1. Bei einem Patienten wurde aufgrund der Symptome das DiGeorge-Syndrom (DGS) festgestellt. Eine Untersuchung mittels FISH zeigte allerdings, dass keine Deletion an 22q11.2 vorliegt. Die anschließende Sequenzierung des TBX1-Gens erbrachte, dass keine Mutation in den Exons vorliegt. Was könnte bei diesem Patienten das DGS verursachen?
-Mutation von TBX1 außerhalb des Exons
-Splice site Mutationen
-Mutationen am Promotor
-Chromosomenabberationen
-Deletionen
-Duplikationen
-Inversionen
-Tetraploidie
-Mutationen in anderen Entwicklungsgenen der 3. und 4. Schlundtaschen
2. Beim DiGeorge-Syndrom (DGS) ist die Entwicklung der dritten und vierten Kiemenbogentasche gestört. Welche Strukturen gehen daraus hervor und welche Symptome des DGS folgen daraus?
Strukturen:
3. Schlundtasche: Thymus und Untere Nebenschilddrüse
4. Schlundtasche: Obere Nebenschilddrüse
Symptome (nicht lernen):
CATCH Phänotyp + Lernschwierigkeiten
4. Das DiGeorge-Syndrom kann durch einen Elternteil vererbt werden. Eine scheinbar gesunde Mutter mit einer Deletion auf 22q11.2 kann diese auf ihr Kind vererben, welches schwere Symptome (z.B. Fallot-Tetralogie) zeigt. Wie sieht es bei eineiigen Zwillingen mit derselben Deletion aus? Haben diese den gleichen Schweregrad des Syndroms?
Nein, nicht gleich.
-Epigenetik
-Stochastische Effekte
-Umweltfaktoren
5. Welche Formen von Mutationen gibt es? Wie können sich diese auswirken?
-Keimbahn vs. Somatische
-Chromosomenmutationen
-Numerische
-Strukturelle (Inversionen/duplikationen/…)
-Nukleotidveränderungen
-nonsense usw.
6. Erklären Sie das Prinzip der gerichteten Mutagenese mittels PCR. Warum verwenden wir eine Pfu-Ultra II–Polymerase statt einer normalen Taq-Polymerase? Nach der Mutagenese-PCR wird ein DpnI-Verdau durchgeführt. Erklären Sie warum!
PCR:
-Mutagenisierte Primer
-PCR
-DPN1-Verdau
PFu-Ultra 2-Polymerase:
-Proof reading funktion
-geringere Fehlerrate
DPn1 methylierungssensitives Enzym
7. Weshalb wird bei der Immunfärbung ein sekundärer Antikörper verwendet, anstatt die Primärantikörper direkt mit Fluorophoren zu koppeln?
-Signalverstärkung
8. Welche Normalisierungs-/Analyseverfahren gibt es für qPCRs? Was sind die jeweiligen Vor- und Nachteile?
deltadelta Ct:
Nachteil: Effizienz der Primer muss berücksichtigt werden
Vorteil: Spart Arbeit, Geld und Material
Standardkurve:
Vorteil: simple Berechnung, genauer als delta delta Ct
Nachteil: kosten s.o.
Interkalierende Farbstoffe
geringe spezifität (schmelzkurve)
vielseitig anwendbar
Günstig
FRET-Sonden
hohe spezifität
sondenspezifisch
teuer
9. Für die Transformation von Bakterien verwenden wir chemisch kompetente E. coli – Bakterien, welche durch Hitzeschock Plasmide aufnehmen können. Erklären Sie das Prinzip dieser Methode. Nach dem Hitzeschock werden die Bakterien vor dem Ausplattieren für 45 min in LB-Medium ohne Antibiotikum bei 37°C inkubiert. Wozu dient dieser Schritt? Welche anderen Methoden gibt es, um DNA in Bakterien zu bringen?
-CA2+ => Ladung von DNA => Hitzeschock => Plasmid in DNA
-Membran und DNA stoßen sich ab
0°C: Ca2+ bindet an negative Membran & DNA (“neutralisieren”)
42 °C: Porenbildung -> DNA wird aufgenommen
-weitere Möglichkeiten
-Elektroporation
-Der Schritt:
Den Bakterien erstmal Zeit geben die Ampicillinresistenz auszubilden
10. Um Plasmide aus Bakterien zu isolieren wird eine Minipräparation durchgeführt. Erklären Sie worauf diese Methode beruht. Wieso darf nach Zugabe von P2 nicht gevortext werden?
