Scaffolds FERTIG

Vermeidung toxischer Reaktionen im Menschen

1. In vitro Test mit isolierten Zellen (Zellkultur)

2. Anwendung am Tiermodell (in vivo präklinische Studien)

3. Klinische Studien am Menschen

a) Organ- oder Organschnittkulturen

b) Zellkulturen

• Zelllinien

• Primäre Zellen

• Entweder ganze Organe oder Organstücke (Organschnittkulturen) verwendet

• Vorteile:

  • Erhaltung der Struktur und Morphologie

  • Erhaltung der Zell-Zellkontakte

  • Erhaltung der ECM

• Probleme/Nachteile:

  • Versorgung mit Nährstoffen nur kurze Zeit möglich (Akuttests)

  • Organschnitte: keine intakten Blutgefäße mehr – Versorgung nur über Diffusion aus Nährmedium; geringe Schnittdichte möglich

• Keine quantitativen Tests möglich!

• Ein Ziel des TE: Generierung künstlicher Organe für Biokompatibilitätstests

• Untersuchung des toxischen Potentiales

• Abschätzung der Freisetzung potentiell schädlicher Stoffe

• Untersuchung der Wechselwirkung Implantatoberfläche-

  Zellen (Adhärenz, Wachstum, (De-)Differenzierung)

• Untersuchung der Mechanismen der Wechselwirkung (Mode of Action Studies)

• Qualitätskontrolle

• Reagieren empfindlich auf toxische Substanzen, leichte Quantifizierung

• Untersuchung spezifischer Zelltypen möglich

• Kontrollierbare Bedingungen => Standardisierte Testsysteme möglich

• Methoden schnell durchführbar

  • Ermöglichen schnelles Screening einer Vielzahl an Materialien

• Ethische Vorteile – keine Anwendung an Tieren/Menschen für viele Fragestellungen notwendig

• Zellen liegen in vivo nicht isoliert vor,

  • Tests mit Zellkulturen spiegeln nicht die komplexen in vivo Bedingungen wider

• Keine Entgiftungsmöglichkeiten => kann zur Überschätzung der Toxizität führen

• (Tw) lösliche Materialien – Osmolalität, pH

• Nachbildung aller Effekte nicht möglich (zB Tumorbildung; komplexe allergische Reaktionen)

• Manche Gewebereaktionen oft erst nach langem Zeitraum manifest => kann kaum nachgestellt werden

• Standardisierte Testverfahren (ISO 10993 – biologische Beurteilung von Medizinprodukten)

  • Standardisiertes Prüfprogram für die Biokompatibilität von Werkstoffen

• Bestehend aus mehreren (20) Teilen

  • Je nach Werkstoff und Produkt müssen nicht alle Iso-Studien durchgeführt werden

• Inkludiert

  • Zelltests (Proliferation, Mutagenizitätstests)

1. Metalle

Rostfreie Stähle, Titan und Ti-Legierungen, Co-Cr-Legierungen, Amalgam, Goldlegierungen

2. Keramische Werkstoffe

Aluminiumoxid, Zirkonoxid, Calciumphosphate, Porzellan

3. Faserverbundwerkstoffe

Faser (zB Kohlenstoff) – lasttragend

Überzogen mit Thermoplastischer Matrix (Schutz)

4. Polymere

a) Künstliche

i. nicht degradierbare Polymere

ii. degradierbare Polymere

b) natürliche Polymere

• Bereits früh in der Medizin eingesetzt (1775 Fixation einer Oberarmknochenfraktur mit Metalldrähten)

• 19.Jhdt: Au, Ag, Pt wegen der geringen Korrosion und guten Verträglichkeit; aber: geringe mechan. Eigenschaften

• 20. Jhdt: Cr-Ni Stähle; dann Cr-Co-Legierungen (ab 1936), Ti (Nachkriegszeit)

• Hauptanwendungsgebiete:

  • Gelenkersatz

  • Fixationselemente

  • Tissue Engineering: als nicht abbaubarer struktureller Träger

Breite Gruppe an anorganischen, nichtmetallischen Werkstoffen:

• Gehört zur Gruppe der Calciumphosphate

  • Ca10(PO4) 6(OH) 2

  • Kommt natürlich vor im mineralischen Anteil von Knochen und Zähnen

  • auch synthetisch hergestellt

• Knochenersatzwerkstoff

  • Verwendung als Werkstoff mit ähnlicher chemischer Zusammensetzung wie natürliche Knochen

