Spektroskopie

- durch Absorption von Strahlung im infraroten Bereich werden Molekülschwingungen und –rotationen angeregt

- viele Absorptionsbanden entsprechen Molekülschwingungen, die weitgehend auf die funktionellen Gruppen lokalisiert sind und nicht den Rest des Moleküls erfassen

-> Substanzen können mittels IR-Spektroskopie einfach Verbindungsklassen zugeordnet werden

- Schwingung von zweiatomigen Molekülen kann zufriedenstellend dargestellt werden

- mehratomige Moleküle: keine zwei Atome schwingen unabhängig von den anderen; Vereinfachungen werden angenommen

weitere Bedingung (neben der Resonanzbedingung) für das Auftreten von Signalen:

Schwingung der Bindung muss zu einer periodischen Veränderung des Dipolmomentes führen

Alle Schwingungen in einem Molekül, die symmetrisch zum Symmetriezentrum erfolgen, sind IR-inaktiv, da sich das Dipolmoment nicht ändert!

symmetrische Schwingungen (vollständiger Erhalt der Molekülsymmetrie)

antisymmetrische Schwingungen (Verlust eines oder mehrerer Symmetrieelemente)

entartete Schwingungen (unterschiedliche Schwingungen, die bei gleicher Frequenz absorbieren und nur zu einem Signal führen

insbesondere Schwingungen, die in erster Näherung Einzelbindungen oder funktionellen Gruppen entsprechen, sind nützlich

Gerüstschwingungen eines Moleküls verursachen Banden bei niedriger Energie (< 1500 cm -1); Banden erschweren Zuordnung lokalisierter Banden (Überschneidungen)

z.B. 1. Oberschwingung: wird bei (fast) genau der doppelten Wellenzahl wie die Grundschwingung gefunden

Absorptionsintensitäten der Oberschwingungen nehmen aufgrund der geringeren Übergangswahrscheinlichkeit der NIR-Mehrquantenübergänge mit zunehmender Schwingungsquantenzahl ν stark ab

ein Photon regt zwei Eigenschwingungen simultan an; Frequenz der Kombinationsbande entspricht ca. der Summe oder der Differenz der beiden Grundschwingungen

- Messung in Zellen:

* reine Flüssigkeiten oder Lösungen können in Küvetten (Messzellen) (teilweise zerlegbar) gemessen werden #

* Küvetten bestehen aus zwei NaCl- bzw. KBr-Platten oder einem anderen für IR-Strahlung durchlässigen Material

-> Wasser bzw. wasserhaltige Lösungsmittel dürfen nicht eingesetzt werden (aber: z.B. CaF2 Küvetten können für wasserlösliche Verbindungen eingesetzt werden (nur geeignet bis ca. 8 μm))

* Dicke des Küvettenraums einstellbar

* bei Messung von Lösungen müssen geeignete Lösungsmittel verwendet werden (T ≥ 10%)

- Feststoffe:

* Messung als KBr-Pressling Mischung von < 1 mg Substanz mit ca. 100 mg KBr, Pressen unter hohem Druck -> durchsichtiger Pressling

* Messung als Suspension Partikelgröße des untersuchten Materials muss kleiner als die Wellenlänge des IR-Strahls sein; ansonsten große Verluste an Strahlung durch Streuung

* Messung als Folie

- MIR-Spektroskopie sehr gut geeignet für die Charakterisierung von Substanzen

- Quantifizierung möglich; grundsätzlich gilt das Lambert-Beer
sche Gesetz

- Limitierungen für die Quantifizierung:

* häufig werden Abweichungen vom Lambert-Beer
schen Gesetz gefunden

* häufig überlappende Absorptionssignale aufgrund von überlappenden Spektren

* Korrektur der vom Solvens und Zelle hervorgerufenen Verluste (Streuung, Absorption) ist umständlich (Verwendung der gleichen Zelle für Lösungsmittel und Analytlösung, da verschiedene Zellen aufgrund sehr kurzer Wegstrecken und veränderlicher Zellfenster zumeist unterschiedlich sind)

