Autosomal rezessiver Erbgang
- Merkmalsausprägung bei Homozygotie
- Betroffene haben nicht betroffe Eltern
- Tritt bei Konsanguinität (=Verwandtschaft Cousin und Cousine 2. Grades oder enger) häufiger auf
- Nach Geburt eines betroffenen Kindes besteht für jedes weitere Kind ein Risiko von 25% betroffen zu sein
Beispiele autosomal rezesive Erbgänge
o Stoffwechselerkrankungen durch Enzymdefekte (häufig)
o Albinismus
o Mukoviszidose
o Taubstummheit
o Sichelzellenanämie
Autosomal dominanter Erbgang
- Merkmalsausprägung bei Heterozygotie
- Betroffene Person hat mind. 1 betroffenen Nachkommen
- Vererbung unabhängig vom Geschlecht
- Nachkommen haben 50% Risiko die Krankheit zu erben
- Besonderheiten, welche Stammbaum Analysen erschweren können:
o Kodominanz: 2 Allele prägen unabhängig je 1 Merkmal aus
o Penetranzschwankungen: Wahrscheinlichkeit mit der ein Merkmal manifestiert
o Expressivität: Ausmaß der phänotypischen Ausprägung eines Gens
o Neumutationen => meist bei schweren Ausprägungen mit unauffälligen Eltern
o Phänokopie: Gleicher Phänotyp wie bei Erbkrankheit, aber nicht durch genetische Einflüsse entstanden
o Pleiotropie: ein Gen bewirkt mehrere verschiedene Symptome
o Spätmanifestation
o Keimzellmosaik
Beispiele autosomal dominante Erbgänge
o Neurofibromatose
o Marfan-Syndrom
o Osteogenesis Imperfecta Typ 1
o Achnodroplasie
o Chorea Huntington
Welche Besonderheiten können die Analyse Autosomal dominanter Erbgänge erschweren?
X-Chromosomal dominant
- Beide Geschlechter betroffen => mehr betroffene Frauen als Männer
- Heterozygote Frauen oft leichter betroffen (Lyon-Effekt)
- Nachkommen einer betroffenen Frau: 50% Risiko unabhängig vom Geschlecht
Nachkommen eines betroffenen Mannes: alle Töchter betroffen, alle Söhne gesund
X-Chromosomal rezessiver Erbgang
- Gen mit rezessiver Wirkung
- Merkmalsausprägung bei homozygoter Frau, hemizygotem Mann
- Mehr betroffene Männer als Frauen
- Transmission betroffener Großväter zu betroffenem Enkel über nicht betroffene Frau (Konduktorin)
- Keine Transmission von Vätern auf Söhne
Beispiele X-Chromosomal rezessiver Erbgang
o Rot-Grün-Farbsinnstörung
o Bluterkrankheit
o Muskeldystrophie Typ Duchenne und Becker
Autosomal dominante Krankheiten: Neurofibromatose
Autosomal dominant
- Inzidenz 1:3.000 => eine der häufigsten Erbkrankheiten
- Vollständige Penetranz, aber variable Expressivität
- Ursache: Mutationen im NF1-Gen
o Tumorsupressorgen => Herunterregulation der Ras-Aktivität (Rasopathie)
o Nonsene Mutationen => Leseraster verschiebend => vorzeitiges STOPP
o Splicing Mutationen
o Deletion des gesamten Gens
ð Wirkung = Verlust der Genaktivität (loss-of-function)
Braucht bei Mutation auf einem Gen nur noch eine somatische Mutation für komplette Inaktivierung
Autosomal dominante Krankheiten: Wachstumsstörungen
- Mutationen im FGFR3-Gen
- Fibroblasten-Wachstumsfaktor 3
- Schlüsselrolle bei Embryogenese (Zellteilung, Migration, Differenzierung)
- Missense-Mutationen
- Durch Mutation wird Rezeptor unabhängig von Liganden Bindung aktiviert
=> Wirkung: Gain-of-function
Autosomal dominante Krankheiten: Osteogenesis Imperfecta congenita (letalis)
- Glasknochen
- 95% Letalität bei Geburt
- Mutation in COL1A1-Gen
- Missense Mutationen in COL1A1
- Beeinflussen Ausbildung der Prokollagen-Tripel-Helix
ð Wirkung: dominant-negativ
X-Chromosomal Dominante Krankheiten: Rett-Syndrom
- Tritt praktisch nur bei Mädchen auf => männliche Mutationsträger sterben meist vor Geburt
- Mutationen im MECP2-Gen (Metyl-CpG-Bindeprotein-2)