-P1 (RNAse + EDTA)
-EDTA nimmt ionen, die wichtig für DNAsen sind. Die würden unsere Plasmide zwerschneiden
-RNAse, weil wir keine RNA haben wollen
-P2
-Aufbrechen der Zellwand, aber nur teilweise und vorsichtig
-DNA soll an der wand hängen bleiben
-Grund: milde lyse
Abzentrifugieren: Bakterielle DNA soll an der Wand hängenbleiben und wird wegzentrifugiert
Plasmid DNA bleibt übrig für uns
Mit ethanol entziehen wir das wasser
=> ausfällen der DNA als kaliumsalz
11. Um die Qualität von Plasmiden zu untersuchen kann eine Gelelektrophorese durchgeführt werden. Welche Agarosekonzentration sollten Sie verwenden? Welche Banden erwarten Sie und was sagen diese Banden über die Qualität des Plasmids aus? Wie können Sie die Konzentration von Plasmiden bestimmen? Was ist der Ratio-Wert? Was ist hierbei der Unterschied zu RNA?
-1,5% (zwischen 1 und 2%) (kleine Produkte mehr %, große weniger %)
-oben bande: open circle
-mitte linear (die schlecht)
Unten supercoiled
12. Zur Transfektion der Zellen wurde JetPrime verwendet. Auf welchem Prinzip beruht diese Methode? Welche anderen Möglichkeiten gibt es, Plasmide in eukaryotische Zellen zu
bringen?
Katalytisches Polymer
bindet neg. DNA -> Neutralisation
Elektroporation, Beads (mechanisch)
13. Die Zellen, die transfiziert wurden, werden mit Formaldehyd fixiert. Was passiert hierbei?
Nach der Fixierung werden die Zellen mit 0,5% TritonX/PBS behandelt. Wozu dient dieser Schritt?
formaldehyd: Zellen binden an Glasoberfläche
TritonX: macht Löcher in Zellen
14. Die Waschschritte im immunzytologischen Teil des Versuches dienen der Reduzierung von
unspezifischen Signalen. Wodurch kann die Stringenz dieser Schritte erhöht werden?
-Länge der Waschschritte (Länger Waschen)
-Anzahl der Waschschritte erhöhen
-Temperatur der Waschlösung
-Reduzierung der Inonen- konzentration
15. In den Antikörperlösungen wird Goat-Serum zugesetzt. Wozu dient dies, und welche anderen Stoffe könnten hierfür noch verwendet werden?
-Absättigung der unspezifischen Bindestellen
-andere Normal-Seren
-nie Serum aus dem Organismus aus dem der primäre antikörper stammt
16. Was ist DAPI und was wird damit angefärbt?
DAPI
-Fluoreszenzfarbstoff für DNA
-> Kern
-Bindet RNA
-nicht membrangängig
Hoechst 33342
-Membrangängig
-Bindet DNA
(17. Für die Immuncytologie wurden HeLa-Zellen verwendet. Um was für Zellen handelt es sich?
Weshalb werden sie häufig genutzt und welche Alternativen gibt es?)
Gewebeprobe eines Cervixtumors von Henrietta Lacks
HeLas haben kleineren Kern und grosses Zytoplasma
alternativ: HEK-Zellen (human embryonic kidney)
18. Wozu erfolgt vor der meDIP ein RNase-Verdau?
-Methylcytosin liegt auch in RNA vor
-Wollen wir aber nicht haben in unseren Analysen
19. Vor der Immunopräzipitation in der meDIP wird die DNA 10 min bei 95°C und dann 10 min auf Eis inkubiert. Wozu dienen diese Schritte?
-Denaturierung der Doppelstrang DNA
-Eis, dass nicht wieder zu Doppelstrang wird
20. Was ist Protein A/G und wozu wird es benutzt?
präzipiert den Antikörper, der an Methylcytosin bindet
-binden Antikörper dran, der an Methylcytosin bindet
-über Beads werden Antikörper über Zentrifugation herausgeholt, da hängt Methylcytosin dran
21. Wozu nutzt man Levamisol in der Whole Mount?
-blockiert unspezifische endogene alkalische Phosphatase
=> macht spezifischer
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