• Zementfreie Implantation

• verhindert Bildung von fibrösen Bindegewebe

• Verkürzung der postoperativen Entlastungsphase

• Direkte Lasteinleitung in den Knochen durch substantielle Verbindung Knochen - Implantat

• Seit den 60er Jahren eingesetzt

  • Klinische Einwegartikel

  • Bessere Sterilisierbarkeit

• Hauptanwendungsgebiete in der Medizintechnik

  • Langzeit- und Kurzzeitimplantate

    • künstl. Blutgefäße

    • künstl. Herzklappen

    • Katheter

    • Nahtmaterial

• Kontrollierte therapeutische Systeme (drug delivery systems)

• Biokompatibilität

• Prozessierbarkeit

  • Thermische Stabilität

  • Schmelz-, Lösungsverhalten

• Genügend hohe mechan. Eigenschaften

• Sterilisierbarkeit

• Langzeitstabilität

• Möglichst frei von Additiven wie zB: Weichmacher, Antioxidantien, Stabilisatoren

a) Synthetische Polymere

• Erzeugung durch kontrollierte Polymerisation

  • Nicht degradable Polymere

  • Biodegradable Polymere

    • Abbau im Körper

    • Abbauprodukte sollen in den biol. Kreislauf aufgenommen werden

b) Natürliche Polymere

• Gewinnung aus tierischem oder humanem Material

• Einzelne Polymerketten weisen unterschiedliche Kettenlängen auf (Polymerisationsgrade)

  • Synthetische Polymere besitzen daher keine einheitliche Molekülmasse sondern eine Molekülmassenverteilung

• Copolymerisationen -Verknüpfung von bifunktionellen Verbindungen

  • 2 verschiedenen reaktive Gruppen die miteinander reagieren

  • Können im selben Molekül oder in 2 verschiedenen Molekülen) enthalten sein

• Kontrolle der Einflüsse

Polyethylen

Polyamide (PA)

Polymethylmethacrylat (PMMA) = Plexiglas

Polyurethane (PUR)

Polyethylenterephtalat (PET)

Expandiertes Polytetrafluorethylen (ePTFE) ) = Gore-Tex

Polyetheretherketon (PEEK)

• Einsatz vor allem in Knie- u. Hüftgelenksprothetik (Pfannen)

• Limitierte Lebensdauer (30% Komplikationen nach ~11 Jahren)

• Gute Zellkompatibilität – nicht mutagen, nicht zytotoxisch

• Langsame Degradation im Körper - Anwendung nur als Kurzzeitimplantat (chirurgische Fäden; Bänder)

• Bekannt auch als Plexiglas

• Hohe Härte, hohe Festigkeit und Steifigkeit

• Knochenzement (Zur Fixation von Prothesen)

• Biokompatibilität

  • Monomer ist toxisch; wird langsam freigesetzt (2-6% unpolymerisiert)

  • Allergische Wirkung, Gewebetoxisch

• 4,4‘ Diphenylmethan-Diisocyanat (MDI)

• Künstliche Herzklappen, künstliches Herz, Katheterschläuche, künstlicher Gefäßersatz (Hämokompatibel!)

• Am meisten verbreiteter Polyester in der Medizin

  • Werkstoff für künstl. Blutgefäße, Sehnen- und Bänderersatz, Nahtmaterial

  • Dacron (gewobenes PET)

    • Gefäßimplantate; kaum Zellansiedelung im Inneren

    • Nur für großlumige Gefäße verwendet

• Biokompatibilität

  • Gute Gewebeverträglichkeit in vivo

  • Gebildetes Bindegewebe nicht ident mit Natürlichem

  • Wird langsam von Enzymen degradiert - Verlust der Festigkeit

• „Gore-Tex“

• Orientierte PTFE-Fasern

  • Geordnete Faserstruktur

    • Monodirektional

    • Multidirektional

• Gute klinische Ergebnisse für großlumige Blutgefäße (>6mm)

• Polymer aus 4,4'-difluorobenzophenon und Hydroquinon

• Hohe chemische Beständigkeit

• Mechanische Eigenschaften: durch Kohlefaserverstärkung variierbar (=> Faserverbundstoffe)

• Lasttragende Implantate (z.B. Wirbelsäule)