- Reflexionstechniken insbesondere hilfreich für Proben, die mittels herkömmlicher Probenvorbereitungsmethoden nur schlecht oder nicht präpariert werden können bzw. sehr stark absorbieren

- häufig verwendete Reflexionstechnik: ATR (Attenuated (abgeschwächte) Total Reflection); innere Reflexion (n2 > n1)

-> trotz Totalreflexion, dringt Strahlung auch in das optisch dünnere Medium ein; Eindringtiefe variiert je nach Wellenlänge, Einfallswinkel und Brechungsindices der Materialien

- Probenvorbereitung:

* dünne Folien können als solche gemessen werden

* Schnitzel, Granulate etc.: Folie muss nach Lösen in geeignetem Lösungsmittel gegossen werden bzw. mit einem Folienpresswerkzeug bei erhöhter Temperatur hergestellt werden

- erhaltene IR-Spektren werden mit Referenzspektren verglichen

- Bande bei 966 cm-1 ist charakteristisch für isolierte trans-Doppelbindungen

- in teilweise gehärteten Fetten überwiegend in Positionsisomeren von trans18:1 Fettsäuren zu finden; weniger in cis/trans oder trans/trans Methylengetrennten Fettsäuren (z.B. cis-9, trans-12-18:2)

- Messung z.B. in Kohlenstoffdisulfid

- mittels ATR-FTIR kann das Öl direkt vermessen werden

- Validierungsdaten, insbesondere Präzision, besser als bei der Transmissions-FTIR

- Vermeidung von CS2 führt zur „Glättung“ der Grundlinie

- häufig eingesetzte Methode zur zerstörungsfreien, schnellen Quantifizierung von Inhaltsstoffen in der Qualitätssicherung, z.B. Wareneingangskontrolle, Prozesskontrolle etc.

- Bestimmung von mehreren Komponenten mit einer Messung möglich

- um quantitative Informationen zu erlangen, müssen NIR-Spektroskopie und chemometrische Auswerteverfahren kombiniert werden

- im NIR-Bereich treten Oberschwingungen und Kombinationsschwingungen auf

- NIR-Absorptionsbanden sind in der Regel infolge von vielfältigen Überlappungen breit

- keine Wellenzahl, bei der von einem Substanzgemisch nur eine Komponente absorbiert

- Messung von unverdünnten Flüssigkeiten im Transmissionsmodus (Lambert-Beer Gesetz gilt)

- Messung von Feststoffen (z.B. Pulver, Samen, Körner) mittels diffuser Reflexion (äußere Reflexion, n1 (Luft) < n2 (Probe))

teilweise Verwendung einer (Ulbricht) Integrationskugel; diffus reflektiertes Licht wird durch die Integrationskugel gesammelt und vom Detektor gemessen

- z.B. eingesetzt zur schnellen Wasser-, Protein- und Fettbestimmung

- dominierenden OH-Oberschwingungen des Wassers bei 1940 nm und 1450 nm werden zur Wasserbestimmung genutzt

- AAS gehört zu den atomspektroskopischen Methoden

- atomspektroskopische Methoden beinhalten auch Emissions- und Fluoreszenzmethoden

- Grundlage der AAS ist die Resonanzabsorption in Gasen

gasförmige Atome, die sich im Grundzustand befinden, sind in der Lage, Strahlung ganz bestimmter, für jedes Element charakteristischer Wellenlänge zu absorbieren

- Absorptions-, Emissions- und Fluoreszenzspektren gasförmiger Atome oder Ionen bestehen aus sehr schmalen Linien (0,002 – 0,005 nm)

⇒ resultieren aus Elektronenübergängen der Valenzelektronen

- bei Metallen liegen die Übergänge im Bereich der UV/vis/NIR-Strahlung

- Wolframanode, zylindrische Kathode bestehend aus bzw. überzogen mit dem interessierenden Element

