroporation

• Gene gun

• Magnetofektion

Virale Verfahren:

• Adenoassozierter Virus

• Adenovirus

• Lentivirus

  
  

Ca-P-Präzipitation : Zellstress, Nur bei adhärenten Zellen, Stark vom pH Wert abhängig

Biochem. : Endosomaler Untergang —> Toxizität (DNA wird im Endosomen abgebaut), Verwendung serumfreier Medien nötig

Mikroinjektion: Anspruchsvoll, zeitaufwändig und zeitraubend

Gene gun: Fehlende Zellspezifität

Physikalische Verfahren: Zellstress

Virale Verfahren:

Immunogenität, technisch aufwändige Herstellung, hohe Kosten wegen Sicherheitsvorschriften, geringe Kapazität, hohe Variabilität

Zelldichte, DNA Menge, Menge des transfizierten Materials, Konzentration des Transfektionsreagenz

transient:

DNA wird nicht ins Wirtsgenom eingebaut

Stabil:

DNA wird ins Wirtsgenom eingebaut

Fixation, chemical crosslinking, permeabilization, blocking

Immunostaining: Ab incubation, direct/indiret IF detection (primary, second), counterstaining

• unspecific binding of Abs

• Autofluorescence

• Media is not optimal match for Ab

• Washing steps and incubation time

DAPI: 358nm und 461nm

Alexa488: 488nm und 525nm

fm Cherry: 587nm und 610nm

• Lösen der DNA in Calciumchlorid

• Tropfenweise Zugabe von Natriumphosphat

• DNA und Calciumphosphat bilden unlöslichen

Komplex

• Aufnahme in die Zelle durch Endozytose

• Transfektionseffizienz: ca. 60 – 80 %

Transfektion durch Liposomen, Vesikel oder Micellen

o Komplexierung anionischer

Nukleinsäuren an kationischen Lipiden

o Einschluss der DNA

o Fusion mit der Zellmembran

o Endozytose

• Polyethylenimin (PEI)

• Dendrimere: Kern aus tertiären Aminen

  und netzartigen Verzweigungen aus

  primären Aminverbindungen

  -> sphärische Kugel, an deren Hülle positive Aminogruppen sitzen

• In wässriger Lösung positiv geladen

  -> Interaktion mit negativ geladener DNA

• Aufnahme des DNA-Dendrimer-

  Komplex über Endozytose

• Anschwellen und Platzen der

  endosomalen Vesikel -> DNA wird ins Cytosol entlassen

• Weniger toxisch und billiger als Lipofektion

• Effizienz: ca. 50 % bei HEK Zellen

  
  

• Aktive Aufnahme durch Endozytose !

• Endosomaler Untergang à Toxizität !

• Erhöhte Zellteilungsrate erhöht Wahrscheinlichkeit des Einbringens von

DNA in den Zellkern —> Konfluenz maximal 60 – 80% !

• Verwendung serumfreier Medien nötig !

• Toxizität stark zelltypabhängig:

Ca > Lipofektion > Kationische Polymere

• Direkte Injektion der Fremd-DNA in Cytoplasma oder Zellkern

• Transfektion seneszenter (vermehren sich nicht, aber sterben auch nicht) Zellen möglich !

Elektrischer Puls zerstört kurzfristig Membranpotential der Zelle • Membranporen —> Eindringen der Fremd-DNA ins Zytoplasma

Spezielle Form der Elektroporation

• Nukleofection-Reagenz: DNA gelangt direkt in den Zellkern

• Transfektion sich nicht teilender Zellen, z.B. primäre Neurone, mit hoher Effizienz möglich

DNA an Wolfram- oder Goldpartikel adsorbiert

• „Beschuss“ des Gewebes

• „Durchlöchern“ der Zellmembran ermöglicht Eindringen der DNA in die Zelle

• Hohe Transfektionseffizienz —> auch für Zellen mit geringer Teilungsrate geeignet

• Prinzipiell großer Zellstress!

• Virus-vermittelte Transfektion = Transduktion —> für schwer zu transfizierende Zellen (in vivo und in vitro, 95 -100%)

• Ausnutzen der Fähigkeit von Viren, Zellen zu infizieren und DNA in den Zellkern einzuschleusen

Je nach Virus transiente oder stabile Transfektion

Basal Medium Eagle

Dulbecco´s modified Eagle´s medium

o Increased concentration of vitamins and amino acids

o Available with higher or low glucose levels o Composition:

▪ Anorganic salts (NaCl, KCl, MgSO4…)

▪ L-Amino acids (Arg, His,…)

▪ Vitamine (Folic acid, Riboflavin…)

▪ Other components (D-Glucose, Phenolrot, sodium pyruvate)

Roswell Park Memorial Institute (medium)

supplemented with antibiotics and sera

o Serum (latin for Molke/Whey)

o Liquid portion of the blood obtained as a supernatant by centrifuging a blood sample

o Corresponds to blood plasma but without coagulation factors

Heat-inactivation (heating to 56°C for 30 minutes) is done to inactivate complement,

a group of proteins present in sera that are part of the immune response. This is

sometimes important for cells that will be used to prepare or assay viruses, or cells

that are sued in cytotoxicity assays or other systems where complement may have

an unwanted influence.

o Glutamine is an important nitrogen source

Because that is the one that exists in our body, R is only chemically available?