Lyon-Hypothese
- Frau (XX), Mann (XY)
- Gleiche Gendosis X-chromosomaler Gene
- Inaktivierung eines der beiden Gene = funktionelle Gendosiskompensation
- Ab Blastocystenstadium
- Zufällig maternales oder paternales X betroffen
- Inaktivierung wird bei allen sich daraus bildenden Tochterzellen beibehalten
X-Chromosomal rezessive Krankheiten: Rot-Grün-Blindheit
- Unterschiedliche Ausprägungen und Schweregrade bekannt
- Fehlen von bestimmten Bestandteilen (Zapfen) in Netzhaut
- 8% der Männer sind rot-grün-blind
- Hohe Frequenz in Bevölkerung => 1:150 Frauen
X-Chromosomal rezessive Krankheiten: X-Chromosomale Muskeldystrophie
- Häufigste monogene Erkrankung bei männlichen Individuen
- 2 Typen
o Duchenne
- Lebenserwartung 15 bis 20 Jahre
ð Frameshift Deletionen
o Becker => seltener
§ Späterer Beginn und wesentlich langsamere Progression, sonst gleiches Verhaltensmuster der Dystrophie
§ Werden erst ab 20/25 auffällig, Lebenserwartung ca. 60 Jahre
ð Non-Frameshift Deletionen
- Allelische Heterogenität => verursacht durch Mutationen im gleichen Gen
- Dystrophin-Gen: Xp
- Funktion:
o Verankerung von Aktin-Filamenten an Membranprotein des Sarkolems
o Bei Verlust der Funktion => Degeneration des Muskelgewebes
- Ursachen und Labordiagnostik:
o Bei 1/3 der Betroffenen => Neumutation
o 60% Deletion 1 oder mehrerer Exons => Primäre Diagnostik mit MLPA
o 6% ähnlich große Duplikationen
o 34% Punktmutationen
o Muskelbiopsie
o Nachweis von Deletionen/Duplikationen im Duchenne-Becker Gen
X-Chromosomal rezessive Krankheiten: Martin-Bell-Syndrom = Fragiles-X-Syndrom
- 2. häufigste Ursache für geistige Behinderung
o Prävalenz: 1:4000
- Frauen falls überhaupt leichter betroffen
- Fragile Stelle an langem Arm des X-Chromosoms => Brüchigkeit
- FMRP bindet an mRNA
o Regulation von Translation von Genprodukten die an Synapsen-Entwicklung beteiligt
o Wichtig für synaptische Plastizität => Gedächtnis und lernen
o Vollmutation = Methylierung des Promotors => Transkription verhindert = loss-of-function
- Läuft in meisten Fällen über Prämutation ab
o Ab bestimmter Anzahl der CGG-Repeats können diese nicht mehr stabil vererbt werden => Expansion zu nächster Generation
o Wenn bestimmte Anzahl überschritten ist => Methylierung
o Je kleiner Prämutation desto geringer Risiko für Vollmutation in nächster Generation
- Diagnostik:
o Fragmentanalyse
o MLPA
Dynamische Mutation
- Instabilität einer Sequenz, sowohl in Keimbahn als auch somatisch
- Repeatexpansionen verändern Struktur, Funktion oder Expression von Proteinen
- Verschiedene Trinukleotid-Repeat-Erkrankungen
- Prämutation mit intermediärer Repeatlänge => expandiert zur Vollmutation
- Antizipation = Erkrankung verstärkt sich von Generation zu Generation durch immer größer werdenden Repeat
- Hemmung der Transkription
- Translation + Aggregation der Proteine zu Inclusion bodies (veränderte Proteine die sich zusammenlagern)
Dynamische Mutationen: Chorea Huntington
- Manifestationsgipfel 35 -45 Jahre
- Ursache: Expansion eines CAG-Repeats in Exon 1 im Huntington Gen => gain-of-function
- Klassischer dominanter Erbgang
- Keine anderen Mutationen außer Repeatverlängerung bekannt
Störung verschiedener Signalwege
Dynamische Mutationen: Fiedreich Ataxie
- Autosomal rezessiv = keine Antizipation
- Heterozygotenfrequenz: 1:85
- GAA-repeat Expansion in Exon 1 von FRDA
- Inhibition der transkriptionellen Elongation
- Reduzierte Frataxin Spiegel
Autosomal rezessive Krankheiten: Mukoviszidose/Zystische Fibrose (CF)