- Glaszylinder gefüllt mit Argon oder Neon unter verringertem Druck

- Quarzglasfenster ist durchlässig für UVLicht

- Anlegen einer Spannung von ca. 300 V

⇒ Ionisierung des Inertgases

- energiereiche gasförmige Kationen schlagen Metallatome aus der Kathodenoberfläche, die dadurch teilweise in den angeregten Zustand übergehen

⇒ Rückkehr in den Grundzustand einhergehend mit der Aussendung von Strahlung

- erwünscht: Atome in der Gasphase

- nicht erwünscht: Moleküle im Grundzustand oder angeregten Zustand (z.B. Oxide), Ionen, angeregte Atome und Radikale

➤ verringern die die Empfindlichkeit und führen zu spektralen Störungen

⇒ Optimierung der Flamme notwendig

- schnelle Atomisierung, Verweilzeit im Strahlengang > 1 sec.

⇒ höhere Empfindlichkeit im Vergleich zur Flamme (Verweilzeit in der Flamme ca. 10-4 sec.)

- Einsatz kleiner Probevolumina möglich

- Wiederholgenauigkeit schlechter als bei der Flammenatomisierung

- einsetzbar für Elemente, die durch Reduktion mit NaBH4 in flüchtige Hydride umgesetzt werden können (z.B. As, Sb, Sn, Se) - ähnlich empfindlich oder sogar um den Faktor 10 - 100 empfindlicher als die Graphitrohrtechnik

- weniger Interferenzen als bei den anderen Atomisierungstechniken

- Überlappung von Atomlinien verschiedener Elemente; selten, da schmale Emissions-/Absorptionslinien Lösung: Wahl einer anderen Linie

- Absorption von Strahlung durch Moleküle (breite Absorptionsbanden)

- Streuung von Strahlung an Partikeln

- spektrale Interferenzen durch Absorption/Streuung an Molekülen/Partikeln bei Graphitrohratomisierung oft größer als bei Flammenatomisierung

- Maßnahmen zur Untergrundkorrektur:

* Untergrundkompensation mit Kontinuumstrahlern (z.B. Deuteriumlampe)

* Zeeman-Untergrundkompensation

- Vorgänge, die zu einer Verminderung der Zahl der gasförmigen Atome im Grundzustand im Absorptionsvolumen führen

- Transport-Interferenzen, durch z.B. unterschiedlich viskose Lösungen (Zerstäuber)

- Verdampfungsinterferenzen

* zu bestimmendes Element wird durch Begleitsubstanzen bei niedrigeren Temperaturen verflüchtigt (Graphitrohr)

* Bildung geringflüchtiger Verbindungen, z.B. Ca in Ggw. von Phosphat oder Sulfat

- Gasphaseninterferenzen

* Dissoziationsgleichgewichte (zwischen Verbindung und freien Atomen)

* Anregungsgleichgewichte (zwischen Atomen im Grund- und angeregtem Zustand)

* Ionisationsgleichgewichte (zwischen Atomen und Ionen)

- Probe muss in wässriger Form (zwingend erforderlich bei Flammenatomisierung) in die Atomisierungseinheit eingebracht werden

⇒ Aufschlüsse

- §64 LFGB L 00.00-19/1 Druckaufschluss

* Aufschluss mit 65% Salpetersäure in druckstabilen Gefäßen (z.B. aus PTFE mit Quarzeinsätzen) (Nassveraschung)

* geschlossenes Gefäß mit Probe und HNO3 z.B. bei 300 ºC erhitzen

* für Messung auf definiertes Volumen einstellen

* anstelle von Druckaufschlüssen mit konventioneller Heizung können Druckaufschlüsse auch mittels Mikrowellenheizung erfolgen (bis zu 1000 W)

- Graphitrohrtechnik: Blut, Urin etc. können auch direkt gemessen werden; aber: Matrixeffekte sind besonders zu berücksichtigen

- ICP-MS: Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry

- Plasma: elektrisch leitende gasförmige Mischung mit signifikanten Konzentrationen an Kationen und Elektronen

