Zellantwort

1. Einfluss auf Funktion zellulärer Proteine -> Änderungen betreffen meistens das Zytoskelett oder den Stoffwechsel und führen zu einer schnellen Änderung des Zellverhaltens

2. Einfluss auf Genexpression -> Änderungen treten verzögert auf

! Oft werden mehrere Antwortarten gleichzeitig ausgelöst !

schnelle Antwort:

1. Rezeption von Glukose im Darm

2. Ausschüttung von GLP1 Hormonen

3. GLP1 öffnet in ß-Zellen der Pankreas Ca2+ Kanäle, was Insulinausschüttung auslöst -> schnelle Antwort

mäßige Antwort:

erhöhter Glukosespiegel fördert den Zitratzyklus

langsame Antwort:

Genexpression von Insulin fördert Verbrauch von Insulin

-> der Rezeptoraktivierung nachgeschaltete Vorgänge von molekularen Wechselwirkungen und von diesen Interaktionen ausgelösten chem. Reaktionen

Voraussetzungen der WW:

• müssen skalierbar sein -> Stärke der Rezeptoraktivierung muss von Signalkaskade weitergegeben werden

• müssen spezifisch sein -> es darf nicht zu Fehlinterpretationen kommen

• müssen reversibel sein -> damit Kaskade nicht dauerhaft aktiv ist, sondern mit zeitlichem Abstand neu auf ein SIgnal reagieren kann

• Verstärkung des Signals durch enzymatische Reaktionen

• Abstimmung und Integration des Signals mit anderen Signalkaskaden

• Aufspaltung des Signals in mehrere zelluläre Antworten

• Verankerung des Signals an einer bestimmten zellulären STrukutr z.B. Zytoskelett

• Modulierung des SIgnals z.B. Stabilität

• über Endozytose wird der Komplex aus Ligand + Rezeptor in endozytischen Vesikeln aus der Membran entfernt -> durch den sinkenden pH Wert löst sich Ligand vom Rezeptor und Komplex wird inaktiv

  -> anschließend entweder Degradierung des Rezeptors oder REcycling zur Membran

• Recycling

• Degradation

• Inaktivierung

• Inaktivierung von Signalfaktoren

• Erzeugung eines Inhibitors (negative Rückkopplung)

Bei längerem Signal wird die Zellantwort auf dieses Reizniveau gesenkt und die Zelle reagiert dann auf relative nicht auf absolute Änderungen

• G-Protein gekoppelte Rezeptor Kinasen (GRKs) und Protein ß-Arrestin spielen wichtige einleitende Rolle

• GRKs phosphorylieren Serin- und Threoninreste im Zytoplasmatischem Teil des Rezeptors

• diese dienen dann als Bindestelle für ß-Arrestin, wodurch Bindung des GPCRs zu G-Protein unterbunden wird

• ß-Arrestin löst Internalisierung des Rezeptors durch Endozytose aus, sodass GPCR von Membran entfernt wird

• frühes Endosom recyclet Rezeptor zurück zu Membran oder gibt ihn an Lysosom zu vollständigem Abbau

• hoch polarisiert -> ändern Oberflächenladung des Poteins deutlich, aber lokal sehr begrenzt

• Änderung der Ladungsdichte füührt zu veränerten elektrostatischen Eigenschaften für WW mit anderen Proteinen

• Bindungen der Phosphoester sehr energiereich

• Phosphorylierungen können als Schalter in Kaskaden genutzt werden

• Phosphorylierungsstatus eines Proteins ist abhängig von Gleichgewicht der KInae/Phosphatase

• viele Kinasen selbst durch Phosphorylierung reguliert -> Kinase-Kaskasen zur Signalamplifikation

Src Homology Domain 2: hochkonservierte Domäne, die phosphoryliertes Tyrosin erkennt und bindet

• wurde zuerst in Src-Kinase entdeckt

• ermöglicht Vorhersage zur Phosphotyrosin-Bindunng eines Proteins

• Phosphotyrosin und PTB-Domäne bzw. SH2-Domäne fungieren als molekulare Schalter, die von Tyrosinkinasen an- und von Tyrosinphosphatasen ausgeschaltet werden können

• va. in Gerüstproteinen wichtig -> kann Aufbau und Zerfall von Proteinkomplexen regulieren

Phosphotyrosin-Bindedomäne: erkennt selektiv phosphoryliertes Tyrosin

• Phosphotyrosin und PTB-Domäne bzw. SH2-Domäne fungieren als molekulare Schalter, die von Tyrosinkinasen an- und von Tyrosinphosphatasen ausgeschaltet werden können