- Funktionsstörung exokriner Drüsen
- Häufigste angeborene, frühletale Stoffwechselerkrankung im kaukasischen Raum
- Relativ häufig: 1/2500 Lebendgeborenen
- Kann von einer Heterozygotenrate von 4% ausgegangen werden
- Folge ist Elektrolyttransportstörung
- Protein das für zelluläre Permiabilität von Chlorid verantwortlich ist wird nicht oder funktionsuntüchtig gebildet, oder erreicht nicht die Zellwand
- Zeigt sich in zwei Ausprägungen:
o Pulmonale Manifestation => Mukoviszidose
o Gastrointestinale Manifestation => zystische Fibrose
§ Kann teilweise durch externe Gabe von Verdauungsenzymen behandelt werden
CFTR-Gen (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator)
- Kodiert für Chlorid Kanal = Anionen-Kanal mit niedriger Leitfähigkeit
- Aktivität wird über Wechselwirkung mit anderen Proteinen gesteuert => ATP Bindung reguliert öffnen und schließen
- 230kb großes Gen
- 27 kodierende Exons
- CFTR mRNA setzt sich aus Transkript voller Länge + alternativ geslicten Teilstücken in welchen Exons fehlen zusammen
- Weniger als 25% der Proteine erreichen Zielort in Apikalmembran
- Über 1000 Mutationen identifiziert
- In Mitteleuropa am häufigsten (70-75%) p.(Phe508del)
o Reifung gestört => kein bis kaum CFTR in Zellmembran
- Keine bevorzugte Lokalisation
- Kein bevorzugter Mutationstyp
ð Mutationen führen alle zur Funktionslosigkeit
CFTR = Membranglykoprotein: 2 membranüberspannende + 3 zytosolische Domänen
Diagnostische Methoden CF
- Iontophoretischer Schweißtest
o Na+ und Cl- Ionen > 60mmol/l
o Bei gesunden Menschen < 40mmol/l
§ Gen codiert für Chloridkanal
§ Bei gesunden Meschen hat es Aufgabe Chlorid an Schweißdrüsen zu reabsorbieren
- Nasenpotentialdiffenenzmessung
o Messung über Nasenschleimhaut allerdings eher schwierig
- Rektumsbiopsie
o Testen auf Chloridsekretion
- CFTR-Mutationsanalyse
o Erfassung von 95-98% der Mutationen in Abhängigkeit von der angewandten Methode
§ Codierende und flankierende Bereiche werden überprüft
§ Gibt allerdings auch intronische Mutationen oder in regulatorischen Bereichen die eine Rolle spielen
Populationsgenetik
Häufigkeit einer Mutation innerhalb eines Gebietes/Landes
Beispiel CF:
- In Deutschland macht Deletion von Phenol an Position 508 (p.(Phe508del)) mit 72% die häufigste Mutation
- In anderen nordischen Ländern ist die Rate ähnlich hoch
- Je weiter südlicher man kommt desto mehr nimmt diese Häufigkeit ab
- In der Türkei liegt sie nur noch bei 18,9%
Locus Heterogenität
= gleicher klinischer Phänotyp resultiert aus Mutationen verschiedener Loci
- Bsp: Autosomal rezessive Taubheit
- Komplementation = Kinder von betroffenen Eltern haben normalen Phänotyp da Eltern Mutation in unterschiedlichen Genen tragen
Allelische Heterogenität
= Verschiedene Mutationen innerhalb eines Genes führt zu Patienten mit unterschiedlichen klinischen Phänotypen
- Bsp: geschlechtsspezifische Sonderform der Mukoviszidose
- CFTR Restfunktion: 15-30%
- Klasse 4 Mutationen: Leitfähigkeitsstörungen
Klasse 5 Mutationen: reduzierte Synthese
Klinische Heterogenität
= Gleiche Mutation innerhalb eines Gens resultieren in zwei oder mehreren Phänotypen (Modifier)
- Identische Mutationen im Dysferin Gen:
o Miyoshi-Myophathie
o Dysferin-assoziierte Gliedergürtelmuskeldystrophie
ð Modifizierende Faktoren im Genom => beeinflussen wie sich Mutation auswirkt
Basismethoden der DNA-Analyse
-Isolierung genomischer DNA/RNA aus Zellen/Geweben
-In-vitro Synthese (PCR)
-Screening Verfahren
-Nachweis bekannter Mutationen