- verschiedene Energiequellen sind für die Erzeugung des Plasmas möglich

- induktiv gekoppeltes Plasma:

* Elektronen treten mit dem fluktuierenden Magnetfeld in Wechselwirkung

* Kollision der Elektronen mit Argon führt zu weiterer Ionisierung; Widerstand gegen die Bewegung führt zur Erhitzung (6000 – 10000 K)

- Probe wird in Form eines Aerosols (Zerstäuber) durch das mittlere Rohr mit Argon als Hilfsgas zugeführt

- feste Proben können z.B. in einem elektrothermischen Verdampfer (Graphitrohr) verdampft werden und als Dampf in das Plasma eingebracht werden; ebenfalls möglich: Laserablation

-Ionen werden über ein Interface zum Massenselektor (Quadrupol, s. MS) geleitet, gemäß m/z getrennt und detektiert

- zur Reduzierung von Interferenzen durch molekulare Ionen z.B. ArO+ , Ar2 + und ArCl+ kann eine Kollisionszelle zwischengeschaltet werden

- empfindlicher als AAS (Nachweisgrenzen zwischen 0,2 und 0,001 μg/l)

- Multielementmethode (bis zu 70 Elemente in < 5 min möglich (!))

- höhere Anschaffungs- und Betriebskosten

- empfindlich gegenüber hohen Salzfrachten (> 0,2%, max. 0,5%)

- Erzeugung von Ionen aus anorganischen oder organischen Substanzen, Trennung nach dem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) sowie qualitative und quantitative Erfassung der getrennten Ione

- besteht eine Verbindung nicht nur aus monoisotopischen Elementen, ist ein Isotopenmuster im Spektrum erkennbar

- Isotopenmuster geben Informationen über ein unbekanntes Molekül

Quasimolekülionen werden beim Einsatz schonender Ionisationsverfahren anstelle des „echten“ Molekülions M+. detektiert (z.B. ESI, CI etc.)

- Ionisationstechnik richtet sich nach den Analyten, eventuell vorhergehenden chromatographischen Trennmethoden sowie den gewünschten Informationen (z.B. Molekülion, Fragmente etc.)

- Electron impact ionization:

Ionisierung von Neutralteilchen durch Beschuss mit energiereichen Elektronen

- zumeist gekoppelt mit gaschromatographischer Trennung

- „harte“ Ionisationstechnik; häufig nur Molekülionen geringer Intensität, Bildung charakteristischer, gut interpretierbarer Fragmente; teilweise komplette Fragmentierung

- es existieren sehr gute Datenbanken für EI-Massenspektren (70 eV)

Voraussetzung: Analyt muss ohne thermische Zersetzung verdampfen oder sublimieren (die meisten nieder- oder auch mittelpolaren Substanzen)

nicht-verdampfbare Analyten (z.B. Kohlenhydrate, Aminosäuren etc.) können derivatisiert werden (GC-MS) Molekülmassenlimitierungen: normalerweise 800 - 1000 u, teilweise bis 1300 u (Beschränkungen auch durch den Analysator, z.B. ältere Quadrupole)

- Pyrolyse-MS: Analyten werden willentlich in einem aufgesetzten Pyrolysator bei hoher Temperatur zersetzt; Bruchstücke werden analysiert; Einsatz z.B. zur Polymercharakterisierung

- 12 – 15 eV sind häufig ausreichend für die Ionisierung

- Interaktion mit einem 70 eV Elektron führt zum Verlust des Elektrons, für welches die Ionisierungsenergie am geringsten ist - Elektronen werden bevorzugt aus freien Elektronenpaaren oder πBindungen abgegeben

- nach der Ionisierung hat M+. häufig genug „Restenergie“ (ca. 1 eV), um zu fragmentieren

- für organische Moleküle gibt es eine Vielzahl an typischen Fragmentierungswegen, die für die Strukturaufklärung unbekannter Analyte ausgenutzt werden können