• va. in Gerüstproteinen wichtig -> kann Aufbau und Zerfall von Proteinkomplexen regulieren

modular

• phosphoryliertes Tyrosin ist nicht einzige Erkennungsstelle

• zum Phosphotyrosin flankierende Sequenz ist entscheidend zur Erkennung der Zielstruktur

• weitere proteintasche in der Nähe wechselwirkt mit Seitenketten der zum Tyrosin benachbarten AS

• aus diesen Kombinationen ergeben sich Unterschiede in Bindungskonstatnte, die entscheiden, ob Bndung labil oder stabil

katalytische Kinasedomäne der Src-Kinase

Src Homology Domain 3: hoch konservierte Domäne, die va. mit Prolinreichen Sequenzen des Motifs P-X-X-P interagiert

• Proline sorgen für Strukturänderung und stehen aus Peptidkette heraus, was sich zur Interktion anbietet

• die variablen AS -X-X- sowie die flankierenden Sequenzen sorgen für Erkennungsspezifität

• räumliche Nähe ermöglicht schnelle Reaktion ohne Diffusion

• Verhinderung von Kreuzreaktionen mit anderen Kaskaden durch räumliche Nähe

• Gerüstproteinne (scaffold Proteins) halten Komplex aus Signalfaktoren zusammen

• schnelle + spezifische + reversible + skalierbare + lokalisierte Signaltranduktion und Vermeidung von Kreuzreaktionen mit anderen Kaskaden

• Rezeptor fungiert elbst als Gerüstprotein

• versammelte Signalfaktoren können gemeinsam arbeiten und SIgnal amplifizieren

• Komplexe sind kurzlebig und reaktivierbar

• Wirkung der Kaskade kann räumlih konzentriert & vom Zellinneren getrennt werden

• Ligand: Boss

  -> bindet an Zelloberflächenrezeptor: Sevenless

• Aktiverung der Kaskade

• Sevenless = RTK, die sich autophosphoryliert

• Adapterproteine können binden

• Aktivierung des membranständigen G-Proteins Ras über GDP/GTP-Austausch

• Ras-Protein mit GTP aktiv, molekularer Schalter + intrinsiche GTPase-Aktivität (schaltet sich selbst wieder aus)

• Ras ist zentrales regulatorisches Protein in Kaskaden, die Zellwachstum und Differenzierung regulieren (in vielen Tumoren ras-Gen Mutationen, welche GTPase-Aktivität ausschalten -> dauerhaft aktiv und aggressives Onkogen)

• Ras-Protein mit GTP aktiv, molekularer Schalter + intrinsiche GTPase-Aktivität (schaltet sich selbst wieder aus)

• Ras ist zentrales regulatorisches Protein in Kaskaden, die Zellwachstum und Differenzierung regulieren (in vielen Tumoren ras-Gen Mutationen, welche GTPase-Aktivität ausschalten -> dauerhaft aktiv und aggressives Onkogen)

• Mutationen können zu dominant negativen und konstitutiv aktiven Varianten führen (schalter kaputtt)

• Mutation mit erhöhter Affinität von Ras zu GDP: Ras bleibt inaktiv und bindet Faktoren der weiteren Signalkaskade, die nicht aktiviert werden können

• Mutation mit erhöhter Affinität von Ras zu GTP: Ras bleibt im aktiven Zustand und aktiviert kontinuierlich weitere Kaskade -> unkontrolliertes Wachstum

• 
  

• Funktion von G-Proteinen kann durch Lokalisation ihrer GEFs und GAPs auf bestimmten Ort in der Zelle beschränkt werden

• Export von Cargo aus dem Zellkern wird durch GAP und GEF des regulatorischen G-Proteins Ran lokal kontrolliert

• Ran-GEF ist an Chromatin gebunden und damit strikt im Zellkern lokalisiert -> Ran liegt im Zellkern immer GTP gebunden vor

• Ran-GAP ist außen im Zytoplasma an Kernhülle gebunden -> Ran liegt im Zytoplasma immer GDP gebunden vor

• hat am C-Terminus CAAX-Sequenz (kann auch für andere Proteine genutzt werden)

• Thiol der Aminosäureseitenkette Cystein wird für kovalente Bindung zu Farnesylisoprenoid (lineare C15-Kette aus 3-Isopren-Einheiten) genutzt