-Nachweis von genomischen Deletionen und Duplikationen
-DNA Sequenzierung
Isolierung genomischer DNA/RNA aus Zellen/Geweben
o Mittlerweile auch automatisiert möglich
o Zellen aufschließen
o Nukleinsäuren von Proteinen trennen und aufreinigen
In Puffer lösen
In-vitro Synthese (PCR)
o Hier mit Touch-down Protokoll um alle Reaktionen bei gleicher Temperaturen laufen lassen zu können
§ Deshalb +DMISO, Betaine = erleichtern Primerbindung und Denaturierung
Screening Verfahren
o DNA-Konformationsänderungen:
-Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)
-Temperature Gradient Gel Elektrophoresis (TGGE)
-Denat. Gradient Gel Elektrophoresis (DGGE)
-Denat. High Pressure Liquid Chromatography (dHPLC)
-Heteroduplex Analyse
Heteroduplex Analyse
-Identifikation von Mutationen und Polymorphismen aufgrund von Heteroduplexausbildung zwischen „mismatched“ Nukleotiden während PCR
-Sehr spezifisch
Nachweis bekannter Mutationen
o Page zum Nachweis der Mutation p.(Phe508del) (Siehe Versuch 1)
o Restriktionsverdau
o Allelspezifische PCR
o Sanger Sequenzierung
- Einbau von Fluoreszenz markierten Dedesoxynukleotiden
- Dort stoppt Synthetisierung des neuen Strangs
- Auftrennung über Gel
Sanger-Sequenzierung
- Dort stoppt Synthese des neuen Stranges
+
-
Gezielte Sequenzierung von PCR Amplikons
Nur gezielte Gene/Amplicons
Sequenzierung beider Allele (genomische Sequenzierung)
Sehr aufwendig für größere/mehrere Gene
Zyklische Reaktion (Taq-Polymerase)
Typischerweise bis 400bps forward und reverse (Mutation nur bestätigt, wenn in beide Richtungen dargestellt werden kann)
Sequenzvarianten im Bereich der Primerbindestellen verhindern primäre Amplifikation und so Sequenzierung des Allels
Automatisierbar, gut etabliert
Heute Primär für bekannte Mutationen mit gezielter Fragestellung bzw. Bestätigung NGS Befunden
Für jedes neue Gen müssen neue Primer synthetisiert werden
Kein zurückgreifen auf Exomdaten möglich
Bei CF überlegen, da nur ein Gen (passt auf eine Platte) => Ergebnis nach max. 48 h
Nachweis von genomischen Deletionen und Duplikationen
o Verlust bzw. Verdopplung einzelner Exons oder größerer Abschnitte
o 1 -3 % aller CF-Allele betroffen
§ Kann bei Patienten über PCR nachgewiesen werden => wenn Primer nicht mehr binden, welche bei Eltern noch binden
o Duplex-PCR zum Nachweis einer Deletion
§ 21kb große Deletion von Exon 2 und 3 ~ 1% aller deutschen CF Patienten
§ Große genomische Deletionen < 5% der bekannten Mutationen
§ Primerpaar für Exon 1 und 4
· Es entsteht nur eine Bande wenn Deletion von Exon 2 und 3 vorliegt, da PCR Produkt sonst zu groß => nicht ordentlich amplifizierbar
Nachweis von genomischen Deletionen und Duplikationen: MLPA
- Nachweis Deletionen oder Duplikationen einzelner Gene oder Exons
- Hybridisierung und Amplifikation Ligationsabhäniger Sonden
· Beide Proben hybridisieren an angrenzenden Nukleotiden der Zielsequenz
· Probes werden nach Bindung durch hitzestabile Ligase verbunden
· Alle Ligationsprodukte haben identische Sequenzen an ihren Enden (X und Y)
· Werden mit universellem Primerpaar amplifiziert
· An 5‘-Primer Fluoreszenz markiert => sichtbar machen der ligierten Fragmente
o Jede Sonde besitzt individuelle Länge und kann so im Gel identifiziert werden
Vorteile MLPA
o Methode zum Nachweis von Copy Number Varianten von bis zu 45 Sequenzen in einzigem Ansatz
o Quantitativ: unterscheidet auch zwischen Homo- und Heterozygoter Deletion
o Minimale DNA-Mengen erforderlich (20ng)
o Relativ schnell