- ganz wenige Beispiele, demonstriert an 2-Hexanon:

- EI produziert sehr viele Fragmente; Massenpeak ist häufig nicht erkennbar

- CI produziert weniger Fragmente als EI („sanfte“ Ionisation)

- Molekülmasse aus Quasimolekülionen wie MH+ oder [M+NH4]+ zu ermitteln (bei positiver CI)

- Grundlage der CI sind Ion-Molekül-Reaktionen in der Gasphase (bimolekulare Prozesse); Ionen werden aus einem Reaktandgas, z.B. Methan oder Ammoniak, erzeugt

M + [BH]+ -> [M+H]+ + B (Protonentransfer, [BH]+ z.B. = CH5 +))

M + X+-> [M+X]+ (elektrophile Addition, X+ z.B. = NH4 +)

- moderne EI-Quellen können häufig auch für CI benutzt werden (Turbopumpen sind häufig limitierender Faktor)

- sanfte Ionisationstechnik zur Überführung von Ionen aus der flüssigen Phase in die Gasphase

- zumeist gekoppelt mit flüssigchromatographischen Trennmethoden - Ionisierung erfolgt bei Atmosphärendruck

- mehrfach geladene Ionen treten häufig bei hochmolekularen Analyten auf

⇒ Trennung von hochmolekularen Substanzen in vielen Massenanalysatoren

1) direkte Kopplung der HPLC mit der Massenspektrometrie

2) Ionisierung von sehr polaren bzw. ionischen als auch von makromolekularen Substanzen

1) Bildung eines geladenen Aerosols

2) drastische Reduktion der Tröpfchengröße durch Verdampfen des Lösungsmittels

3) Coulomb-Explosion durch kritisches Oberfläche-zu-Ladung-Verhältnis

Mikrotröpfchen unterliegen nicht der Coulomb-Explosion, sondern stoßen kleinere Mikrotröpfchen aus verjüngtem Ende ab

Modell 1) Charged Residue Model, CRM

(Modell des geladenen Rückstands):

- Verlust aller Lösungsmittelmoleküle der Mikrotröpfchen; „Tröpfchen“ enthalten schließlich nur noch ein Analyt-Molekül; Ladungen (z.B. Protonen) dieses „Tröpfchens“ werden auf den Analyten übertragen

Modell 2) Ion Evaporation Model, IEM (Ionenverdampfung)

- direkte Verdampfung von desolvatisierten Ionen von der Oberfläche hoch geladener Mikrotröpfchen

Weiterleitung der desolvatisierenden Ionen auf abgewinkelten Bahnen (z-Spray, Micromass)); weniger Kontamination durch nicht flüchtige Bestandteile des HPLC-Eluenten

- Verwendung, wenn Analyt bereits ionisch ist (in Lösung) oder durch Protonierung bzw. Deprotonierung oder Adduktbildung mit Kationen bzw. Anionen in Lösung ionisiert werden kann

- Bildung von Quasimolekülionen und mehrfach geladenen Ionen (z.B. bei Proteinen)

- Bildung nur weniger Fragmente, da sanfte Ionisationstechnik

- Atmosphärendruck-Chemische Ionisation

- pneumatischer Zerstäuber; beheizbare Sprühkammer; Nadelelektrode (Corona-Nadel)

-aktive Erzeugung von Ionen aus Neutralteilchen; Einsatz auch bei mittel- oder (teilweise) sogar wenig polaren Analyten möglich - gebildet werden u.a. [M+H]+ bzw. [M-H]- Ionen, aber auch Addukte mit Lösungsmittelbestandteilen und Fragmente

- Atmosphärendruck-Photoionisation; für wenig polare/unpolare Analyten

- ungeladene Teilchen in der Gasphase (Lösungsmittel, Dopant und Analyt)

- chemische Ionisierung der Analyten durch Dopant über Photo-Ionisierung

- insbesondere von Interesse für die Untersuchung von Biopolymeren (Proteine (Proteinanalyse, Peptidsequenzierung), Oligonucleotide, Kohlenhydrate) sowie als bildgebende Methode (MALDI-Imaging)