• Biokompatibilität

  • Gute Zellverträglichkeit, nicht zytotoxisch

  • In vivo gut toleriert

Polylactide (PLA)

Polyglycoside (PGA)

Polyethylenglycol (PEG)

Poly-e-caprolacton (PCL)

• Aliphatische Polyester

• Beispiele der Verwendung in der Medizintechnik

  • Trägerwerkstoffe für drug-delivery systeme (meist microspheres)

• Polymere nur aus Einzelkomponenten oder Co-Polymere (PLGA)

  • Herstellung aus den Cyclischen Diestern durch Ringöffnung bei 140-180°C

• Prinzipiell gut tolerierbar

  • vollständige Degradation

    
    

• Nachteil: pH Senkung durch Degradation

  • Abbauprodukte verursachen pH Senkung

  • Entzündungsreaktionen

• Polyether des 2-wertigen Alkohols Ethandiol

  • Je nach Kettenlänge flüssig oder fest

• Chemisch inertes, wasserlösliches Polymer

  • Gut verarbeitbar

• Biodegradabel

  • Eher langsam

• Kaum toxisch

  • Seit Jahren in Medikamenten, Nahrungsmitteln und Kosmetika verwendet

• Biodegradation

  • Hydrolytisch, autokatalytische Degradation

  • 2-4 Jahre

  • Kann durch Zugabe von Lactiden oder Glycoliden erhöht werden

• Einsatz

  • Trägermaterial für Stammzellen

  • Drug delivery Systemen

Kollagen

Fibrin/Fibrinogen

Gelatine

Alginate

GAGs (Glykosamidglykane)

• wichtiges Faserprotein im Menschen – 25% des Gesamtproteingehaltes

• (Haupt)bestandteil von Knochen, Haut und Sehnen

• Kettenformendes Protein – triple helix

  • 300 nm lang, 1.5 nm Durchmesser

• Fibrilläres Kollagen (Kollagenfasern)

  • Entfernung von Nicht-Kollagen Bestandteilen aus Geweben

  • Vor allem aus Pferdegeweben (equines Kollagen) oder aus Rindern (bovines Kollagen)

• Vor allem tierisches Kollagen kann Immunreaktionen hervorrufen

  • Allergische Reaktionen

  • Abstoßungsreaktionen

  • Meist nicht vom Kollagen ausgehend, sondern von Resten von Zellen bzw. Oligosacchariden (z.B. Gal-Epitop)

• 3D- Matrix für Zellbesiedelung

• Knochendefekten

• Künstliche Gefäßprothesen

• Hautersatz

• Defekten des Urogenitaltraktes

• Ersatz von Nervengewebe

• Applikation in chronischen Wunden, drug-delivery systems

• Denaturiertes bzw. hydrolysiertes Kollagen

• Aus Haut und Knochen von Schweinen oder Rindern

• Quillt in Wasser, löst sich ab etwa 50°C

• Temperaturempfindlich

  • Über 80°C irreversible Hydrolyse (verliert Gelierkraft)

• Natürliches Polymer aus Fibrinogen

• Endprodukt der Blutgerinnung – Fibrin Clot (wissen wir ja schon gsd ;))

• Bereits Anfang des 20 Jhdts. wurden Fibrinogen-hältige Substanzen (Blutplasma) zur Blutstillung verwendet

  • Geringe Festigkeit und Stabilität

• Hochkonzentriertes Fibrinogen, Zusatz von Faktor XIII ermöglichte Routinemäßigen Einsatz seit den 1970ern

• Stillung von Flächenblutungen (Leber, Niere, etc),

• Fibrin clot stellt provisorische Matrix dar für

  • Zellmigration

  • Zelldifferentiation

  • Zellwachstum

• Beinhaltet zusätzlich zu dem strukturgebenden Fibrin viele Wachstumsfaktoren

• Aus Blutplasma

  • Plasma ist der flüssige Anteil vom Blut ohne die Zellen

  • Besteht zu 92% aus Wasser, Rest Mineralstoffe und Proteine

  • Plasmaspenden 3x/2 Wochen

• Aufreinigung über Ethanolfraktionierung

• Vielzahl von Produkten entstehen während des Prozesses

  • Fibrinogen

  • Thrombin

  • Gerinnungsfaktoren (zB Faktor VIII)

• Da er bereits Wachstumsfaktoren enthält kann er auch ohne Zusätze für gewisse Applikationen verwendet werden

  • Fördert Gefäßwachstum

  • Fördert Wundheilung –Verhinderung der Entwicklung von Narbengewebe

• Knochenheilung

  • Kombination mit Tri-Calciumphosphaten

• Natürliche Hydrogel-Matrix

  • 3-dimensionales Hydrogel für Zellbesiedelung (niederere Thrombinkonzentration!)

