Aktin Polymerisation

• Aktinpolymerisation verschieden zu untersuchen

• Mit Viskositäts- und Fluoreszenzmessungen wird versucht die Kinetik der Polymerisation von Aktin nachzuweisen oder zumindest zu beobachten, um sie so besser zu verstehen.

• Darüber hinaus ist der Vergleich der Viskosität von Aktingelen verschiedener Konzentrationen des Polymers ein weiteres Ziel

• in allen eukaryotischen Zellen eines der häufigsten Proteine (in allen Zellen, hohe Sequenzhomologie zwischen unterschiedlichen Eukaryoten)

• Konzentration innerhalb der Zelle am Rand am höchsten

• trägt Maßgeblich zur Form der Zelle bei

• zu den wichtigsten Funktionen zählen das Ausbilden von Fortsätzen und intrazelluläre Verlagerungen, sowie in mehrzelligen Organismen die Muskelkontraktion

• Cytoskelett aus Mikrotubulli, Intermediärfilamenten und Mikrofilamenten (Aktin)

• formt stabile (Muskelkontraktion) und labile (Zellbewegung) Strukturen

• wichtig in Form Erythrozyten, Wundheilung und Bewegung von Makrophagen

• Aktinmonomer (G-Aktin) mit gebundenem ATP oder ADP polymerisitert in  Alpha-Helikale Filamente (F-Aktin -> Mikrofilament)

• reguliert durch Aktin-bindende Proteine (Alpha-Actinin, Filamin, Severin und Gelsolin) -> führen zu verschiedner Organisation der Filamente

• F-Aktin wird dynamisch verlängert und verkürzt

• Konstanter Prozess der dynamischen Polymerisation und Dissoziation

• asymmetrischer Aufbau eines Aktin Filaments: Minus- und ein Plus-Ende, die in ihren kinetischen Eigenschaften verschieden sind

• das globuläre Aktinmolekül bindet schneller am Plus-Ende, als am Minus-Ende des Filaments -> schnelleres Wachstum des Polymers am Plus-Ende und langsamere Dissoziationsrate

• ATP gebundenes Aktin bindet schneller als ADP gebundenes

sigmoidaler Anstieg der Länge des Aktin Polymers

1. Lag-Phase

   • Initialisierung der Polymerbildung -> mindestens drei G-Aktin-Monomere verbinden sich zu einem Nucleus

   • Zeit die gebraucht wird, bis sich kritische Anzahl an Monomeren zu Filament zusammen gelagert hat -> kann ein paar Minuten dauern -> -> niedriges Plateau der Zeit-Polymerlängen-Kurve

2. Wachstumsphase

   • Exponentieller Wachstum der Aktinfilamente (wenn sich genug Nuclei gebildet haben)

3. Equilibrium- / Gleichgewichtsphase

   • hohes Plateau bei Erreichen der kritischen Konzentration

   • Assoziation und Dissoziation von Monomeren an das Polymer im Gleichgewicht -> dynamisch-konstanten Länge des Filaments (treadmilling Effekt)

• Anzahl neu bindender Aktinmonumere am Plus Ende gleich Anzahl dissoziierender am Minus-Ende

• kommt dadurch zustande dass ATP-Aktin Monomere eher an das Plusende assoziieren, da dort die Assoziation schneller als die ATP-Hydrolyse abläuft

• Im Gegensatz dazu steht das Minusende, bei dem die Hydrolyse schneller abläuft

• stellt in der Zelle den entscheidenden Kreislauf für die Zellmotilität dar

• 7-Nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol-Aktin

• chemisch modifiziertes G-Aktin-Monomer, das zur fluoreszenzbasierten Untersuchung von Aktin benutzt wird.

• Fluorophor ist dabei an Lys273 des Proteins gebunden (ist auf der Oberfläche des F-Aktin)

• der Farbstoff NBD erhöht die Fluoreszenzaktivität um einen Faktor 2.5

• wurde mit normalem Aktin vermischt (1:9)

• Um die Viskosität zu bestimmen (Maß für die inneren Reibungskräfte in einem bewegten Fluid)

• Geschwindigkeitsmessung einer Kugel, die sich durch die Probenlösung im Röhrchen bewegt -> wenn die Viskosität höher ist, bewegt sich die Kugel langsamer

• strapaziert die Aktin-Gele mechanisch (Filamentorientierung wird geändert und Aktinfilamente brechen)

• Es wirken mehrere Kräfte auf die Kugel:

  Gravitationskraft FG -> beschleunigt die Kugel

  Auftriebskraft FB und die Reibungskraft FR -> bremsen die Kugel

• Es wird angenommen, dass die Aktinlösung ein Newtonsches Fluid ist und die Viskosität deswegen nicht durch Scherung beeinflusst wird. Durch diese Annahme kann für die Reibungskraft das Stokes Gesetz in der Berechnung des Reibungskoeffizienten f verwendet werden:

• Wichtig bei Gravitationskraft auch noch Neigungswinkels der Glaskapillare zu beachten

• Bestimmung der Aktinkonzentration (Messung der optischen Dichte)

• 1. Teilversuch

  • 2 ml einer 5 μM G-Aktin Lösung vorbereitet und 16 Kapillaren befüllt

  • Messung nach 5 min und dann in 10 min Intervallen

  • Magnet zum gleichmäßigen Starten und immer selbe Person nimmt Zeit

  • Winkel der Kapillare sowie die Länge der gemessenen Strecke wurde jeweils angepasst, damit die Geschwindigkeiten per Hand messbar sind

  • berechnung der Viskosität

  • der zu erwartende sigmoidale Verlauf ist in Zeit Viskositätsdiagramm erkennbar -> zu kurz gemessen um steady state zu sehen

• 2. Versuchsteil

  • Viskosität nach 70 Minuten von Aktin-Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen

  • exponentieller Kurvenverlauf

• Bestimmung der Aktinkonzentration (Messung der optischen Dichte)

• Anteil von NBDA 10 % in 5µM Aktin-Lösung

• Fluoreszenz-Messung mit dem Gerät Perkin Elmer LS55 für 10000 Sekunden in einem 0,2 Sekunden-Intervall

• Wachstumsphase (Minute 0 – 100) und steady- state Phase (ab Minute 100) sind deutlich erkennbar

• keine Lag-Phase -> G-Aktin-Moleküle haben bereits stabile Nuclei gebildet