- in eine absorbierende Matrix eingelagerte Analyten werden mit Hilfe gepulster Laserstrahlung desorbiert und ionisiert

- Matrix dient als Vermittler der Energieabsorption

- äußerst sanfte Ionisationstechnik; kaum Fragmentierung, daher z.B. Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen möglich

- falls notwendig, z.B. für Sequenzierung, kann allerdings Fragmentierung durch höhere Laserintensität (in source decay/post source decay) oder durch stoßaktivierten Zerfall (CID) hervorgerufen werden

- Laser: überwiegend Laser, die im UV-Wellenlängenbereich arbeiten; auch, aber seltener, IR-Laser

- Pulse von UV-Lasern (z.B. Stickstofflaser) im Bereich von 3- 10 ns (Akkumulation von mehreren Einzelschussspektren)

- durch Laserpuls erfolgt Desorption von Ionen und Neutralteilchen in das Vakuum

- Ionenerzeugung bei der MALDI noch nicht abschließend geklärt

- Desorption präformierter Ionen? Photoionisation? ...

- es werden positive und negative Ionen erzeugt; Extraktion der Ionen je nach Polarität der Beschleunigungsspannung

- Matrix von entscheidender Rolle für die Ionisierung

- Standardmatrices: z.B. Cyano4-hydroxyzimtsäure für Peptide oder 2,5-Dihydroxybenzoesäure für Oligosaccharide

- Spektren dominiert von Molekülionen und/oder Quasimolekülionen (Protonierung, Kationisierung etc.); fast ausschließlich einfach geladene Ionen

->TOF-Massenanalysator!

- außerdem im Spektrum zu erkennen sind Matrix-Cluster-Ionen [Man+H]+

- Stabilität der Flugbahn eines Ions mit def. m/z in einem Quadrupol wird durch die angelegte Wechselspannung V sowie das U/V-Verhältnis bestimmt

- für jede Kombination an Geräteeinstellungen können nur Ionen in einem engen m/z Bereich den Quadrupol passieren

Full Scan:

der gesamte m/z-Bereich wird nacheinander durchgelassen

-> zur Identifizierung von Verbindungen mit Hilfe der Massenspektren

-> je größer der zu scannende Bereich, desto weniger Scans können pro Peak durchgeführt werden

Single Ion Monitoring (SIM): nur Ionen mit einem bestimmten m/z können passieren

-> nur eine (oder wenige) m/z werden gemessen; Analysator kann sich längere Zeit für eine bestimmte Masse nehmen (kein Zeitverlust zum Scannen diagnostisch unbrauchbarer m/z-Bereiche)

-> Empfindlichkeit kann um den Faktor 10-100 erhöht werden

-> zur „Sicherstellung der Identität“ werden häufig mind. zwei Ionen und deren Verhältnisse ermittelt

- Tandem-Massenspektrometrie (2. MS-Analyse eines massenselektierten Ions) wird eingesetzt

* um Strukturinformationen über eine Verbindung zu erhalten (Erzeugung und Detektion charakteristischer Fragmente auch bei Einsatz weicher Ionisationstechniken, z.B. ESI)

* zur selektiven und empfindlichen Quantifizierung

Wird bei RF-Quadrupolen (- Hexapolen- und -Oktapolen) die Gleichspannung U = 0 gesetzt, lassen diese den gesamten Ionenstrom passieren

-> Nutzung zum Ionentransfer und als Stoßzellen. Einsatz von RF-Multipolen auch als lineare Ionenfallen möglich.

Durch Kollision mit Stoßgasen kommt es zur Fragmentierung (collision induced fragmentation (CID)) zuvor selektierter Ionen.