o Detektion chromosomaler Aneuploidien: Trisomie 13, 18, 21 und von X und Y
o Detektion von Deletionen und Duplikationen kompletter Gene o. chromosomaler Regionen
o Detektion von Deletionen und Duplikationen einzelner Exons
o SNP/Mutations Detektion
§ Nachweis bekannter Sequenzen
o Quantifizierung der Methylierungsmuster
Versuch 1:
- Frau mit Bruder welcher an CF erkrankt ist
- Partner in dessen Familie kein CF bekannt ist
=> Risiko für die Kinder
Diagnose-Verfahren; wer wird getestet:
1. Testen des Bruders
2. Wenn Mutationen gefunden, Ratsuchende auf diese getestet
3. Wenn diese Anlageträgerin ist, testen des Partners
- Wenn nicht beide Mutationen Identifiziert werden konnten, testen der Eltern der Ratsuchenden
Nachweis d. häufigsten Mutation p.(Phe508del) (DeltaF508)
- Liegt in Exon 10
- Mittels PCR und anschließender Page
Vorgehen V1:
1. Amplifikation des CFTR Exon 10 mittels PCR und fluoreszenzmarkierten Primern
2. Fragmentanalyse mittels Kapillarseqenzierer
3. Auswertung der Fragmentanalyse
Versuch 2:
- 5 Patienten mit Verdachtsdiagnose CF (A1-A5)
- Bei Patient A3,A3,A4 auf einem Allel Mutation p.(Phe508del) nachgewiesen
- Restliche Mutationen unbekannt
Vorgehen V2:
1. PCR des Exon 11 des CFTR-Gens
2. Testgel der PCR
3. Nachweis der Mutation über Restriktionsverdau
a. An Stelle p.(Gly551Asp) wird HincII-Schnittstelle zerstört und Schnittstelle für Mbol eingefügt
4. Genomische Sequenzanalyse des PCR Produktes
a. Aufreinigung des PCR-Produktes: Abtrennen überschüssiger Nukleotide und Primer
b. Sequenzierung nach Sanger
i. Sequenzierreaktion
ii. Aufreinigen der Seqenzierreaktion
iii. Sequenzieren mittels Kapillarsequenzierer
c. Auswertung der Sequenzalayse mittels Chromas und BLAST
Mutationsnomenklatur
- Alle Sequenzveränderungen müssen im Bezug auf Referenzsequenz angegeben werden
- Angabe der „Accession-Nummer“ der Referenzsequenz
- Nukleotid +1 = A des ATG-Translationstartcodon
- g = genomische Sequenz
- c = cDNA-Sequenz
- p = Proteinsequenz
ð die angegebene Position bezieht sich dabei immer auf die Referenzsequenz
Veränderungen auf DNA-Ebene
Veränderungen im Exon:
- Substitutionen = >
o c.93T>C = Austausch der Base T zu C an Nukleotidposition 93
- Deletionen = del
o Bereich von mehreren Basen „_“
o c.76_78delACT Nukleotide von Position 76 bis 78 sind deletiert, es handelt sich um ACT
- Duplikation = dup
o Muster siehe Deletionen
- Insertion = ins
Veränderungen im Intron
- c.188+1G>T (IVS2+1G>T): G zu T Austausch zwischen Nukleotid 188 und 189 an Nukleotid +1 in Intron 2
Veränderungen auf Proteinebene:
- Substitutionen
o Missense Mutation: 3 Buchstabencode der betroffenen Aminosäure, Position, neue AS
§ p.(Leu35Cys)
o Nonsene (Stop-)Mutationen = *
§ p.(Trp105*)
- Deletion = del
o p.(Trp105del)
o p.(Cys28_Met30dup): Duplikation der AS Cys an Position 28 bis Met an Position 30
o p.(Lys29_Met30insGlnSerLys): Insertion der AS Gln, Ser und Lys zwischen AS an Position 29 und 30
- Frameshift-Mutationen = fs
o Erste durch Frameshift angegebene AS angegeben * nach wie vielen AS Stoppcodon folgt
p.(Trp105Serfs*15) (nach 14 neuen AS folgt Stop-Codon
Versuch 3
- Drei Patienten mit gesicherter Mukoviszidose
- Nach vollständiger Sequenzierung nur Mutation p.(Phe508del) heterozygot nachgewiesen
- Zweite Mutation bis heute nicht identifiziert
Versuchsdurchführung:
1. Denaturierung und Hybridisierung der MLPA-Sonden
2. Ligation der Sondenfragmente
3. PCR-Reaktion
4. Fragmentanalye
5. Auswertung mittels Software (Siehe Balkenmuster)
Zuletzt geändertvor 9 Monaten