• langer Alkylrest ist hochgradig unpolar und lipophil und wird daher in membran eingelagert

• im Zytoplasma viele Signaltransduktionsfaktoren (Stoffwechselenzyme, Komponenten des Zytoskeletts, Zellkern) -> ermöglichen Signal auf Situation der Zelle einzustellen

• aktiviertes Ras rekrutiert durch Bindung Raf-Kinase und aktiviert sie

• Raf (MAPKKK) akiviert durch Phosphorylierung Mek-Kinase (MAPKK)

• Mek aktiviert durch Phosphorylierung MAP-Kinase ERK

• ERK phosphoryliert und aktiviert Zielproteine, di für Zellantwort entscheidend sind und Genexpression beeinflussen

• geht nur im Tierexperiement, da in Zellkultur, die Zellteilungsrate nach oben und die Differenzierungsrate nach unten vefälscht sind

• Aktivierung der G12V-Mutante in Melanozyten (schwarze Pigmentzellen) führt zu Melanome (Hautkrebs) -> diesr ist infiltrativ (erzeugt Metastasen) und ist maligner Tumor (Krebs)

• intrinsische GTPase Aktivität in der Regel sehr langsam, daher Beschleunigung durch Enzyme in Schaltfunktion

-> GTPase activating Proteins: beschleunigen Hydrolyse von gebundenem GTP und sorgen für Inaktivierung des G-Proteins

-> Guanin Nucleotide Exchange Factors: sorgen für Austasuch von GDP zu GTP und damit für Aktivierung des G-Proteins

• interagieren miteinander, um Proteinkomplexe aufzubauen

• können aber auch intramolekular wechselwirken

• in Src-Kinase gibt es 2 regulatorische Tyr, deren Phosphorylierung unterschiedliche Wirkung hat

• pTyr527 interagiert mit SH2 Domäne, wodurch SH3-Domäne mit P-X-X-P Sequenz nahe der Kinasedomäne interagieren kann -> Protein auf sich selbst gefaltet und inaktiv, bei Dephosphorylierung von Tyr527 wird Kinasedomääne frei

• Glykolipide, bei denen 2 Fettsäuren und 1 Phosphat über Glycerin verbunden sind und Phosphat Esterbindung mit Hydroxylgruppe an C1 von Inositol eingeht

• ringförmiges Inositol hat OH-Gruppe an jedem C, können reversibel phosphooryliert werden

• lange Alkylketten, wodurch sie in membran eingebettet sind

• Phosphorylierungsmuster bestimmt in Membran welchen Zellorganells

• Phosphorylierung der Phosphatidylinositolen kann auch für Signaltransduktionsvorgänge genutzt werden (PH-Domäne)

trägt zur Verzweigung bei, wirkt signalverbreiternd

• PI3-Kinase-Kaskade

• Phospholipase Cγ-Kaskade

• Ras/Raf-Kaskade

Protein braucht zur Aktivierung 2 Phosphorylierungen an unterschiedlichen Stellen, die von 2 unterschiedlichen Signalkaskaden vermittelt werden

Beispiel: AKT-Kinase

• sitzt gebunden über PH Domäne an PI(3,4,5)P3 auf Innenseite der Zellmembran

• Ligandenbindung zb. IGF an RTK führt zu weiterer Phosphorylierung von AKT über PDPK1 -> notwendig, aber nicht ausreichend

• aus anderem SIgnalweg muss mTOR-Kinase AKT an anderer Stelle noch phosphorylieren zur AKtivierung von AKT

• AKT integriert PDPK1 und mTOR Signalwege

Beispiel:

• ERK3 wirkt auf Genexpression und Zytoskelett

  • Ausbildung von Aktinhaltigen Filopodien an Zellmembran is abhängig von ERK3 und seiner Kinase-Aktivität

  • Polymersiation von F-Aktin an Zellmembran ist von Bindung von ERK3 an Arp3 abhängig

Verbreiterung des Signals kann sowohl über zelluläre Struktur als auch molekular durch verschiedene Substrate/Interaktionen erfolgen, ebenso Signalintegrationn (zellulrer Prozess oder molekular durch vershiedeene Regulationsstellen)

typische Vertreter von proteinen, die Retention von Signaltransduktionsfaktoren vermitteln:

14-3-3 Proteine

• phospho-Domänen bindende Proteine

• wirken im ZSmspiel mit Kinasen

• binden idR als Dimer

Pleckstrin-Homology-Domäne: Erkennungsdomäne für phosphoryliertes Phosphatidylinositol PI(3,4,5)P3