Produkt-Ionen-Scan oder Tochterionen-Scan

- zwei hyperbolisch geformte Elektroden (Endkappen) und eine Ringelektrode

- Endkappen sind miteinander elektronisch verbunden; zwischen Endkappen und Ringelektrode liegen Gleichstrom- und RF-Potentiale an; Erzeugung stabiler Bahnen für Ionen mit bestimmten m/z

- Ionen des gesamten m/z-Bereichs werden der Falle zugeführt und in ihr gespeichert; dann werden Ionen durch Veränderung der RF-Spannung in der Reihenfolge ansteigender m/z-Werte ausgeworfen

- „tandem-in-time“: nur ein MS-Analysator wird eingesetzt; Ionenselektion, Fragmentierung und Produkt-Ionen-Analyse laufen nicht räumlich, sondern zeitlich voneinander getrennt ab

- Isolierung einer Ionenspezies durch Entfernung aller anderen Ionen aus der Falle - Stoßfragmentierung dieser Ionenspezies

- Massenanalyse der entstandenen Fragmente

- theoretisch n-fache Wiederholung möglich; begrenzt durch Häufigkeit des ursprünglich vorhandenen Vorläufer-Ions

- realistisch: MS3 oder MS4

- engl. Time-of-Flight (TOF)-Mass Analyzer

- Trennung der Ionen aufgrund unterschiedlicher Geschwindigkeiten nach Passage der Beschleunigungsspannung -> Trennung innerhalb der feldfreien Driftstrecke

- Ionen mit kleineren m/z erreichen Detektor früher als solche mit hohen m/z

- ideal für MALDI (gepulste Ionisationsmethode, einfach geladene Ionen von Polymeren erfordern Trennung von hohen m/z)

- kinetische Energie von z.B. laserdesorbierten Ionen mit identischen m/z nicht ganz gleich ⇒ schlechtere Massenauflösung

-> Korrektur von Energieunschärfen durch Reflektron (Reflektor)

- Reflektor („Bremsfeld“) besteht aus einer Reihe ringförmiger Elektroden mit zunehmendem Elektrodenpotential

- Ionen dringen in den Reflektor ein -> Verlust der kinetischen Energie -> Beschleunigung in entgegengesetzte Richtung

- Ionen gleicher m/z aber höherer Startenergie dringen tiefer in das Reflektron ein als solche geringerer Startenergie -> liegt der Detektor im Fokussierungspunkt, erreichen Ionen mit gleichen m/z aber unterschiedlicher Startenergie diesen gleichzeitig

- Reflektor-TOF-Analysatoren haben eine extrem hohe Massengenauigkeit

- notwendig, um kontinuierliche Ionisationsmethoden mit TOFAnalysatoren zu koppeln

- kontinuierlich erzeugte Ionen werden mit Hilfe eines orthogonal ausgerichteten, gepulsten elektrischen Feldes als Ionenpakete in den TOFAnalysator überführt

Ionenpaket der Länge lp wird durch einen scharfen Puls (10 - 100 ns) orthogonal aus der ursprünglichen Bewegungsrichtung abgelenkt; es folgt eine Beschleunigung Richtung Driftregion des TOFAnalysators

Fokussierung zu einem nahezu parallelen Ionenstrahl

- kommerzielle Vermarktung seit 2005

- hochauflösendes Massenspektrometer, welches z.B. im Bereich Proteomics, aber zur empfindlichen Quantifizierung eingesetzt wird

- abweichend von anderen Massenspektrometern beruht die Detektion auf „image current detection“ (Bildstromdetektion)

- nähern sich positive Ionen einem Metallstück, bilden sich aufgrund der elektrostatischen Anziehung negative Ladungen auf der Oberfläche (Bildladung; image current); entfernen sich die positiven Ionen von dem Metallstück, nimmt die negative Ladung auf der Oberfläche ab Bewegung der Ionen wird erkannt durch Beobachtung des „Bildstroms“ (Zu- und Abnahme der Bildladung)

- Ionen werden tangential eingeschossen;

- Ionen bewegen sich um die zentrale Elektrode sowie axial; periodische Vor- und Rückwärtsbewegung der Ionen wird ausgenutzt