Dipeptid L-Alanyl-L-Glutamin – GlutaMAX

o Buffer! → prevents a fast acidification of the medium due to CO2 production of the

cells

o The higher the concentration of NaHCO3 in the medium, the higher the CO2 value in

the incubator should be (otherwise the medium becomes alkaline).

o Maintaining osmotic pressure and membrane potential

o Sodium, potassium, calcium, magnesium, chloride and phosphate

o Two-valued ions (Mg2+ and Ca2+) serve as cofactors and are important for

adherence and for the formation of cell-cell contacts

o Buffers – to prevent pH fluctuations

o HEPES buffer is used as a replacement for bicarbonate buffers – better at

maintaining physiological pH despite changes in carbon dioxide concentration

Mycoplasmas are parasites for humans, animals and plants

o Mycoplasma is not visible by the “naked eye”

o Indirect signs:

▪ Premature yellow appearance of the medium

▪ Deteriorated cell growth

▪ Cytopathic effects (CPE) – cell damage

▪ Decreased adherence of the cells

Transformation: nicht-virales Einbringen von Fremd-DNA in

kompetente Bakterien

Infektion durch ein Virus oder viralen Vektor

Um die Funktion bestimmter Gene oder Genprodukte zu untersuchen, z.B. als

Modellsystem während der target Validierung oder um Expression eines bestimmten

Gens anzuregen/zu unterdrücken, z.B. gene therapy, oder um rekombinante Proteine

zu produzieren, z.B. tissue plasminogen activator oder TNF-alpha

Primärkultur (Finite Kulturen)

▪ = zeitlich begrenzt kultivierbar

▪ Isolierte Zellen aus Gewebe und Organen, z.B, Neurone

▪ Typische Veränderungen im Verlauf der Kultivierung, typische in vivo-

Eigenschaften

▪ Hoher Arbeits- und Zeitaufwand

Zell-Linien (Permanente Kulturen)

▪ = zeitlich unbegrenzt kultivierbar

▪ Immortalisiert = unsterblich

• Tumorzellen

• Stabil transfizierte Zellen (EBV, SV-40)

• Transfektion mit Telomerase

To preserve cells and tissue components in a “life-like state”

• → prevention of autolysis and putrefaction or cellular decay

• → prevention of loss and diffusion of soluble substances

• → enhancement of rigidity and mechanical strength of the cell

• To retain reactivity to stains and other reagents (antibodies and nucleic acid probes)

Cross-linking

o → create intermolecular bridges and a network of linked

antigenic proteins

o + preservation of cell morphology suited for immunostaining

of membrane proteins

o - reduced target antigenicity → aldehydes (formalin or

formaldehyde, glutaraldehyde)

• Precipitating (denaturing)

o → strong dehydrants and cause the precipitation of cellular

proteins

o + good choice for aldehyde-sensitive epitopes,

permeabilization step might be avoided

o – can remove small soluble molecules and lipids, not

recommended for use with overexpressed fluorescent

proteins highly volatile and flammable → organic solvents

(methanol, acetone, picric acid)

• Powder form of polymerized formaldehyde

• Decomposes in formaldehyde when heated (in aqueous solution)

• Needs to be dissolved in PBS before use

• Methanol is added to formalin prevent precipitation (effect on

permeabilization)

• 4% PFA solution is optimal or fixing tissue and cells

▪ Natural product (Amanita phalloides)

▪ High affinity for (F-) actin

▪ Can be labelled fluorescently (Alexa Fluor® 488)

▪ Advantages over antibodies:

• No need for secondary antibody, denser labelling, low non-specific

binding

Reduction of non-specific binding of antibodies

▪ Blocking buffer: heat-inactivated normal serum from the same species as the

host secondary antibody (alternatives: FCS, BSA, casein protein, non-fat dry

milk, gelatine)

there is no major overlap between the spectras, which is important to

avoid a bleed-through

▪ A Bleed through means that the excitation spectra of two fluorophores

are too close to each other and partially overlap

▪ So some fluorescent signals are detected in multiple channels which leads

false positive signals

▪ Overall the number of possible stainings at the same time is limited