• Fibrin als Träger zur Verabreichung von bioaktiven Molekülen

• Stickstoffhältiges Polysaccharid

• Hauptbestandteil des Außenskeletts der Gliederfüßer

  und kann auch von Filamentösen Pilzen gewonnen werden

  aber das erwähnt er natürlich nicht

• Herstellung

  • Demineralisation von Garnelenschalen mit HCl

  • Auslösen von Proteinen mit NaOH

  • Wasserunlösliches Chitin bleibt über

  • Chitosan: mit hochkonzentrierter NaOH-behandeltes Chitin

    • Weist hohe Löslichkeit in verdünnten Säuren auf

• Verwendung als Polykation

  • Bildet stabile Hydrogele mit Polyanionen wie Alginat, Heparin, Carboxymethylcellulose

• Polysaccharid

  • Gemisch aus Guluronsäure und Mannuronsäure

  • Abwechselnde Homopolymere

• Von Braunalgen und manchen Bakterien gebildet

  • Strukturgebendes Element der Zellwände

• Nebenprodukt bei Gewinnung von Iod aus Meeresalgen

• Hydrogele

  • Ca-dependent

  • Guluronsäure komplexiert Ca, führt zu Vernetzung

• Als Träger für Zellverkapselungen eingesetzt

• Polysaccharide

  • Aus wiederholenden Disacchariden aufgebaut

  • Bestandteil der ECM

  • Hydrophil – hohe Wasseraufnahme = großes Volumen

• 4 verschiedene Untergruppen

  • Hyaluronsäure

  • Heparin/Heparinsulfat

  • Chondroitinsulfat/Dermatansulfat

  • Keratansulfat

• Verwendung als Scaffolds meist mit Kollagen gemischt

• Vorteile als ECM-ähnlicher Scaffold

  • Bindung vom Wachstumsfaktoren

• Fibröses Protein von Seidenwürmer oder Spinnen produziert

• Klinisch als Nahtmaterial seit Jahrhunderten verwendet

• Natürliches Material besteht aus Fibroin und Sericin

  • Sericin wenig biokompatibel (Entzündung, immunogen) – Entfernung notwendig

• Langsam, kontrollierbar degradabel

• Gute mechanische Eigenschaften

• Gute Kompatibilität mit Stammzellen (Adhäsion, Proliferation, Differentiation)

• Gut prozesierbar in verschiedenen Formen

  • Fäden, Hydrogele, Schwämme

• Pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs (Acetobacter Xylinum)

• 1913 erste Verwendung als Dialysemembran

  • Seither in optimierten Formen/Verarbeitung verwendet

• Wundverband

• Hämostat/Wundverschluß

  • Oxidierte Zellulose

    • Gestrickte Fasern => Membran

    • Beschichtete Zellulosemembran

• Implantate

  • Formgebung bei hohen Temperaturen

• Zellträgermaterialien/Scaffolds zum Aufbau künstlicher Organe

  • Poröse Strukturen

  • Spezielle Fertigungsprozesse

  • Komplexe Strukturen zur Formgebung

1. Faserartige / fibröse Strukturen (medizinische Textilien)

2. Schwammartige Strukturen

3. Computerassistierte, maßgeschneiderte 3-dimensionale Strukturen

Polymere Fasern

• Schmelzspinnen – thermoplastische Polymere

  • Geschmolzenes Polymer wird bei hohen Drücken durch Spinndüse gedrückt und dann zu einer kontinuierlichen Polymerfaser abkühlt

• Lösungs(mittel)spinnen – für temperaturinstabile Polymere

  • Trockenspinnen

    • Polymer in flüchtigem organischem LM durch Spinndüse

    • LM verdampft, Polymer verfestigt sich zu Faser

  • Nassspinnen

    • Polymer in LM durch Spinndüse in ein Fällbad

    • LM diffundiert aus dem Polymer in das Spinnbad und das Filament verfestigt sich

• Elektrospinnen – Hauptanwendung fürs Tissue Engineering

Vliesse

Geflechte

Gewebe

Gestricke

• Zur Herstellung von Nanofasern

• Verfahren bereits in der 1930ern patentiert

• Ab Mitte der 90er für Nanofaserherstellung verwendet

• Verwendete Werkstoffe

  • Polymere – beim TE!

