Erklären sie den Ablauf der Phenol-Extraktion.
In welcher Phase befinden sich die Proteine
Zellaufschluss
Phenol: baut H2 Brücken zu den Proteinen
Extraktionspuffer
Fällungspuffer: Proteine fallen aus
High phenol: proteins + cont.
low phenol: other cell compounds
Woraus besteht der Extraktionspuffer bei der Phenol-Extraktion und was bringen die einzelnen Bestandteile?
Zucker: Osmotikum
Tris: pH Puffer
EDTA: chelatiert zweiwertige Ionen und Protease-Inhibitor
KCl: Salz, Ionenstärke
ß-Mercaptoethanol: Zellaufschluss
pH 8: pH Wert für die Zellen
Woraus besteht ein Polyacrylamid-Gel?
Acrylamid
Bis-Acrylamid (Quervernetzung)
APS
TEMED
Was ist das grundlegend Prinzip der IEF (isoelektrischen Fokussierung)?
IPG strips: immobilizied pH gradient
Proteine bewegen sich auf dem elektrischen Feld bis sie eine neutrale Nettoladung haben (isoelektrischer Punkt)
Woraus besteht die Rehydrationslösung der IEF?
urea + thiourea: Denaturierung von Proteinen
CHAPS: zwitterionisches Detergent
Bromophenol blue: blaues Färbemittel
DTT: reduziert S-Brücken
IPG-Puffer
DeStreak: erhöht Fokussierung
Was ist das Prinzip der BN SDS-PAGE?
BN trennt Proteinkomplexe nativ auf
SDS-PAGE trennt die Untereinheiten auf
Wozu benutzt man Delta2D?
Identifizierung von Unterschieden im Vergleich der Gele
Wozu benutzt man DIGE (differential gel electrophoresis)?
Identifizierung der Unterschiede durch scannen bei verschiedenen Wellenlängen
Welche Probleme gibt es mit DIGE?
Reproduzierbarkeit
Protein-Quantifizierung
Was ist das Prinzip von CyDye DIGE?
Labeln der ε-Aminogruppe von Lysin
Massen und Ladungen sind angepasst
1 CyDye pro Protein
hohe Sensitivität
Was sind die Absorptions- und Emissions-Eigenschaften der CyDyes?
Cy2: 488 nm 520 nm
Cy3: 532 nm 580 nm
Cy5: 633 nm 670 nm
Wie häufig kommt Lysin in Proteinen vor?
ca. jede 20. Aminosäure ist Lysin
Wie werden Proben für MS vorbereitet?
Dehydrieren durch Acetonitril
DTT zur Reduzierung der S-Brücken der Cysteine
IAA blockt Schwefelgruppen der Cysteine
Umpuffern
Trypsin-Behandlung
Wofür steht ESI-Q-ToF-MS?
ESI: electrospray ionisation
Q: quadrupol
ToF: time of flight
MS: mass spectrometry
Wofür braucht man Quadrupole?
Fokussierung der Ionen
Selektion der Vorläufer-Ionen (Precursor ion)
Kollisionszelle (Fragmentierung von Peptiden)
Was ist ein ToF?
lineares Flugrohr
kann Reflektor haben um die Flugzeit zu erhöhen
time of flight ist proportional zu m/z
Was ist der Unterschied zwischen dem MS-Modus und MS/MS-Modus?
MS-Modus: alle ionisierten Peptide werden vom Detektor erfasst
MS/MS-Modus: ein Peptid wird selektiert, fragmentiert und die Fragment-Ionen werden erfasst
Welche Fragmentierungsmethoden gibt es?
Collision induced dissociation (CID)
post source decay (PSD)
electron transfer dissociation (ETD)
proton transfer reaction (PTR)
Was ist das Besondere an der Mistel?
Was für Verbindungen findet man?
keine Gene für Mitochondrien (kein NDH Komplex)
cytotoxische Verbindungen: Lectine, Viscotoxine
klebriges Viscin
Wie ist der Lebenszyklus von der Mistel aufgebaut?
Jahr: Keimung und Haustorien wachsen; Verbindung zum Xylem
Jahr: Bildung von Primärblättern
Jahr: Erste Verzweigungen der Äste
Jahr: weiteres vegetatives Wachstum, Bildung erster Blüten und Beeren
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