- Frequenz der harmonischen, axialen Schwingungen hängt von m/z ab: - Image currents werden in der Zeitdomäne aufgezeichnet und mittels Fourier-Transformation in die Frequenzdomäne umgewandelt, woraus m/z ermittelt wird

- Stabilisotopenverdünnungsanalyse ist bei LC-MS und GC-MS Analysen bei richtiger Durchführung ideal, um

* Analytverluste bei der Probenaufreinigung

* matrixinduzierte Ionensuppression (insbesondere bei LC-ESI-MS) zu kompensieren

- stabilisotopenmarkierte (2H, 13C, 15N) Analoga der Analyten werden als interne Standardsubstanzen verwendet

- diese sollen sich während der gesamten Analyse wie die Analyten verhalten und können durch die massenspektrometrische Detektion von den Analyten unterschieden werden

1) vergleichbare Extrahierbarkeit der isotopologen Verbindungen 2) stabile und vollständige Markierung der Standardsubstanzen 3) möglichst geringe spektrale Überlappung

4) Minimierung/Vermeidung von Isotopeneffekten

Um 2) – 4) zu erfüllen, müssen verschiedene Synthesestrategien für die internen Standardsubstanzen eingesetzt werden.

- Zugabe der Standardsubstanz zu der zu analysierenden Probe gefolgt von einer Extraktion

-> nach Extraktion muss Verhältnis Analyt/Standardsubstanz dem wahren Verhältnis entsprechen

- dies ist nicht gegeben, wenn:

* der Analyt in spezielle Matrixkompartimente eingeschlossen ist (z.B. intakte Zellen) und aus diesen nicht, unvollständig oder zeitlich verzögert freigesetzt wird

* der Analyt an spezielle Matrixkomponenten adsorbiert ist

- Minimierung o.g. Effekte durch ausreichende Zerkleinerung des Probenmaterials und ausreichend lange Zeit zur Äquilibrierung

- Vorsicht: Analyten können bei zu langer Äquilibrierung aus Vorläuferverbindungen etc. freigesetzt werden

- häufigste Markierungen: 2H, 13C, 15N

- [2H]-markierte Verbindungen

* werden häufig durch Protium-Deuterium-Austausch unter extremen Bedingungen synthetisiert

* 2H-markierte Verbindungen können u.U. wieder ausgetauscht werden

* 2H-Isotope dürfen sich nicht an aziden Positionen im Molekül befinden

-auch aromatische [2H]-Markierungen können

- je nach Aufarbeitung im Analysengang

- problematisch sein, da diese evtl. durch elektrophile Substitution unter stark sauren Bedingungen ausgetauscht werden

- Bindungen zwischen C und C bzw. C und N sehr schwer zu spalten

- 13C und 15N markierte Verbindungen häufig besser geeignet, aber (oft) auch aufwendiger (und teurer) in der Synthese

- massenspektrometrische Unterscheidung des Analyten und der isotopologen Standardsubstanz erfordert geringe spektrale Überlappung

- Analyt tritt natürlicherweise nicht nur mit der nominellen Masse ma auf, sondern auch als ma+1, ma+2 etc.

-> Anzahl Markierungen erhöhen

- wenn kein Molekülion erhalten wird, darf Markierung nicht mit einem Neutralteilchen abgespalten werden

- wenn Fragmente genutzt werden, dürfen die der Standardsubstanz nicht die gleichen m/z aufweisen wie (andere) Fragmente des Analyten

- Isotopeneffekte: unterschiedliches chemisches oder physikalisches Verhalten von Isotopologen

- insbesondere von Interesse bei der Chromatographie

- insbesondere zu vermeiden bei Anwendung von Ionisationsmethoden, die empfindlich gegenüber Matrixeinflüssen sind (z.B. ESI)

- Isotopeneffekte bei Markierungen mit 2H deutlich stärker ausgeprägt als bei Markierungen mit 13C und 15N