  • Kompositmaterialien

  • Halbleiter

  • Keramiken

• Uniaxiale Dehnung einer viskoelastischen Lösung durch elektromagnetische Kräfte

• Aufbau

  • Spritze: Reservoir für Polymerlösung

  • Kanüle mit flacher Spritze: Auslaß

  • Perfusor: erzeugt gleichmäßige, kontrollierbare Flußrate (0.5-10ml/h) – führt zu Ausbildung eines Tropfens

  • Gleichstrom – Hochspannungsquelle: Formt Tropfen zu Kegel

    • Erreicht Spannung den kritischen Wert, wird kontinuierlicher Strahl am Ende des Kegels gebildet

    • Beschleunigt durch das elektrische Feld

    • Lösungsmittel evaporiert und Strahl erstarrt

• Konduktiver Kollektor: sammelt Faser

• Feststehender Kollektor

  • Ausbildung von Membranen

• Rotierender Kollektor

  • Erzeugt ausgerichtete Fasern

    • Wichtig zB für Migration von Zellen

a. Gas – Schäumungsverfahren (Feststoff)

b. Gefriertrocknung mit oder ohne Gas-Schäumung

c. „Solvent casting and particulate leaching“

d. Thermisch induzierte Phasenseparation

• Gas (CO2) wird als Porogen verwendet

  Ein Porogen ist ein Material, das bei der Herstellung von porösen Materialien eingesetzt wird, um die Bildung von Poren oder Hohlräumen im Endprodukt zu fördern.

• Polymer in Scheiben gepresst, in Hochdruckkammer CO2exponiert

  • Es entsteht eine Polymer/Gaslösung

• Reduktion des Gasdrucks über mehrere Tage

  • Verschiebung der Löslichkeit

  • Gas verlässt Polymerphase und Gasblasen entstehen im Inneren

• Nachteile

  • Kaum vernetzte Poren

  • Teilweise hohe Hitze – keine Verwendung von hitzeinstabilen Werkstoffen

  • Keine beliebigen Formen möglich

• Polymer wird in organischem Lösungsmittel oder Wasser gelöst

• In Form gegossen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren

  • Optional (vor frieren) Schäumung durch mechanische Verfahren oder Einleiten/Erzeugen von Gas

• Gefriertrocknung –Verdampfung von Wasser und/oder Lösungsmittel

  • Hinterlässt poröse Struktur

• Polymer wird in organischem Lösungsmittel gelöst

• Lösung mit dicht gepackten Salzkristallen gemischt

• Polymer wird dann unter Hitze/Druck geformt

• Salzkristalle werden danach herausgewaschen

  • Hinterlassen Poren, Kanäle

  • Ungerichtet; keine Kontrolle über Orientierung

• Größe der Salzkristalle bestimmt Porengröße

• Nur für dünne Membranen geeignet

  • Auswaschen bei dickeren Scaffolds ungenügend

• Polymer in Lösungsmittel mit niedrigem Schmelzpunkt (z.B. Dioxan)

• Addition von geringer Menge Wasser führt zu Phasentrennung

  • Polymer-reiche Phase

  • Polymer-arme Phase

• Abkühlung – Erstarrung in Form

• Vakuum-trocknen zum Verdampfen des Lösungsmittels

• Poröse Strukturen entstehen

a. Stereolithographie

b. Pulver-fusions Druck

c. Solid Free Form (Extrusionsdruck)

• Laser führt zur punktuellen Aushärtung von flüssigen Photopolymeren

• Schicht für Schicht Aushärtung

• Pulver wird Schicht für Schicht ausgehärtet; danach neue Pulverschicht aufgetragen

• z.B. Selektives Lasersintern

• Keramiken, thermoplastische Polymere

• Verhärtung: optisch oder thermisch (Laser), chemisch (Düse)

• Düsenbasierendes Extrusionsverfahren

• Material Schicht für Schicht aufgetragen

• Thermoplastische Polymere, Gele

• Entscheidend: Viskosität (tw höhere Temperaturen notwendig)