• va. in Zellmembran lokalisiert, sodass Proteine mit PH-Domänen dort rekrutiert und festgehalten werden können

SH2, PTB, PH

1. Regulation der Reaktionskinetik von Enzymen

2. Regulation der Proteininteraktion durch Zusammenhalten von Multiproteinkomplexen

3. Retention von Signaltransduktionsfaktoren

• Zytoplasma/Membran: G-Protein Rnd3 im aktiven Zustand an Innenseite der Zellmembran gebunden (regeltt Aktinzytoskelett wie Cdc42) -> Phosphrylierung ermöglicht Entfernung von Membran und Bindung von 14-3-3, um Rnd3 im Zytoplama zu halten

• Zytoplasma/Zellkern: Neubildung von Blutgefäßen wird von Hippo-Kaskade unterdrückt, indem wichtiger Transkriptionsfaktorkomplex YAP/TAZ von 14-3-3 im Zytoplasma zurückgehalten wird, Inaktivierung der hippokaskade löst Angiogenese

• Zellkern: Pflanzen reagieren auf Kältestress mit Kaskaden, die 14-3-3 phosphorylieren. Ermöglicht ihnen Eintritt in Zellkern, wo sie Stabilität/Abbau von TF vermitteln und Genexpression ändern

Retention von Proteiinen an einem zellulären Ort muss nicht dauerhaft sein, Proteinene können so kontinuierlich oder kontextabhängig zwiche 2 Orten in einer Zelle wechseln

Proteine mit NLS (nukleäreres Lokalisationssignal) und NES (nukleärers Exportsignal) können zwischen beiden Orten wechseln (z.B. p53, Survivin)

• Nutzung eines Reaktionsproduktes eines Enzyms als Kofaktor, welcher über allosterischen Effekt Aktivität des Enzyms erhöht

• nach anfänglichem langsamen Reaktionsstart erhöht sich durch bindung der ersten reaktionsprodukte Reaktionsgeschwindigkeit deutlich

• ist das meiste Substrat umgesetzt, dauert es länger bis neues Substrat kommt, in der Zwischenzeit löst sich Substrat an allosterischen Bindestellen und Singaltranduktion kommt zum Erliegen

• Je mehr solcher allosterischen Bindestellen für eine positive Rückkopllung existieren, desto schärfer fällt Signalantwort aus -> Alles-oder-Nichts-Antworten: Erst wenn Effektorkonzentration bestimmten Grenzwert erreicht, schnellt Aktivität des Enzyms nach oben und generiert starkes Signal

positive Rückkopplung kann auch oberhalb in der Kaskade greifen

von Kinasen:

• über Signalkaskade wird stromabwärts liegende Kinase durch Phosphorylierung aktiviert

• ohne positive Rückkopplung wird Kinase für einige Zeit Subtrate phosphorylieren, bis sie von phosphatasen dephosphoryliert und inaktiviert wird

• positive Rückkopplung kann erfogen, wenn aktivierte Kinase eigene inaktive Form durch Phosphorylierung aktviieren kann

• einmal angeschaltet sorgt positive Rückkopplung dafür, dass der Dephosphorylierung entegegen gewirkt wird und Sgnal länger aktiv ist

! kommt häufiger vor als positive Rückkopplung

• System wird weniger störungsanfällig

• wenn negative Rückkopplug mit urzer Verzögerung arbeitet, antwortet System stark auf den Reiz, aber Antwort klingt stark ab (deutlich schärfere Signale)

bei vorhandener negativen rückkopplung, wenn Reiz stark zu nimmt, System stark antwortet, aber wieder Antwort stark abklingt

bei langer Verzögerung der negativen Rückkopplung

Notwendigkeit bei sich zeitlich wiederholenden Vorgängen:

• ENtstehung sich wiederholender Gewebe (Rumpfmuskulatur)

• Tag-Nacht-Rhytmus oder circadianer Rhytmus

• CTG-Messung von Wehen

Ca2+

• es gibt Ca2+ Peptiddomänen, die dieses Ion mit hoher Affinität binden, sodass Ca2+ mit seiner hohen Ladungsdichte Konformationsänderungen in Proteinen erzeugen und Signalkaskaden regulieren kann

• Voraussetzung: Zelle muss sensitiv gegenüber Änderungen der Ca2+-Konzentration sein

• nivht absolute, sondern relative Veränderungen in der Konezntration sind wichtig

• beteiligte proteine zb Calmodulin, Calretinin

• um hohe Sensitivität zu ereichen, wird Ca2+ Konzentration im Zytoplasma sehr gering gehalten: 2 unterschiedliche Wege mithilfe von Pumpenproteienen

  -> Einlagerung in intrazellulären Raum des ER und in Mitos (internal stores)

  -> Pumpen in extrazellulären Raum

• über ligandenabhängige Calcium-Kanäle

• über spannnungsabhängige Calciumkanäle, die mit anderen Rezeptoren ww

• Freisetzug aus internen Lagern:

  • GPCRs in Zellmembran

  • UE des aktivierten G-Proteins aktivieren Phospholipase C

  • spaltet Inositolphospholipid PI(4,5)P2, wodurch 2 second messenger gleichzeitig entstehehn: Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) und Diacylglycerin (DAG)

  • IP3 kann frei diffundieren in Zelle und bindet an IP3-abhängiige Ca2+Kanäle in Membran des ER (Ryanodin-Rezeptoren) (gibt auch analoge Rezeptoren in <membran der Mitos

  • DAG rekrutiert Proteinkinase C an Innenseite der Membran und aktiviert gemeinsam mit feigesetzten Ca2+ Ionen

Verwendung von Toxinen oder Inhibitoren, die delektiv eine oder andere Kanalart blockieren

• omega-Conotoxin

• Ryanodin

Ca2+-induzierte Ca2+-Freisetzung

• IP3 und Ryanodinrezeptoren stehehn in enger Beziehung zueinander in ER-Membran und ww bei der Freisetzung von Ca2+

• beide Rezeptoren werden im Rahmen einer positiven Rückkopplung durch niedrige Ca2+ Konzentrationen stimuliert, weitere Ca2+ Ionen freizusetzem

Ca2+ bindende Proteinene als Puffer im Zytosol

• Ca2+ Wellen/transients

• positive Rückkopplung wechselt in zeitlich verzögerte negative Rückkopplung

• Ausschüttung von Ca2+ durch IP3 und Ryanodinrezeptoren wird gehemmt

• bei noch anliegendem Signal kommt es zur Oszillation

• Verteilung von Infos über größeren Bereich

• Abstimmung des Verhaltens von Strukturen

• können auch von Zellen auf andere übertragen werden über gap junctions (dienen der Adhäsion und Zell-Zell-Kommunikation)

• Zellverhalten kann über größere Distanzen koordiniert werden

• mindestens 2 Ca2+ Ionen pro Bindedomäne müssen an Calmodulin gebunden sein -> allosterischer Effekt

• kein Enzym, sondern fungiert als Regulatoreinheit

• CaM-Kinase II liegt in autoinhibitorischer Konformation vor, die durch Bindung von Calmodulin an regulierende Domäne in aktive konformation überführt wird

• aktive Kinase-Domäne phosphoryliert sich zunächst selbst, wodurch Rückkehr in autoinhibitorische Form verhindert wird

• auch ohne Calmodulinbindung bleibt CaMKinase II nun aktiv bis Dephosphorylierung erfolgt

• CaM Kinase II liegt als Ringstruktur vor -> können nacheinander durch Calmodulin aktiviert werden, was stufenweises Signal erzeugt, durch anschließende Phosphorylierung bleibt Kinase länger aktiv, auch wenn Signal schon bgefallen ist -> Kinase kann Gedächtnis des Ca2+ Signals vermitteln

• zeitlicher Abstand zwischen Ca2+ Signalen nimmt entscheidenden Einfluss auf CaMKII-Aktivität:

  • niedrige Frequenz: Autophosphorylierung bleibt nicht stabil

  • hohe frequenz: Autophosphorylierung bleibt bis zum nächsten Signal stabil, allmälich können alle UE aktiviert werden

• CaMKII kann als Schalter fungieren, der zwischen niedriger und hoher stimulierter Ca2+ Stimulation unterscheiden kann und sie in biinäre Entscheidunng überträgt

• über Elektrophysiologie:

  Elektroden aus dünnen Glaskapillaren werden in Zellen gestochen, mit leitfähiger, isotonischer Flüssigkeit gefüllt -> durch diese kapillaren können Substanzen in Zelle gespült werden, welche selektiv Ca2+ Kanäle blockieren oder als Ca2+ Chelatoren wirken

• über Ca2+ abhängige Fluoreszenzfarbstoffe:

  im Ca2+ gebundenen Zustand lassen sie sich über Licht anregen